检测大肠菌群和大肠埃希氏菌的新方法

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 检测大肠菌群和大肠埃希氏菌的新方法 由于传统方法在检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌需要48小时左右,且操作过程复杂,难以 掌握。现介绍一种快速简便的检测方法，根据生活饮用水国家卫生标准（GB/T 5750-2006）中 推荐的固定底物技术酶底物法可购买到市售化产品 IDEXX 公司的 Colilert?试剂[1]。用于检测 100ml 水样，只需手工操作 2分钟，即可在 24 小时内同时定量检测出大肠菌群和大肠埃希氏菌。 此方法大大的减少了工作量，避免了使用多管法的逐级稀释带来的操作误差；也避免了使用滤 膜法时肉眼读数的人为误差，所以其假阳性率和假阴性率都比传统方法低。由于 24 小时内就得 到结果，可以很好的用于突发事件应急。 1. 背景： 目前我国对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生学评价，检测的指标为大肠菌群 和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群（耐热大肠菌群），以这些指标作为粪便污染的指示菌。采用的标 准检测方法为膜过滤法和多管发酵法。但这两种方法检测时间相对较长，需 48—72 小时，需验 证试验，试验步骤较为繁琐，所以不能对水的卫生学状况做出快速评价。因此，采用快速简便 的检测方法十分必要。固定地物技术酶底物法可以较好的弥补传统方法的不足。 2. 原理： 固定底物技术酶底物法（Defined Substrate Technology）采用大肠菌群细菌能产生β -半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解 ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside） 使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解 MUG （4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长 366nm 紫外光下产生荧光的原 理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。固定底物技术酶底物法可以选用国标中 推荐粉状培养基（IDEXX 公司的 Coiliert 试剂）来进行简便的操作；无需确认试验；固定底物 技术酶底物法检测时间短，只需 24 小时即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的 MPN 值。 3. 试剂和设备： 3.1 试剂：采用固定底物技术酶底物法市售化的 MMO-MUG（Minimum Media ONPG-MUG）培养基 —Colilert 试剂[1]。 3.2 耗材：取样瓶或使用灭菌的玻璃；51 孔定量盘或 97 孔定量盘； 注：51 孔定量盘可在无需稀释的情况下检测 1—200 个目标菌/100ml 水样；97 孔定量盘可在无 需稀释的情况下检测 1—2419 个目标菌/100ml 水样。 3.3 设备：定量程控封口机；366nm 紫外灯；阳性对照物 注：定量程控封口机除了将定量盘进行封口外还对 100ml 水样平均分配到 51 个孔或者是 97 个 孔中。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 4. 操作方法： 4.1 定性检测： 4.1.1 适用范围： 一般用于检测饮用水、瓶装水等；这些水样的结果是不得检出。所以只需用定性检测就可满足 试验要求。 4.1.2 操作步骤： 1) 将一个 Colilert 试剂倒入装有 100ml 水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。 2) 放在 36±1℃培养箱，培养 24 小时； 注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在 44.5℃，培养 24 小时；如果培养时间超过 28 小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则结果无效，需重做此水样。 3) 根据下面的结果解释读取结果 4) 无需确认试验 4.2 定量检测 4.2.1 适用范围： 适用于任何一种水体。 4.2.2 操作步骤： 1) 将一个 Colilert 试剂倒入装有 100ml 水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。（如图 1） 2) 将瓶内的水样全部倒入51孔或者是97孔定量盘中，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡， 然后使用定量程控封口机进行封口。 3) 将定量盘放在 36±1℃培养箱，培养 24 小时 注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在 44.5℃，培养 24 小时；如果培养时间超过 28 小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则结果无效，需重做此水样。 4) 根据下面的结果解释读取结果。数出阳性格子数后对照 MPN 表得到结果。 5) 无需确认试验 5. 测量范围 5.1 最低检出限 Colilert 试剂可以在 24 小时同时检测出总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠 菌群），它可以在 100ml 水样中抑制 2百万个杂菌干扰，最低检出限为每 100ml 水样可检测出 1cfu 的总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 5.2 选用 51 孔定量盘 在不稀释的情况下，100ml 水样可检测200 个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪 大肠菌群）。 5.3 选用 97 孔定量盘 在不稀释的情况下，100ml 水样可检测 2419 个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪 大肠菌群）。 6 检测水样的范围 饮用水 源水 瓶装水 中水 二次供水 管网水 废水 食品水 畜牧用水 医疗用水 7．实验过程中需注意的地方 如果样品有背景颜色，请做一个空白实验，与结果相比较 如果样品被稀释，则在读取 MPN 表时乘以相应的稀释倍数 只可使用纯水，不含缓冲液的水，不含氧化剂的水进行样品稀释 如果样品中含有过多的氯，则在加入 Colilert 时会显蓝光，此时样品应被终止检测 8．结论 总大肠菌群细菌主要由以下 4 个菌属细菌组成：埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆 菌属。这些菌属可以在人、畜粪便中检出，有的也可以在营养丰富的水体中检出，即在非粪便 污染的情况下，也有检出这些细菌的可能性。粪大肠菌群组成与总大肠菌群组成相同，但主要 组成是埃希菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希氏菌；柠檬酸菌 属、克雷伯菌属和肠杆菌属所占数量较少。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希氏菌检出的意义 最大，其次是粪大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些[2]。 固定底物技术酶底物法操作简便，检测时间短，可在 24 小时内同时检测水中大肠菌群和大肠埃 希氏菌的污染状况且无需确认试验；减少了传统方法中人为操作的误差，能够更准确地判断水 样的微生物污染状况；作为国家饮用水卫生标准的新方法，不但可以用于水样的例行检测，更 可作为应急突发事件的必备试剂。