用葡聚糖凝胶G—75层析柱制备高纯度细胞色素C

精 细 化 工 FINEcHEM ALS 1997年第14卷 Schiff bases ale measured．One compound has SHG effect．The effects of substituents on and are dis． cussed as wel1． Keywords：non—hnear optical materials，SHG effect，Schiff bases，Schiff condensation 脯 0 恪 嚣3 高纯度细胞色素 ． ／ 武 龙 (总后建筑工程研究厮面童、安，邮编710032) 世盥莲 (兵器工业总公司213所一室，西安．由5缩710061) 捕要 选择 2mol／L硫酸在 pH为 4．O、温度为 25℃的条件下进行抽提，提取液经^造沸石吸 附，25 硫酸绩洗脱，然后加人固体硫酸绩盐析除去杂蛋白，最后加人 2O 三氯乙酸沉淀，获 得粗品t再采用 226型弱酸性阳离子树脂和葡聚糖凝胶 G一75层析柱组合的新方法，制得了 G 紊c - ?5 。。 型弱酸性悃离 两羲穗 蒋 关量词塑竺皇塞竺：甍_聚糠凝胶 星 苎，226型弱酸性阳离子树脂 回‘ r ＼ M 细胞色素C(以下简写为Cyt．c)是从猪牛马等 动物心肌或从酵母中提取的具有激活细胞呼吸的生 化制剂，在细胞呼吸中起着主要的电子传递作用。因 此 Cyt，C特别适用于因组织缺氧引起的一系列疾 病如一氧化碳中毒、安眠药中毒、初生儿假死、心肌 梗塞等。 1990年药检部门曾对有关生产 Cyt．C的单位 进行过抽查，结果发现有的产品电泳图谱有较多的 蛋白色带并有严重的过敏反应 因此为了保证药用 的安全性，提高制剂的纯度迫在眉睫。 由于 226型弱酸性阳离子树脂(以下简称 226 柱)对Cyt．C有专一吸附作用，但是特异性还不够， 因此通过 226柱仍不能获得纯度很高的产品，通过 226柱所得 Cyt．C的 d／ 的最高值为 1．O9， 而文献报道 哺乳 动物 Cyt．C的 。 ，AⅢ可达 1．25～ 1．28 本实验选择葡聚糠凝胶 G-75层析柱(以下简 称 C--75柱)与226柱组合的方法，最终获得 。 ／ Ⅲ 为 1．28的 Cyt．C。 l 实验 1．1 主要试剂与仪器 见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1、表 2。 表 i 主要实验用药品 表 2 主要实验仪器 1，2 实验方法 1，2．1 猪心 Cyt，C的提取和纯化 取新鲜猪心 lkg，去脂肪结缔组织，用组织绞碎 机绞成肉糜，加 200ml水，用 2mol／L硫酸调 pH至 4，在室温下搅拌 2h，用 lmol／L氢氧化铵调pH至 6．0，离心，收集上清液，将沉淀按上述条件重提取 1h，合并两次提取 液，调 pH 至 7．2。静 置 3O～ 40min，倾 出上清液，再将下层带沉淀的悬浮液离 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 武龙等：用葡聚糖凝胶 G一75层析柱制各高纯度细胞色素 C 心，合并上清液，待上人造沸石柱。 称取 2眙 人造沸石，加水搅拌，用倾泻法除去 15s内不下沉的过细颗粒，然后装柱，将提取液装入 下 口瓶，通过人造沸石柱进行吸附，流速为 8ml／ min．吸附完毕，取出红色人造沸石，用蒸馏水洗涤 至清，然后用 200ml0．2 NaCI溶液分三次洗涤人 造沸石和用蒸馏水洗涤至清，晟后重新装柱，用 25 硫酸铵洗脱．流速 2ml／mln。收集红色洗脱液， 在搅拌下加入 30g固体硫酸铵，静置 1．5h，离心去 除杂蛋白，得到深红色清亮的细胞色素C溶液 加 入 25ml／100tool20 的三氯乙酸，以 3000r／min的 速度迅速离心，收集沉淀 ，用少许蒸馏水溶解，装入 透析袋在电磁搅拌下透析除盐，得粗品溶液。 将新处理好的 2g弱酸性 226树脂装柱，并将粗 品加入下口瓶进行选择性吸附，流速 0．5ml／min，吸 附完毕取出柱内交换上的细胞色素 C树脂，用无离 子水搅拌洗涤至清。 将深红色树脂重新装柱，分别进行均一及线性 梯度洗脱并进行 比较，均一洗脱液采用 0．06mol／L 磷酸氢二钠一0．4mol／I 氯化钠，线性梯度洗脱混合 瓶加入 200ml 0．06mol／L磷酸氢二钠，贮液瓶加入 200ml 0．06mol／L磷酸二氢钠 1m_0l／L氯化钠溶 液，流速为 O．5ml／min，用 自动部分收集器每管 3ml 收集，并测每管的280nm处的吸光度 ^。 将收集的深红色溶液在 40 C下，无离子水透析 除盐后得精制品．加少许防腐剂低温保存。 1．2．2 凝胶溶胀 称取 10g吸水量为 7．5g水／g干胶的葡聚糖凝 胶 G一75，放人250m1锥形瓶加入 50~60ml蒸馏水， 在室温下放置24h以上 装柱前将溶胀的凝胶减压 抽气 20~30min。 1．2．3 蓑柱加样 洗脱 柱垂直装在铁架台上，柱 内留 3cm水，将玻棒 插入柱底，沿玻棒将胶加入柱内。打开出水口，让胶 自然下沉。全部下沉后，上留5cm水，床高 37．5cm。 连接收集器，赶走管内气泡，放去床面上层的水，剩 余一薄层，将样品滴加入床面，样品加完后，开泵使 样品进入床内，以 3ml／10min的速度收集。待样品 在床面剩余一薄层时关泵，用滴管加少量洗脱液，开 泵将剩余样品带人柱内。在床面加入 5cm 高的 0．06mol／L磷酸氢二钠 0．4mol／L氯化钠溶液，连 接恒压瓶，进行洗脱。洗脱完毕，测每管收集液的 A28。 2 结果与讨论 2．1 洗脱曲线 以洗脱体积为横坐标，每管收集液的 为纵 坐标作洗脱曲线如图 1 图 1 凝胶柱层析的洗脱曲线 将 226柱层析后主峰部分 的 Cyt．C上 G一75 柱，洗脱曲线呈现 5个峰。除主峰外，还有 4个无色 的杂蛋白峰，这说明又有一些杂蛋白被分出 2．2 紫外图谱 用 SPECORD UV VIS测G一75柱层析后的紫 外光谱。流出的图峰位置和强度与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 样品比较．完 全相同(见图 2)。 350 400 500 600 800 ／n皿 图 2 层析流出峰紫外谱图 ∽∽¨㈨㈣㈣ ¨ ¨ ¨。 维普资讯 http://www.cqvip.com 7 J， c l>·一 精 细 化 工 FINECHEMICALS 1997年第 14卷 2．3 A550r耐／A勰0的改变 通过 G一7j的C．yt．C某些物理化学性质发生改 变，实验测定了A 发现此值获得了显著地 提高，由原来的 1．O9猛增到 1．28 2．4 聚丙烯酰胺凝胶 电泳测定 电泳条件：10 聚丙烯酰胺分离胶、3．5 聚丙 烯酰胺浓缩胶、pH8．3甘氨酸一Trb电极缓冲液；染 色液：0．j 氨基黑 10B(用 7 稀醋酸配制)；脱色 液：7 稀醋酸；电流：每管 1～2mA，电泳时间4h。 电泳结果：出现一条清晰的带，此外还有一条含 量很低的模糊不清的带 ，可能是 Cyt．C自动氧化的 碎片，在 226柱中难以去除而 G 7 柱可去除大部 分 。 2．5 存在的问题 G 75柱纯化 Cyt．C是用在 226柱之后的最终 阶段，并可获得满意的结果 近年来0]，离子交换层 析的一个改进就是将离子交换与分子排阻结合起 来，因此，能否合成一种兼有离子交换和分子排阻两 种效应的分离介质，来用于 Cyt．C纯化的简化操 作，以减少损失，还有待认真去研究。 3 结论 本实验选择 2mo|／L硫酸在 pH为 4．0，温度为 25℃的条件下进行抽提，提取液经人造沸石吸附， 25 硫酸铵洗脱，然后加入固体硫酸铵盐析除去杂 蛋白，最后加入 20 三氯乙酸沉淀，获得粗品，再采 用 226型弱酸性阳离子树脂和葡聚糖凝胶 G_75层 析柱组合的方法，制得了A ／A 。值高达 1．28的 高纯度Cyt．C。 参 考 文 献 ：1] Flatmark T，Acta Chem Scand，18(6)，577(1964) Ez] Margolish J aM Wriglef C W，J c肿删岍∞ t i06t 204 210， (1985) (19g6 05 1g收稿) 【作者简介】武龙，男，1972年3月生，助理工程师。1994年 毕业于天津大学化学系应化专业，获理学学士学位。现在中 国^昆解放军总后勤部建筑工程研究所从事建筑化工材科 的研究与开发工作。已发表论文 4篇。 The Preparation of Highly Pure Cytochrome C by Using Sephadex G一75 W u Long (Architectural Engineering Institute of the General Logistics Department，P．，|．A．，China，Xi n ，Postc~de 710032) Lin Shuping (The 213th Research Institute of China Ordnance Industry Xi d ，Po~ccode 710061) Abstract：Authors select 2mol／L sulphuric acid to extract from the fresh pig heart under the condition of pH= 4．0，25℃，The extraction is absorbed with man made zeolite and cleansed with 25 ammonium sulphate．Au— thors add solid ammonium sulphate for salting to eliminate impure protein，then put in 20 trichloroacetic acid to precipitate，After above processes，the crude cytochrome C is obtained，In order to get highly pure cytochrome C，authors use cation exchange 226一resin of weak acidity and sephadex G一75 filtration．Final／y authors get the highly pure cytochrome C，which A550rd／Az8。=l_28t Keywords：cytochrome C，sephadex G一75，cation—exchange 226一resin of weak acidity 了a 3一 Vl扬州推出氯化橡胶涂料 江苏扬州全陵特种 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 厂与机械部广州电器科学研究所合诈，采诈 国产原料扣先进的配方工艺，研究成功一种高，巨能防 扁材料 88G系列氯化像肢涂料，产品各项性能指标均选到标准要求，现已投凡批量生产，年产量 1000吨左右。这种潦料主要 由氯化橡胶、合成树脂、增塑荆、颜料和其它助剂组成，使用时巍工方便，干燥成膜快，漆膜光洁平整，附着力强，韧性好 ，具有扰 良的耐候性、耐久性、防毒，陆和防腐性能。这种新型防腐潦料可广泛用于船舶、港 口设备、桥梁钢结构、化工设备、墙全厦建筑 等行业 [弹性体 6-3-37] 维普资讯 http://www.cqvip.com