体外诊断试剂研制常用技术指标之分析性能评估

分子诊断与治疗杂志 2010年3月第2卷第2期 J Mol Diagn Ther, March 2010, Vol. 2 No. 2 体外诊断试剂研制常用技术指标之分析性能评估 徐伟文 [摘 要] 体外诊断试剂是疾病有效诊治的重要辅助手段。依据《体外诊断试剂注册管理办 法》进行该类产品的注册申报，是我国食品药品监督管理局对体外诊断试剂市场准入的要求。本文 对体外诊断试剂实验室 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 的指标设立及其意义进行整理阐述，以利于研发 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 及验证。 [关键词] 体外诊断试剂；注册；实验室性能评估 Evaluation index for in vitro diagnostic products(IVD) during R&D XU Weiwen (School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China) [ABSTRACT] In vitro diagnostic products（IVD）are very important for both disease diagnosis and therapy. Getting to market with IVD, certification of registration from SFDA is essential. The performance index for evaluation are discussed in this paper. [KEY WORDS] In vitro diagnostic products（IVD）; Registration; Performance evaluation 疾病的治疗，诊断是第一步，而体外诊断试剂是 重要的辅助手段。随着新技术的发展和新疾病靶标 的发现，开发新型的体外诊断试剂生生不息。但一个 新开发的试剂能否真正面市，除了建立反应模式和体 系并进行优化外，合理的性能分析与评估，是必经的 程序，也是质量保障的基础。自从我们开始涉及体外 诊断试剂的研制开发，就结合临床流行病学中诊断试 剂评价的有关内容以及国家食品药品监督管理局对 体外诊断试剂注册审评的要求，对研发的体外诊断试 剂试验室评价时的一些实验设计提出一些方案。大 部分内容在接下来的应用中得到了肯定，但部分还是 存在不清晰或不合理现象。为更好地执行新的《体外 诊断试剂注册管理办法》，同时也为了进一步提高研 制人员对相关技术指标的科学涵义及其评价设计的 认识，促进注册报批质量的提高，特整理相关资料，希 望对我们的工作有所帮助。 1 定量标记免疫分析方法分析性能评估的主要指标 1.1 灵敏度 1.1.1 分析灵敏度：试剂盒的灵敏度即最低检出量是 指在统计学意义上能与零剂量区别的量。一般用 95％可信限计算：重复测定零剂量点（n≥10），计算反 应量的均值（x_）和标准差（SD），以x_+2SD（夹心法试剂 盒）或均值x_-2SD（竞争抑制法试剂盒）的反应量计算 出相应的浓度，即为该试剂盒的分析灵敏度，这是我 们注册资料所需提供的内容。 1.1.2 功能灵敏度：将低值样本倍比稀释后重复测 定（n≥10），计算反应量的变异系数（CV%），CV% 大于 20％时所对应的剂量点，即为该试剂盒的功能 灵敏度。 1.2 特异性 诚如我们所认识到的，标记免疫分析是特定抗体 对特定抗原的特异识别。不同来源的抗体与结构类 似物结合从而产生交叉反应是客观存在的，因此特异 性检验是正确认识该试剂盒对结构类似物抗干扰能 力的指标。特异性检验通常有两种标定方法： 1.2.1 交叉反应率：一定浓度的结构类似物在本试剂 盒上的测定结果（物质的量）与该类似物的量的比值 的百分率。如：1 000 pmol/L的结构类似物，在某试剂 盒上测定结果是 5 pmol/L，其交叉反应率＝ 作者单位：南方医科大学生物技术学院，广东，广州510515 ·讲座· ·· 140 分子诊断与治疗杂志 2010年3月第2卷第2期 J Mol Diagn Ther, March 2010, Vol. 2 No. 2 5 pmol/L/ 1 000 pmol/L * 100%=0.5%。 1.2.2 实际测量值：对于不能用物质的量 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示的被测 物，如糖蛋白激素FSH、LH、TSH和HCG，这 4种激素 具有相同的α亚单位，仅仅是α亚单位上部分氨基酸不 同，实际操作中很容易产生交叉反应，而这4种激素又 分别有各自的同形异构物，其量的表达方法还不能用 物质的量（mol/L，ng/mL）表示，而只能借助于生物测 定的活性单位（IU/L，mIU/L）表示，而每一种激素的活 性单位（IU）又有完全不同的生物学意义，相互之间没 有任何关联，即并且每一种激素定义的单位意义完全 不同，不同来源相同质量的某一种激素的活性单位也 不同，它们之间的交叉反应绝对不能用交叉反应率表 示，因此往往选择实测值表示。 1.2.3 选择交叉反应对照物：当交叉反应的测量结果 高于我们期待的结果时，可以从两个方面分析：首先， 该试剂盒抗体确实与这一交叉反应因子存在交叉反 应，如 FSH在结构上与另外 3种激素仅仅是α亚单位 上个别氨基酸的不同，其特征抗体与其它位点有一定 程度的结合的可能性是存在的，这种非特异结合被限 制在一定范围内是可以接受的。在另一方面，如果选 择的交叉反应对照物中含有少量的被测物，如：欲考 察FSH试剂盒对LH的交叉反应，选择的LH抗原中含 有少量的FSH，高浓度的这种抗原在FSH试剂盒中的 测量结果很可能高于所期待的结果，应充分认识到这 种结果并不是由于FSH抗体的交叉反应引起的。因 此，当交叉反应的测量结果高于我们期待的结果时， 可以选择另一来源的交叉反应对照物重新测试，以排 除由于抗原不纯而引起的对该试剂盒抗体交叉反应 的误解。 1.2.4 交叉反应物对测定结果的影响：多大的交叉反 应是可能接受的，主要取决于被测物和交叉反应物在 人体内的相对含量。如 3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸 (Triindonhyroxine，T3)和甲状腺素 (Thyroxine，T4)，因 为血清中T4的含量是T3的近千倍，所以对于测量T4 的试剂盒而言，与T3存在 10%以下的交叉反应率都 不会影响T4的测定，而如果对于测量T3的试剂盒而 言，即使与T4存在 1%的交叉反应率，都会严重影响 T3的测定。 1.2.5 其它影响因素：评价试剂盒时还应注意其它 因素，如：溶血、高血脂、抗凝剂、其它药物、异 嗜性抗体及自身免疫性疾病患者等对样本测定结果 的影响，这种影响对不同方法、不同检测项目的影 响程度是不一样的，应逐一充分认识。此部分内容可 放入抗干扰能力。 1.3 剂量－反应曲线建立 定量标记免疫分析的最主要特征就是建立剂 量－反应曲线，通过已知浓度的校准物质（自变量，X） 和相应的反应量（因变量，Y）建立剂量－反应关系，并 同时测量待测品，通过待测样品的反应量（Y'），计算 出未知样品的浓度（X'），因此，这种剂量－反应关系 需要有良好的相关性，即统计学上的“相关系数（r）” （coefficient correlation），当相关系数越趋近于1时，表 明剂量－反应关系越密切。建立剂量－反应曲线时 应注意： 1.3.1 选择适当的数学模型拟合 如前所述，在评价试剂盒时，我们通常用双对数 （适用于非竞争性双位点夹心法标记免疫分析）数学 模型和 log-logit（适用于竞争法标记免疫分析）数学模 型。一般认为，经适当的函数转换后的标记免疫分析 的剂量－反应相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于 0.9900。 1.3.1.1 双对数数学模型：顾名思义，双对数数学模 型因函数自变量（剂量）和因变量（反应量）都经对数 转换而得名。自然对数和常用对数对剂量－反应曲 线的影响仅仅在于截距（A）的不同，通常我们取自然 对数：lnY=A+B*lnX。大量的经验表明：多数夹心法 标记免疫分析（特别是微量或超微量分析，小于 10－9 克）经双对数函数转换后，相关系数都能大于0.9900； 对于微克级的被测物，选择半对数函数有时能得到更 好的相关系数。 1.3.1.2 log-logit数学模型：经验表明，对于抑制法标 记免疫分析，log-logit数学模型因其计算方法相对简 单，且大多数情况下可以得到较好的相关性，因此是 评价这类试剂盒的首选数学模型。方程式： logit Y = A + B*log X，式中：logit Y =B/B0 /( 1－B/B0) 对于这类试剂盒，还应要求有效剂量值（ED25、 ED50、ED75或 ED20、ED50、ED80）应在剂量－反应 曲线最高浓度点和最低浓度点之间，即25%（或20%） 结合率（B/B0%）所对应的剂量浓度点应小于曲线最高 剂量点，75%或（80%）结合率（B/B0%）所对应的剂量 浓度点应大于曲线最低剂量点，使曲线在规定的剂量 范围内有足够的落差。 1.3.2 标记免疫分析在选择了特异抗体对特异抗原 的特定识别以后，剂量－反应曲线在适当浓度的抗 ·· 141 分子诊断与治疗杂志 2010年3月第2卷第2期 J Mol Diagn Ther, March 2010, Vol. 2 No. 2 原、抗体配伍下，在一定范围内，应呈现良好的相关 性，相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于0.9900。否 则应从如下几个方面考虑： ①抗体的浓度是否与抗原浓度相适应； ②选择的剂量范围是否合适； ③选择的函数方程是否合适。 1.4 精密度评价 精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能 否得到相同实验结果的能力的指标，通常用重复多次 样本测量结果的变异系数（CV%）表示，精密度评价是 质量控制的重要内容。 1.4.1 分析内(intra assay)精密度：同一次实验内（同 一块微孔板上或实验条件完全相同的情况下）同一样 本（如：质控血清）重复测定（n≥10），测定结果的变异 系数(CV%）应不高于 10.0%。分析内精密度的变化 或异常升高，应从方法学改进、实验室条件改变、操作 失当等方面排查原因。 1.4.2 分析间(inter assay)精密度：分析间精密度涵盖 的内容非常广泛，至少应包含入下内容： 同一试剂盒，不同批次之间； 同一试剂盒，同一批次，不同实验室之间； 同一试剂盒，同一批次，同一实验室，不同操作者 之间； 同一试剂盒，同一批次，同一操作者，有效期内不 同时间之间等。 不同层次的分析间精密度的意义不尽相同，在评 价试剂盒质量时应引起质量控制工作者的足够认 识。评价分析间精密度时，同一样本（如：质控血清） 在上述条件下重复测定（一般 n≥10），测定结果的变 异系数（CV%）应不高于15.0%。 1.5 准确性评价 准确性评价通常指测量结果趋近于真值的程 度。但是，正如我们所认识到的，对于标记免疫分析， 特别是具有多种同形异构体的大分子物质而言，目前 的分析方法还很难得到真值，因此，还没有真正意义 上的“准确性评价”方法，目前通常是通过标准品核对 实验或回收率实验进行考察。 1.5.1 标准品核对实验：试剂盒内校准品与相应浓度 的国际或国家标准品同时进行分析测定，要求两条剂 量－反应曲线不显著偏离平行（t测验），以国际或国 家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测效价与标 示效价之比应在0.900～1.100之间。标准品核对实验 应注意： ①配制国际或国家标准品的稀释液应与试剂盒 校准物质稀释液相同，以保证两条剂量－反应曲线在 相同反应体系下反应； ②配制国际或国家标准品的浓度范围应与试剂 盒校准物质实际浓度范围相当，以保证反应能在试剂 盒工作范围内进行。 1.5.2 回收率实验 1.5.2.1 添加回收率：选择经纯化、分析过的，性能稳 定的已知高浓度的抗原定量加入低浓度被测样本中， 并进行分析测定，测定结果与已知理论浓度相比较， 应在90.0%～110.0%范围内。 1.5.2.2 稀释回收率：同样选择经纯化、分析过的，性 能稳定的已知高浓度的抗原，按照一定比例稀释成系 列溶液，并与试剂盒剂量－反应曲线同时测定，高浓 度抗原系列与剂量－反应曲线相比较，应不显著偏离 平行（t测验），效价比应在0.900～1.100之间。 添加抗原溶液和稀释液同样应与试剂盒校准物 质稀释液相同，以保证反应在相同体系下进行。 注意：至少配制 3个不同浓度添加到空白中的测 试物，每一浓度配制2份样品，每1次试验对6份样品 重复测定3次，比较测定值和真实值求出回收率（%）， 即偏差。 1.6 检测范围（range） 剂量-反应曲线的工作范围(working range)是指 能达到一定精密度、准确性和直线性时，测定方法适 用的高低限度或量的区间，应使其最精密的部分即曲 线斜率最大的部分适合于临床测定需要的范围。它 既可以包括全部正常范围(适合于高于和低于这个数 值均有诊断意义的物质，如血清胰岛素、地高辛测 定)，也可以在正常范围的一端(即低于或者高于这个 数值，不是两者均有诊断意义的物质，前者如血清雄 烯二酮测定，后者如血清肿瘤标志物分析)。 1.7 高剂量钩变效应（HOOK效应） 当标本中被测物浓度超过线性范围上界时，所得 结果反而降低或呈阴性，这种现象被形象地称为高剂 量钩变效应（HD-hook effect）。由Miles等于 1974年 用双位点 IRMA测血清铁蛋白时发现。产生这种现 象的原因可以归纳为：在一步法试剂盒中是由于大量 过剩抗原与被捕获抗原竞争结合限量的标记二抗，二 步法试剂盒与抗原的“质”（表位数量及其重复表达数 量）有关。固相捕捉抗体过量或有重复表达表位的抗 ·· 142 分子诊断与治疗杂志 2010年3月第2卷第2期 J Mol Diagn Ther, March 2010, Vol. 2 No. 2 原，呈饱和结合，标记二抗与抗原交叉重叠结合，产生 立体效应，使抗原“异构”，与一抗的亲和力减弱。洗 涤时，标记二抗体与抗原形成的复合物自固相脱离。 用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩变 效应的发生。使用时，可以将这些样本进行稀释，使 其测量结果落在剂量－反应曲线内，这一测量结果与 稀释倍数的乘积即为该样本的原始浓度。 1.8 稳定性评价 试剂盒在有效期内，在规定的条件下保存应保持 稳定，各项性能指标应符合质量标准要求。稳定性的 实验室检验，可以通过加速降解实验进行，通常的做 法是：有效期半年的试剂盒 37℃放置 3天，有效期 1 年的试剂盒37℃放置7天后检验，该项性能指标均应 符合产品质量标准规定。 目前国家食品监督管理局要求注册提供的稳定 性资料包括至少三批样品在实际储存条件下保存至 成品有效期后的稳定性研究资料。同时，稳定性资料 还应包括模拟运输情况以及开瓶稳定性研究结果等。 1.9 健全性 健全性（validity）是免疫分析可靠性指标之一。 免疫化学分析原则上要求校准试剂与被测物质的免 疫化学性质相同，即使两者之间的结构有些差异，而 它们的剂量-反应曲线不互相偏离平行。一般采用 含被测物质的高值血清，按一定的比例稀释，然后测 定其含量。如果稀释倍数与含量呈线性关系，那么 这个分析具有良好的健全性。也可以在线性回归之 后，对校准试剂（试剂盒标准品）剂量-反应曲线的斜 率（b1）与高值血清稀释曲线的斜率（b2）的差别作显 著性测验，以判断这两条曲线是否显著偏离平行。 健全性好坏可以证明未知杂质或被测样品中是否存 在交叉反应物质。应使用分析体系中的“零”制剂或 分析缓冲液作为稀释剂（diluents）来稀释高值血清样 品，以保证稀释样品在理化状态上与其它样品的一 致性。 应该注意的是：稀释曲线应做几次重复实验，以 排除偶然因素的影响；稀释曲线有时与剂量相关，尤 其在偏离平行时要慎重地下结论。 2 定性标记免疫分析方法分析性能评估的主要指标 2.1 阴性参考品符合率 2.1.1 建立阴性参考品：阴性参考品 1套，一般应不 少于 10种不同来源的，相对于该项测定是阴性的样 本，应包含下述情况： ①正常人样本，应考虑到不同年龄组、不同种群 的变化； ②定量标记免疫分析中特异性检验中的结构类 似物。 2.1.2 阴性参考品符合率：评价试剂盒的阴性参考品 符合率的理想情况应为 100%，即全部检测呈阴性。 若出现阳性或弱阳性，应视具体情况具体分析。 2.2 阳性参考品符合率 2.2.1 建立阳性参考品：阳性参考品 1套，至少应包 含5种不同来源的，各自有独特代表性的阳性样本，如 强阳性样本、弱阳性样本，特别应注意可能引起 “HOOK”效应的高浓度样本。 2.2.2 阳性参考品符合率：同样，评价试剂盒的阳性 参考品符合率的理想情况应为 100%，即全部检测呈 阳性。若出现阴性，应视具体情况具体分析。 2.3 重现性/精密性 定性标记免疫分析试剂对于同一样本重复测定 （n≥10），应取得一致的结果。即阴性样本均应呈阴 性，阳性样本均应呈阳性。对于反应结果被量化的定 性试剂盒，阳性样本反应量的变异系数（CV%）应不高 于10.0%。 2.4 cut off值在筛查性试剂盒与诊断性试剂盒中的 意义 定性标记分析试剂盒的所有分析结果都基于 cut off判定。因此，确定 cut off值对于定性标记免疫分 析试剂盒至关重要。建立 cut off值时应选择的个体 应考虑排除对被研究指标有影响的因素，且样本量应 有统计学意义。习惯上以所选总样本的 80%、90%、 95%（最常用）、99%的频数为截断点（cut off point），相 应的剂量即为cut off值。 筛查性试剂盒的试验目的是从无症状的人群中 找出可能患有某种疾病的患者，是要减少假阴性，就 应放宽百分位，通常选择 80%或 90%的频数为截断 点。而诊断性试剂盒是通过实验室检验协助医生确 定患者是否患有某种疾病，要减少假阳性，就要适当 放宽假阴性，取 95%或 99%的频数为截断点。因此， 同一试剂盒用于筛查性目的时和用于检验性目的时 的 cut off值可能不同。具体可参照我整理的另一文 章“关于截断值的确认”。 2.5 稳定性 同定量试剂要求。 ·· 143 分子诊断与治疗杂志 2010年3月第2卷第2期 J Mol Diagn Ther, March 2010, Vol. 2 No. 2 3 质控血清的制备、标定和应用 3.1 制备 理想的质控样本至少应包含下列特征：与被测物 来源相同，有一定批量，规定条件下保存性质稳定，冻 干品分装支间差异小，无传染性等。如，甲状腺功能 检测的质控样本，可以分别收集甲亢、甲低和正常人 血清，混合后制备的质控血清应涵盖被测物剂量－反 应曲线的低、中、高三个区域。但实际操作时由于要 求质控样本有一定的批量，可以供一段时间内连续使 用，并应对血源进行生物安全性检测，因此，收集临床 样本制备质控血清被认为不太现实。目前通常采用 的是在正常人血清中定量添加被测物的方法制备质 控血清。具体方法是： ①收集一定量的被测物人血清，或制备不含被测 物血清，经生物安全性检验呈阴性，离心、过滤、去杂 质，加防腐剂； ②加入被测物高纯品，分别在曲线低、中、高三个 区域配制成三种浓度质控血清； ③分装、冷干，得到质控血清成品，-20℃保存，备 用。 3.2 标定和应用 选择一定的分析系统，对质控血清进行重复测定（n≥ 20），计算均值和标准差，一般以均值为质控血清的靶值， 均值±2倍标准差为质控血清的测定上限和下限。 实验室在进行分析检测时应自觉使用质控血清开 展内部质量控制工作。按照规定，每次实验中质控血清 数量应为实验总量的平方根。如，一块96孔板的实验中 应安排质控血清数量9~10孔。每个点均应为双复孔， 且安排在微孔板的上、下、左、中、右不同位置。 3.3 记录质控结果和绘制质控图 确定质控血清的靶值是绘制质控图的基础，分别 绘制低、中、高三个质控血清的质控图。以实验次数 为横轴，以每次实验质控血清测定值为纵轴，绘制质 控图（见图 3）。建立质控图后，每次实验的质控血清 测定值都应记录在质控图上。 3.4 对质控图记录结果的评价与分析 理想的检测结果均应在靶值附近，明显偏离靶值 或重复偏向靶值同侧的结果均应引起足够重视。质 控血清测定值的异常是实验过程中出现异常变异的 最直接的综合反映，应根据前面讲述的质量控制基本 内容逐一排查原因。值得注意的是，目前应用的内部 质量控制的方法仅仅能评价实验室测量结果的可重 复性（精密度），而不是它的“准确性”。 总之，一个单位在研制生产一种新的体外诊断试剂 盒产品时，都要对该产品的适用性和可靠性等性能进行 测定和评价，需要对下述问题进行全方位考虑：①该试 剂盒是否达到了特定的要求？②该试剂盒的灵敏性、重 复性、准确性和精密性方面是否达到了要求？③该试剂 盒在技术上是否要求很苛刻？④临床使用时是否需具 有应用该试剂盒的专业知识？是否需要 培训 焊锡培训资料ppt免费下载焊接培训教程 ppt 下载特设培训下载班长管理培训下载培训时间表下载 ？⑤该试 剂盒是否需要特殊的设备？⑥该试剂盒是否造价很高？ ⑦该试剂盒是否需要时间过长？本文对试剂盒分析性 能的评估做了详细介绍，提请研发人员主要应对上述指 标进行测定考核，以确定该产品在本研究内能够得到准 确和重复的实验结果，并且在测定范围、测定限度和特 异性等方面达到了测定的要求，确保实验数据的准确与 可靠。在实验设计时，一定要注意重复性问题，尤其在 标准确认过程中，多复孔设计及多次重复实验是必须的。 参考文献 [1] 王蓓,主编.临床流行病学[M].南京:东南大学出版社, 2004. [2] 《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》.国食药监械[2007] 229号. [3] 张丽.体外生物诊断试剂临床前研究技术审评一般指导原 则[EB/OL].国家食品药品监督管理局审评中心电子刊物. 图1 质控图 Figure 1 Quality control chart ·· 144 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2008，28(7) 体外诊断试剂标准物质国内外现状 高尚先，黄杰 (中国药品生物制品检定所体外诊断试剂与培养基室 ，北京 100050) 摘要：概述临床检验量值溯源体系和体外诊断试剂标准物质的国内外现状，分别叙述了血脂、酶学、血液学、分子生物学、免疫 学、微生物学等方面的检测标准化。阐明加强体外诊断试剂标准物质建设的重要意义，不仅有利于诊断结果的准确一致，而 且是做好体外诊断试剂技术监督的有力保证。 关键词：体外诊断试剂；溯源性；标准物质；标准化 中图分类号：R917 文献标识码 ：A 文章编号：0254—1793(2008)07—1207—07 The development of reference material for diagnostic reagents in vitro GAO Shang—xian，HUANG Jie (Department of Diagnostic Reagents in vitro and Culture Medium，National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products，Beijing 100050，China) Abstract：The paper summarized development process of reference material for diagnostic reagents in vitro and the metrological tracebility system in clinical laboratory medicine．This paper described respectively the standardization in blood—lipid detection，enzyme determination，hematological examination，molecular biological detection，immuno— logical assay，microbiological assay，etc．It was of great important to strengthen reference material for diagnostic rea- gents in vitro construction，which not only was conducive to consistency of the accurate diagnostic result，but also was a strong safeguard for technical supervision of diagnostic reagents in vitro． Key words：diagnostic reagents in vitro；metrological tracebility；reference material；standardization 体外诊断试剂标准物质是实现体外诊断试 剂监督检验数据和结果准确一致的主要工具 ，也 是保证量值有效传递的计量实物标准。在完整 的溯源 、量值传递和校正过程 中，标准物质起着 复现量值、传递测量不确定度和实现测量准确一 致的作用 ¨J。按照 国家实验室认可准则 的要 求，对于检测 的仪器 和检验项 目应 有溯源或校 正，只有使用标准物质才能保证检验结论准确一 致。如果没有标准物质，同一个样 品在不同实验 室检测其结果就可能存在较大的差异 ，造成病人 重复检测，增加病人 负担，浪费医疗 资源。随着 国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对 检验技术要求的不断提高，对体外诊断试剂标准 物质的需求和依赖也越来越强烈。因此 ，加强体 外诊断试剂标准物质建设，不仅有利于诊断结果 的准确一致 ，使各医院的检测结果具有可 比性 ， 第一作者 Tel：(010)67095283：E—mail：gaoshangxian@126．corn 而且也是做好体外诊断试剂技术监督 的有力保 证 。 1 标准物质的概念 标准物质和有证标准物质于 1977年由国际标 准化组织(ISO)首次提出，随后经过多次修改，1992 年 10月在日内瓦召开的国际标准化组织和标准物 质委员会第 16次会议讨论修改了由 A．J．Head博 士提交的关于标准物质的陈述，批准通过了国际标 准化指南 30，在指南 30中就标准物质和有证标准 物质作 出了定义。按照“国际通用计量学基本术 语”和“国际标准化组织指南 30”，标准物质有如下 定义： 标准物质(Reference Material，RM)：具有一种 或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校 准设备 ，评价测量方法或给材料赋值的材料或物 质 维普资讯 http://www.cqvip.com ． - — — 1208．．—— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2008，28(7) 有证 标准 物质 (Certified Reference Materia1． CRM)：附有证书的标准物质，其一种或多种特性值 用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复 现的用于表示该特性值的计量单位，而且每个标准 值都附有给定置信水平的不确定度。 基准标 准物 质 (Primary Reference Materia1． PRM)：这是一个 比较新的概念，国际计量委员会 (CIPM)于 1993年建 立 了物 质 量咨 询委 员会 (CCQM)，在 1995年的物质量咨询委员会会议上提 出了如下定义：一种具有最高计量品质，用基准方法 确定量值的标准物质。 基 准 方法 (Primary Method of Measurement， PMM)：具有最高计量品质的测量方法，它的操作可 以完全地被描述和理解，其不确定度可以用国际单 位制(SI)单位表述，测量结果不依赖被测量的测量 标准。 从上述定 义可以看 出，标 准物质 具有 2个 显著特点 ：量值准确性和用于计量 目的。这就 澄清了标准物质的某些模糊概念 ，把那些不是 用来校准计量器具 和计量方法 ，同时也没有量 值准确度 要求 的 “产 品系列标 准样 品”(如 棉 花、粮食 、毛 、麻等产品标准样品)与标准物质区 别开来 。 2 体外诊断试剂标准物质国内外现状 世界上最早开始研制标准物质的是美国国家 标准和技术研究所 (National Institute of Standards and Technology，NIST，其前身为美国标准局 NBS)， 在 l9世纪50年代已研制了数百种各类标准物质， 但可用于临床检验的标准物质却只有 SRM41右旋 糖一种。由于医学领域对临床检验中标准化的呼 声越来越高，国际组织和世界各国陆续在医疗领 域中关注和开展标准物质研制和检验方法标准化 的研究。 1968年 NIST推 出纯试 剂 标准 物质——尿 酸，此后 ，在 1 968—1 978年的 10年问，先后研究 生产了 19种临床用标准物质 ，鉴于社会对临床 检验分析标准物质要求 的迫切性，NBS加速了临 床检验分析标准物质 的研制；在 1978～1993年 间，新增加 的分析标准物质 ，每 5年以成倍数的 趋势增加。 欧洲标 准 局重 视 临床检 验用 标准 物质 的 研制。位于比利时的标准物质和计量研究所(In— stitute of Reference Materials and Metrology，IRMM) 自1970年后期开始了临床检验用标准物质的研 制。1981年首 先推 出用 于测定 凝 血时 间的促 凝血酶原激酶，随后，陆续研制出一系列标准物 质。 英国的国家生物标准和控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC) 与世界卫生组织(World Health Organiz ation，WHO) 合作，研制了大量的涉及蛋白、抗体、激素等作为溯 源的国际通用标准物质。其他国际组织和国家如国 际原子能机构(International Agency of Atomic Ener． gY，IAEA)、德国、挪威、日本等也先后开展了这方面 的研究。 我国自80年代以来也开始研制临床检验标 准物质。在 1992年以前 ，主要是 以血、尿、发为 基体的提供无机成分和微量元素标准值的分析 标准物质和纯试剂标准物质。目前，我国临床检 验量值溯源基础建设 比较薄弱 ，惟一具有 比较完 整参考系统的检验项 目是胆 固醇。该参考系统 由卫生部北京老年 医学研究所和国家标准物质 研究 中心制备 的纯度标准物质 (GBW09203a和 GBW09203b)(一级参考物质)、卫生部北京老年 医学研究所(Beijing Institute of Geriatrics)建立的 参考 方 法 和该 研 究 所 制 备 的血 清 标 准 物 质 (GBW09138)(二级参考物质)组成 ¨。我 国还 有 20余项 与临床检验有关 的国家一级标准物 质 ，其中包括国家标准物质研究中心制备的尿素 (GBW09201)和尿酸(GBW09202)纯度标准物 质(ISO1751 1定义 中的一级标准物质)，其余则 主要是生物样品中无机成分标准物质。目前 国 内有关学者正在研究 TG、HDL—C和 LDL—C、酶 催化浓度、血栓与止血指标等的标准化问题。在 免疫检测 的标准化方面中国药品生物制品检定 所做了许多工作，中国药品生物制品检定所研制 的供传染病 、免疫测定等体外诊断试剂标准物质 65种；在酶催化浓度的标准化方面国内有单位尝 试丙氨酸转氨酶参考品等的研制 16]；在血液检 测的标准化方面卫生部临检 中心血液室在全 国 范围内进行了血细胞计数测量溯源体系的建立 ； 在核酸分子检测方面卫生部 临检 中心免疫室研 制了HBV和 HCV核酸的国家二级标准物质。但 是 ，总的说来 ，我国的标准物质研制处于起步阶 段，在提高国内诊断试剂质量和促进临床实验室 的检测水平方面还有很长的路要走。 国内外主要的体外诊断试剂标准物质研制、提 供机构见表 1。 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2008，28(7) 一 1209一 WH0 IS0 IAEA IFCC BCR CEN AMI AACC CDC DGKC IRMM LGC NCCLS／CLSI NIBSC NIES NIST 世界卫生组织(World Health Organization) 国际标准化组织(International Organization for Standardization) 国际原子能机构(International Agency of Atomic Energy) 国际临床化学和实验室医学联盟(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) 欧洲委员会标准局(European Commission—community Bureau ofReference) 欧洲标准化委员会(European Standard Organization) 丹麦国家职业病研究所(The Danish National Institute of Occupational Health) 美国临床化学 会(American Association for Clinical Chemistry) 美囤疾病控制中心(Centers for Disease Control，Atlanta，USA) 德国生物分析标准研究所(Reference Institute of Bioanalysis) 比利时标准物质和计量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements) 英国国家化学家实验室／标准物质办公室(Laboratory of the Government Chemist／the Office of Reference Ma~ als) 美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee on Clinical Laboratory Standards)／美国临床实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute) 英国国家生物标准和控制研究所(National Institute for Biological Standards and Contro1) 日本国家环境卫生研究所(National Institute of Environmental Studies) 美国国家标准与技术研究所(National Institute of Standards and Technology) 中国国家标准物质研究中心(National research center for CRMS) 中国药品生物制品检定所(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products) 挪威奥斯陆Rikshopitalet临床生化研究所(Norway Oslo Rikshospitalet institute of Clinical biochemistry research) 瑞典Karolinska研究所(Karolinska institute，Stockholm，Sweden) 英国哈罗临床研究中心(Clinical Research Center，Ham，British) 加拿大疾病控制中心(Centers for Disease Control，Ottawa，Canada) 法国迪戎大学(Dijon University，France) 德国波恩大学临床生化研究所(Institute Clinical biochemistry research，Bonn University，Germany) 法国临床生物学学会(French Society of Clinical Biology) 目前国际上临床检验项 目大约有 1000个，能溯 源至 sI单位的约有 30个，它们主要是一些化学定 义明确的小分子化合物，包括电解质类 (如钾、钠、 氯、镁、钙、锂离子等)、代谢物类 (如胆固醇、甘油三 酯、葡萄糖、肌肝、尿酸、尿素等)和某些甾体类激素 及甲状腺激素。 除上述少量项 目外，其余多数临床检验项目因 被测物质(主要是生物大分子类物质)的复杂性(如 混合物、异构体等)，其一级参考测量过程的建立和 一 级参考物质的制备非常困难，其量值溯源只能停 止在较低水平。这类检验项 目目前国际上有以下几 种情况：(1)有国际参考测量过程(非一级参考测量 过程)，也有用此参考测量过程定值的国际参考物 质，如糖化血红蛋白；(2)有国际参考测量过程，无 国际参考物质，大约有 3O个检验项 目属于这种情 况；(3)有国际参考物质及定值方案，但无国际参考 测量过程，属于这种情况的检验项 目约有 250个； (4)还有大多数既无国际参考测量过程，也无国际 参考物质。 上述能溯源至 sI单位的检验项 目的高级参考 系统(一级和二级标准测量程序、一级标准物质和 高准确度基质标准物质)多数 由 NIST、DGKC和 BCR(现参考物质与测量研究所，IRMM)建立和保 持。也有一些大学、医院、研究机构和生产厂家的专 业实验室建立了自己的参考测量过程，因多年从事 标准测量工作 ，故而达到了很高的计量学水平。不 能溯源至 sI单位的检验项 目的参考系统(主要是参 考物质)主要来 自有关国际组织，如 WHO、IFCC等。 2．1 酶学检测的标准化。。 2O世纪 7O年代，IFCC成立了由著名学者 Moss 卧 即 R 邮 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2008，28(7) 等组成的酶学委员会，开始将酶学的标准化寄希望 于制定参考方法上。他们首先明确和界定了测酶活 性(酶促反应 )的各种条件。这是因为酶促反应速 度的快慢不只是由酶浓度一个因素所决定，因此必 须将一些条件或因素(如底物浓度、辅因子等)控制 在最适条件、不至于因这些因素的变异而影响反应 速度，另一些因素必须加以固定(如温度、缓冲液种 类等)。该委员会第一个文件就是有关酶活性测定 的总则。时问虽已过去了近 30年，但此文件仍然是 建立测定酶活性方法的指导性文件。测定酶活性的 温度上一直争论：当时的文件规定测酶反应温度为 30℃，理由是温度较低酶不易变性，其次 30℃容易 标化，因为金属镓的融点为 2919℃，所以随后颁布 的一系列具体的文件中测酶活性的最适条件都是根 据 30℃而定 但在实际工作中，当室温超过 25℃ 时，控制酶反应在30℃往往有困难。1999年 IFCC 在西班牙召开会员大会时，决定重新制定在37℃测 定酶活性的参考方法。经多年努力，制定出6个文 件，经 IFCC会员投票通过后，在 2002年颁布。 第 1个文件名为“测定酶催化活性浓度参考方 法的概念”，要求建立包括下列要素的测定酶催化 浓度的世界参考体系。 参考测定方法：以现有的 IFCC 30℃的参考方 法作为基础，制定了一套37℃的标准操作方法。 参考实验室网络：目前在世界上已成立一个由 15个实验室组成的酶催化活性浓度测定的参考实 验室网络，在计量学高水平上用参考测定方法对参 考物质进行检测并定量。 参考物质：根据 IFCC和 IRMM合作协议，对现 有的 BCR参考物质重新定量。在此参考系统 中， IFCC的酶参考方法测定具有最高的计量学水平，由 此规定了其他水平的测定量。例如各个厂家校准品 的定值方法，以及计量水平更低的质控品的结果。 从理论上讲，各个医院检验科每日常规工作的结果， 均应溯源至上述参考系统的结果。 第2到第6个文件分别讲述37℃下测定下列 酶催化浓度的参考方法。第 2个文件：IFCC测定肌 酸激酶催化活性浓度的参考方法；第 3个文件：IF— CC测定乳酸脱氢酶催化活性浓度的参考方法；第 4 个文件：IFCC测定 ALT催化活性浓度参考方法；第 5个文件：IFCC测定 AST催化活性浓度参考方法； 第6个文件：IFCC测定 一谷氨酰氨基转移酶催化 活性浓度参考方法。每一标准均详细叙述了实验室 如何 自行配制试剂溶液并应用手工操作分光光度计 进行测定的参考方法。 2．2 脂类检测的标准化 血脂测定的标准化要求实验室之问的血脂测定 结果具有可比性，达到规定的准确度，其核心是量值 溯源。即在建立一个可靠的参考系统作为准确性的 前提下，通过标准化 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 将准确性转移到临床常规 测定中去，使常规测定结果可溯源到参考系统所提 供的准确性基础上来。目前美国已建立较完整的总 胆固醇(TC)、总甘油三酯 (TG)测定的参考系统。 其决定性方法都是由(NIST建立的核素稀释 一质谱 法(ID—MS法)，一级参考物质分别为 NIST的 SRM911b和 SRM1595(三软脂酸甘油酯)；参考方法 分别为 CDC改进并维持的 ALBK法和二氯甲烷 一 硅酸 一变色酸显色法，二级参考物质有 NIST的 SRM909、SRM1951a、CAPRM026及 CDC的多种冰 冻血清。ALBK法除用于 TC测定外，也用于高密度 脂蛋白胆固醇(HDL—C)和低密度脂蛋 白胆固醇 (LDL—C)参考方法中的各组分胆固醇测定。与胆 固醇参考方法实验室网络(CRMLN)成员不同，欧洲 部分国家则使用 ID—MS法作为测定胆固醇和 TG 的参考方法。由于 TG测定中的变色酸显色反应步 骤多、需要强酸试剂，最近 CRMLN拟将此步改为酶 法。HDL—C、LDL—C目前暂没有决定性方法和一 级参考物质，只有参考方法和二级参考物质，参考方 法为超速离心结合 ALBK法，二级参考物质为 CDC 冰冻血清、NIST SRM1951a及 CAP RM026。鉴于此 参考方法所需血量大、操作复杂、影响因素多，CDC 也在考虑进行改进与完善。 2．3 血液检测的标准化 2．3．1 红细胞(RBC)和白细胞(WBC) 计数国际 血液学标准化委员会(ICSH)推荐使用电阻抗法半 自动单通道血液分析仪计数细胞代替直接计数法， 并在 1994年进行了修订，将其确定为参考方法。现 行 RBC和WBC计数的参考方法，是将血液稀释一 定倍数后用 ICSH推荐的血液分析仪计数一定体积 内的细胞数，并换算成每升血液内的细胞数。 2．3．2 血红蛋白(Hb)测定 1966年 ICSH就已推 荐氰化高铁血红蛋白(HiCN)法为首选参考方法，也 可常规使用。其他方法如十二烷基硫酸钠测定法、 叠氮高铁血红蛋白法等都必须通过 HiCN法校正其 结果。 2．3．3 红细胞比容(PCV)测定 PCV的常规测定 方法有离心法、稀释法及电阻抗法等，其中以离心法 重现性较好(微量离心法测定 PCV的 CV值为 1％ 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2008，28(7) ～ 2％)，但因残留血浆及其他因素的影响，特别是 在病理情况下，其结果欠准确。ICSH曾于 1980年 推荐在 Wintrobe管离心法的基础上用放射性核素 标记的人白蛋白对残留血浆进行校正，并以此作为 参考方法。该法是 PCV测定最准确的方法，但因其 实验要求的特殊性，非普通实验室所能开展。目前， ICSH制定了新的 PCV测定的参考方法，即通过测 定全血 Hb浓 度 与平 均 红细 胞 血红 蛋 白浓 度 (MCHC)，间接得到红细胞比积(Hb／MCHC法)。 2．3．4 网织红细胞(RET)计数 目前 RET计数的 参考方法依然是目视计数法，即将血液标本作活体 染色后制成血涂片，在显微镜下对红细胞逐个区分， 计算出 RET与 RBC总数的比值。再根据 ICSH参 考方法所计数的 RBC数，将 RET相对数换算成每 升血液中的绝对数。 2．3．5 血小板(PLT)计数 现行的 PLT计数的参 考方法是 ICSH制定的 PLT／RBC比值法，即以 RBC 代替乳胶颗粒作为校准物，计数 PLT／RBC值，通过 ICSH参考方法计数 RBC浓度，再以PLT／RBC比值 乘以RBC浓度即为 PLT浓度。 2．3．6 白细胞分类计数 (DC) 目前，白细胞 DC 的参考方法仍然是手工分类法，即将血涂片进行瑞 氏染色后，在显微镜下对各种 WBC进行分类。 2．4 核酸检测的标准化 ¨ 近年来，病毒核酸检测实验(NAT)被越来越广 泛地应用于血源性制品的病毒筛查，抗病毒治疗疗 效及预后监测等方面。由于该方法过程复杂，且含 有酶学反应，极容易受到检测样本的基质效应和检 测病毒的基因变异等影响，导致了不同的实验室在 应用不同方法学进行 NAT检测时，在量值、灵敏度 和特异性方面差异很大。为减少检测的变异，并使 不同实验室，不同方法检测的结果具有可比性，就必 须使检测标准化。标准化检测必须有由参考物质和 参考测量程序组成的参考体系。 由于核酸不能单独应用物理和(或)化学的方 法进行准确描述，因此必须应用生物学反应来补充 描述其特性 ，所以迄今为止传统意义的一级参考测 量程序(物理和化学方法)和一级参考物质在 NAT 检测中尚未存在。尽管如此，WHO已经通过多中心 研究建立了HCV RNA、HBV DNA、HIV一1RNA、B19 DNA和 HAV RNA NAT等核酸国际参考物质，并依 据此项标准建立了应用于国家或地区以及厂家工作 校准等几种不同等级、不同检测方法的工作制剂，从 而使当前不同实验室、不同检测方法得出的检测结 果 的表述单位 (如 genome equivalents／mL，copies／ mL，PCR detectable units／mL)得到统一并具有可比 性 。 WHO于 1997年建立了第一套HCV RNA核酸 检测用国际标准，分别于 1999年、2000年、2002年 和2003年建立了 HIV一1 RNA、HBV DNA、Human Paraparvovirus B19和 HAV RNA核酸检测用国际标 准。WHO为病毒 NAT制定的国际标准，来源于稀 释后冻干分装的且含灭活野生型病毒的人混合阳性 血浆，表述单位通常为 IU。这种标准物质量值为 WHO经多中心研究确定其可以作为第一个国际标 准物质或参考制剂后，通过主观方式