下载

2下载券

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 双水相萃取体系及其在蛋白质和酶分离中的应用

双水相萃取体系及其在蛋白质和酶分离中的应用.doc

双水相萃取体系及其在蛋白质和酶分离中的应用

devsts
2012-07-07 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《双水相萃取体系及其在蛋白质和酶分离中的应用doc》,可适用于高等教育领域

PEG无机盐双水相萃取体系及其在蛋白质和酶分离中的应用摘要双水相萃取技术是一种新型液液萃取技术已应用于生物活性物质的分离。本文阐述了双水相萃取技术的基本原理与特点并对其中的PEG(聚乙二醇)无机盐双水相萃取体系及其在蛋白质和酶分离中的应用进行了综述。对双水相萃取技术存在的问题与发展前景进行了简要论述。关键词双水相萃取分离蛋白质酶聚乙二醇thepolyethyleneglycolsaltaqueoustwophasesystemanditsapplicationtopartitionandpurificationofproteinsandenzymesABSTRACTAqueoustwophaseextractiontechniqueisanewtypeliquidliquidextraction,whichhasbeenappliedtobiologicalactivitycompoundsThebasicprinciplesandfeaturesofaqueoustwophaseextractiontechniquewereillustrated,andthepolyethyleneglycolsaltaqueoustwophasesystemanditsapplicationtopartitionandpurificationofproteinsandenzymesweresummarizedItsunresolvedproblemsanddirectionsinthefuturewerealsopointedoutKEYWORDSaqueoustwophaseextractionpartitionproteinsenzymespolyethyleneglycol目录中文摘要………………………………………………………………………………………Ⅰ英文摘要………………………………………………………………………………………Ⅱ目录……………………………………………………………………………………………Ⅲ前言……………………………………………………………………………………………双水相萃取技术的原理………………………………………………………………………双水相的形成…………………………………………………………………………双水相萃取的原理……………………………………………………………………双水相萃取体系的分类…………………………………………………………………双水相萃取的特点……………………………………………………………………PEG无机盐双水相萃取体系…………………………………………………………………PEG无机盐双水相萃取体系的制备……………………………………………………PEG无机盐双水相萃取体系的分相规律………………………………………………PEG无机盐双水相体系性能参数和影响因素…………………………………………萃取条件优化……………………………………………………………………………PEG种类和浓度的选择………………………………………………………………成相盐种类和浓度的选择………………………………………………………………pH的选择………………………………………………………………………………外加电解种类和浓度的选择…………………………………………………………其他影响因素的优化…………………………………………………………………PEG无机盐双水相体系在蛋白质和酶分离中的应用………………………………………蛋白质和酶的分离及评价参数………………………………………………PEG无机盐双水相体系在蛋白质和酶分离中的应用……………………………PEG无机盐双水相体系在生物工程中的分离流程………………………………结语…………………………………………………………………………………参考文献………………………………………………………………………………………前言双水相萃取技术是利用较简单设备、在温和条件下进行简单操作即可获得较高收率和较纯产品的新型分离技术。与传统的分离技术相比双水相技术作为一种新型的分离技术因其体积小处理能力强成相时间短适合大规模化操作等特点已经越来越受到人们的重视。Beijeronck在年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合发现了双水相现象。双水相萃取(Aqueoustwophaseextraction,ATPE)技术真正应用是在世纪年代年瑞典伦德大学的Albertsson将双水相体系成功用于分离叶绿素这解决了蛋白质变性和沉淀的问题。年德国Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础。迄今为止双水相技术已被成功应用于生物医药工程天然产物分离纯化金属离子分离等方面。因其广泛的应用性双水相技术已经发展成为一种相对成熟的技术特别是对蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化已成功地应用在蛋白质的大规模分离中。但在很多领域仍有很大潜在的价值等待我们去研究开发。双水相萃取技术的原理双水相的形成双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时由于聚合物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍作用无法相互渗透当聚合物或无机盐浓度达到一定值时就会分成不互溶的两相因为使用的溶剂是水所以称为双水相。两种聚合物形成的双水相体系是由于高聚物的不相溶性产生的。高聚物与无机盐形成的双水相体系的成相机理尚不十分清楚但一般认为是高价盐的盐析作用使高聚物和无机盐富集于两相。双水相萃取的原理双水相萃取(ATPE)与水有机相萃取的原理相似都是依据物质在两相间的选择性分配物质进入双水相体系后由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可表示为:K=C上C下C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。双水相萃取体系的分类常用的双水相体系主要有:非离子型高聚物非离子型高聚物水、聚电解质非离子型高聚物水、聚电解质聚电解质水、高聚物无机盐水等。在双水相体系中,常用的非离子型高聚物有:聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、聚乙烯醇、葡聚糖、羟丙基葡聚糖等常用的聚电解质有:葡聚糖硫酸钠、羧甲基葡聚糖钠、羧甲基纤维素钠等。常用的无机盐有:磷酸盐、硫酸镁或硫酸铵等。聚乙二醇葡聚糖和聚乙二醇无机盐是常用的双水相体系由于葡聚糖价格昂贵聚乙二醇无机盐体系应用更为广泛。双水相萃取的特点与一些传统的萃取分离方法相,双水相萃取技术有以下特点()两相的溶剂都是水上相和下相的含水量高达不存在有机溶剂残留问题常温常压操作。()分相时间短特别是聚合物盐系统自然分相时间一般只有min。()易于工艺放大和连续操作与后续提纯工序可直接相连接无需进行特殊处理。()具有高的生产力目标产物的分配系数一般大于大多数情况下目标产物有较高的收率。()大量杂质能够与所有固体物质一起去掉可省去个分离步骤使整个分离过程更经济降低投资成本。()有生物适应性组成双水相的高聚物及某些无机盐对生物活性物质无伤害因此不会引起生物物质失活或变性有时还有保护作用。PEG无机盐双水相萃取体系PEG无机盐双水相萃取体系的制备PEG与无机盐在水中会形成两个相这是由于盐析作用造成的但它们只有达到一定浓度时才能形成两相。双水相形成的条件和定量关系可用相图表示它是一根双节线只有当成相组分的配比在曲线的上方时才能自动分为两相。图是PEG和硫酸铵盐溶液的相图。制作相图的一般方法是:精确称取一定质量的PEG液体左右于试管中加入ml水滴加已配好的盐溶液不断混合观察溶液的澄清程度直至试管中溶液开始出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(ml)求出质量(g)。然后加入水使其澄清继续向试管中滴加盐溶液使其再次达到浑浊如此反复操作。计算每次达到浑浊时PEG和盐在系统总量中的质量分数()以PEG的质量分数为纵坐标质量分数为横坐标作图即得到一条双节线的相图。对不同组成的PEG盐双水相系统先计算配制一定质量的双水相系统所需PEG和盐的质量依次将盐和PEG加入具塞刻度试管中再加入一定量的待萃取样品然后加蒸馏水至预定系统质量充分混合均匀。在一定温度下条件下静置至上下两相完全分离。PEG无机盐双水相萃取体系的分相规律聚合物能与水进行无限混溶当它们的组成位于相线上方时体系就会分成两相形成无限多个不同组成密度的两相系统。在这个两相系统中上相主要含PEG下相主要含盐。随着PEG相对分子质量从增大其双节线由左向右移动表现出在相同盐质量分数下成相所需要的PEG量与相对分子质量成反比这是由于随着PEG相对分子质量的增大分子链增长分子间的空间位阻效应增强相互间渗透难度加大在相同浓度下伴随着相对分子质量的增大PEG在水中的摩尔浓度减小端基数目降低极性减弱疏水性增强与水的缔合能力随之减弱和盐溶液之间的差异增大增加了分相推动力最终导致临界分相浓度降低。体系中成相物质的总浓度增加时体系将远离临界点同时系统长度增加两相性质的差别增大。萃取相的极性减小对于极性程度不高的物质来说其在上相的溶解度也会增大分配系数也随之增加。但PEG质量分数超过一定程度萃取相极性下降太多使极性过高的成相盐溶解度下降甚至不溶破坏了双水相成相条件。各种无机盐的分相范围和分相能力也不同需要选择合适的成相盐。性能较好比较通用的常用无机盐有磷酸盐、硫酸镁或硫酸铵等。成相物质相对浓度影响体系相比相比定义为上相(即PEG相)和下相(盐溶液相)的体积比。固定PEG质量分数为不同浓度硫酸铵盐浓度下相比如图固定硫酸铵盐溶液浓度不同PEG浓度下如图。随着PEG浓度的增加和盐浓度的减小相比增大。PEG无机盐双水相体系性能参数和影响因素PEG无机盐双水相体系主要由以下性能参数:相比:R=V上V下其中V上为上相PEG相的体积V下为下相盐相的体积分配系数:K=C上C下其中C上为待分离物在上相中的浓度C下为待分离物在下相中的浓度对酶有:酶分配系数:Ke=上相酶活下相酶活对蛋白质有:蛋白质分配系数:Kp=上相蛋白质浓度下相蛋白质质量分数萃取率:Y=RK(RK)×比酶活=酶活蛋白含量纯化倍数=上相比酶活原酶比酶活双水相萃取技术的关键是双水相的形成和溶质在双水相中的分配。影响因素较复杂主要包括组成双水相系统的高聚物类型、高聚物的平均分子量及浓度组成双水相系统的盐的种类、离子强度和浓度被分离的各种物质的种类、性质、分配特性等操作条件如pH值、温度等这些因素之间还有相互作用。双水相萃取理论正处于深入研究阶段。萃取条件优化以PEG盐体系作为成相系统需要系统研究影响萃取的各个因素如PEG质量分数、成相盐质量分数、离子强度、pH值等因素对萃取的影响并通过正交实验进一步优化实验条件以选取最佳分离纯化的条件。PEG种类和浓度的选择()PEG种类的选择PEG按其平均分子质量分为几类产品如PEG表示平均分子质量为。常用的PEG种类有:PEG、PEG、PEG、PEG、PEG、PEG、PEG、PEG、PEG等。可以固定PEG和成相盐的质量分数改变PEG的种类即平均相对分子质量考察不同分子质量的萃取效果。周念波等在以PEG(NH)SO双水相萃取法提取壳聚糖酶的研究中固定PEG的质量分数为、(NH)SO的质量分数为考察了PEG相对分子量对壳聚糖酶萃取效应的影响结果如图:其中K为分配系数S为萃取率。可见PEG对这种酶的萃取效果较好。PEG的分子量在酶提取中还影响酶的活性。涂绍勇等在用双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究中考察类PEG的分子量对酶活性的影响结果如表可见PEG对这种酶的活性影响最小。PEG的分子量除了影响分配系数外还影响成相时间。谢云飞等在用双水相体系分离血红蛋白的研究中考察了PEG的分子量对成相时间和分配系数的影响。其结果如表。由表可见随着PEG相对分子质量的增大血红蛋白(HB)的分配系数降低。这主要是因为随着PEG相对分子质量的增加分子内极性羟基基团的比重降低导致PEG的疏水性增强溶液的极性下降故加大了上下相间的疏水性程度的差距同时PEG在上相间的表面张力增大从而降低了HB分配系数。在表所示的种体系中使用PEG的一组中HB主要分布在上相中其余种体系中HB均分布于下相之中。这是因为PEG相对分子质量越大相黏度越大HB的空间阻碍作用也就越强加剧HB向下相富集。另外PEG相对分子质量越大成相时间越长。对于PEG聚合物若想在上相收率较高应降低平均分子量若想在下相收率较高则增加平均分子量。()PEG浓度的选择周红航等在用聚乙二醇硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶的研究中在pH为、硫酸铵质量分数为不添加无机盐加入酶液体积为ml℃萃取h变化PEG质量分数组成双水相体系测定酶与蛋白质的分配系数及相比和萃取率。结果如表随着PEG质量分数的增加Ke和Ye都呈现出先增大后减小的趋势并且在PEG质量分数为时Ke和Ye都达到最大值在低PEG质量分数下相比R是逐渐减小的当PEG质量分数超过一定值时R又逐渐增大蛋白质的分配系数变化较为波动是呈减小、增大、减小的趋势。可见PEG浓度对体系的相比待分离的蛋白质和酶的分配系数萃取率都有影响。从分配理论上解释随PEG增加黏度增大阻止相间分子转移的能力增加相界面张力亦增加。当PEG用量较低时硫酸铵的盐析作用起主要作用使酶大部分分配在上相中。增大PEG含量相比增加上下相热力学特征差异更大不同物质的分配系数之间的差别也会增大。成相盐种类和浓度的选择魏玲等在PEG()NaHPO双水相体系在鹰嘴豆蛋白萃取中的应用的研究中考察了一部分成相盐及其浓度对双水相体系的影响。他们于一系列的比色管中分别加入PEG溶液ml再分别改变NaHPO、NaHPO、NaPO、NaBr、NaCl、NaSO、NaHSO在体系中的加入量测定了盐及盐的用量对体系形成的影响。结果表明NaBr、NaCl、NaHSO的分相范围较小且分相能力很差NaPO的分相能力较前种要好但容易形成三相这对提取蛋白质就有一定的影响。当NaSO加入大于g体系出现分相且成相情况较好。但较大浓度的盐溶液对蛋白质有盐析作用使蛋白质变性。且盐的使用量太大会增加成本。PEGNaHPO双水相体系比PEGNaHPO体系更易形成且当加入gNaHPO时相比接近于这样有利于萃取这可能是因为受NaHPO和NaHPO的酸度影响体系的酸度变化能明显的改变两相得电位差从而影响体系的形成。周红航等在聚乙二醇硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶的研究中固定PEG质量分数为pH值为不添加无机盐加入酶液体积为ml以不同质量分数的硫酸铵组成双水相体系℃萃取h测定酶与蛋白质的分配系数及相比和萃取率。结果如表:从表可以看出当PEG的量固定时在低成相盐质量分数内随着成相盐质量分数的增加酶的分配系数Ke在增加。当成相盐浓度超过一定范围(左右)时Ke又逐渐下降。在总体趋势中相比R和萃取率Ye在下降在低浓度时萃取率高是因为相比高。对总蛋白来说分配系数Kp波动幅度不大。对总蛋白的分配来说希望蛋白质尽量分配在下相中酶尽量分配在上相中这样可提高酶的纯度。此外酶分配系数均大于表明酶主要分配在上相。实验现象显示粗酶的大部分杂质趋向于分配在两相之间的界面处周晓云等在研究双水相体系提取脂肪酶的过程中也发现这一现象。成相盐用量不同上下相电位差不同而电位差的大小直接影响到分配系数和萃取率。另一方面成相盐的质量分数愈高会破坏酶表面的水化层则使酶发生盐析使酶的分配系数和萃取率下降另外盐浓度过高不仅影响蛋白质的表面疏水性而且扰乱双水相系统改变各相中成相物质的组成和相体积比。需要综合考虑后确定最佳成相盐用量。谢云飞等在用双水相体系分离血红蛋白(HB)的研究中也研究和探讨了成相盐浓度对蛋白质分离的影响。随着成相盐质量分数的增加HB的分配系数也随之上升。因为成相盐的质量分数增加体系中盐析作用增加HB趋向分配在PEG相。但当成相盐的质量分数过高时盐析作用过强HB将被部分或全部析出。另外成相盐质量分数增加PEG相体积会减少相比降低加上盐析作用损失HB造成HB回收率降低以及原料的浪费。pH的选择在蛋白质和酶的分离中pH首先通过影响蛋白质和酶的活性影响萃取效果。李凯等在双水相体系萃取精氨酸脱亚胺酶(ADI)的研究中探讨了pH对萃取效果的影响。pH对ADI酶活性的影响如图:结果表明pH对ADI的活力影响很大在pH<和pH>时大部分的酶活损失。对PEG硫酸铵体系而言上相带正电荷ADI的pI(等电点)=,当pH大于时ADI带负电荷有向上相扩散的趋势因此可选择pH=作为体系pH调节范围。其次通过影响蛋白质和酶的带电影响萃取效果。他们还以w(PEG)=硫酸铵w=为研究体系用盐酸氢氧化钠调节萃取pH萃取后调节上相体系pH=测定上相和下相的体积、两相蛋白含量和酶活结果如表所示。可以看出pH对ADI酶的萃取率和分配系数影响很大而对相比的影响很小。pH=随着pH的增大相比和分配系数Ka纯化系数Sa萃取率Da均相应增大。pH=时ADI的分配系数、纯化系数、萃取率均达到最大。当pH>后,由于大量的杂蛋白也同时带上负电荷向上相扩散使ADI的纯化系数开始下降。周红航等在聚乙二醇硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶的研究中也研究了pH对萃取的影响。在PEG质量分数为硫酸铵质量分数为加入酶液为ml变化pH值组成不同双水相体系℃萃取h测定酶与蛋白质的分配系数及相比和萃取率。结果见表:可见体系pH值对被萃取物的分配有很大影响。一是影响蛋白质分子中可离解基团的离解度而改变蛋白质分子所带电荷的性质和数量最适合pH值因酶和底物的不同而异而过大或过小均会引起酶变性降低酶活性从而影响酶的萃取率和分配系数二是影响双水相体系中盐的离解度而改变相间电位差如体系pH值与蛋白质的等电点相差越大蛋白质在两相中分配越不均匀pH值的微小变化甚可能使蛋白质分子的分配系数改变个数量级。在固定其它条件仅改变系统pH值时从表可以看出随着体系pH值的变化Ke先增后减在pH值为时出现极大点而Ye也达到最大从中也可以看出R的波动幅度不大Kp也是先增后减。对蛋白质一般的PEG无机盐体系是PEG相带正点当pH<等电点时蛋白质带正电在电位差的影响下向下相聚集使得分配系数较低当pH>等电点时蛋白带负电在电位差的影响下蛋白质更多聚集于上相中从而使得分配系数增大。但是过高或过低的pH都会引起蛋白本身空间结构的变化使之失去紧密的空间结构从而使可溶性降低表现为变性后出现沉淀。外加电解种类和浓度的选择因为中性盐正、负离子在两相间的分配系数不同当它们在两水相中电离时会在相界面处产生不同的相间电位从而影响蛋白质的分配系数。通常认为中性盐对生物大分子物质分配行为的影响主要由阴离子发挥作用而其阳离子效果一般。周红航等在聚乙二醇硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶的研究中在PEG质量分数为硫酸铵质量分数为pH值为加入酶液体积为ml变化NaCl质量分数组成不同双水相体系℃萃取h测定酶与蛋白质的分配系数及相比和萃取率。结果如表。随着NaCl浓度增加Ke和Kp呈现出减小的趋势而Y和R却呈现先减小后增加的趋势。这说明:虽然总蛋白的萃取率呈现先减小后增加的趋势但酶在上相中分配的比例却减少。文献报道无机盐对双水相体系的分离纯化有较大影响而且盐分的加入可以加快分相速度。其他影响因素的优化()温度温度首先影响相图在临界点附近尤为明显。但当远离临界点时温度影响较小。大规模生产常在常温操作但较高升温还是有利于降低体系黏度利于分相。涂绍勇等在双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究中固定PEG含量硫酸铵含量pH考察不同温度对木瓜蛋白酶分配系数的影响结果如图可知随着温度的升高木瓜蛋白酶的分配系数较常温下有所提高可能原因是温度上升分子运动加强从而降低了静电排斥作用使木瓜蛋白酶的分配系数增加当温度超过℃时分配系数降低可能原因是高温时容易使部分酶变性失活使分配系数降低。对蛋白质随着温度的上升萃取率也逐渐增大温度升高能够加速分子运动也可以增大蛋白质的溶解度。但温度太高会使蛋白质变性。()溶质加入量在双水相体系中当蛋白质量较低时分配行为才会起主导作用。随着蛋白质量的增加受蛋白的溶解度限制纯的分配行为出现偏差。谢云飞等在用双水相体系分离血红蛋白研究中考察的一定量的萃取体系中加入不同量蛋白质对萃取效果的影响结果如图:此外体系离子强度、萃取时间等因素也对萃取效果产生影响。PEG无机盐双水相体系在蛋白质和酶分离中的应用蛋白质和酶的分离及评价参数综合PEG无机盐双水相体系的几种影响因素可以看出它们主要是通过影响萃取体系的粘度温度溶液两相的极性、疏水性和相差距相内表面张力相间表面张力两相电位差待分离物质电性等来影响体系对蛋白质和酶的分离性能。对PEG种类即其平均相对分子质量的选择要选取对待分离物质活性尽量小的PEG分子质量增加会增加传质阻力从而减少待分离物质在PEG相的分配PEG分子质量还会增加两相疏水性差距从而对不同疏水性的待分离物质的选择性增加也有利于分相相对分子质量高选择性增加但萃取率低相对分子质量小选择性差但萃取率高PEG的分子质量增加还会增长成相时间。要根据不同的分离对象和分离要求合理选取PEG种类。对PEG的质量分数当PEG用量较低时无机盐的盐析作用起主要作用使酶大部分分配在上相中萃取率高增大PEG含量相比增加上下相热力学特征差异更大不同物质的分配系数之间的差别也会增大选择性增加但PEG质量分数超过一定程度萃取相极性下降太多使极性过高的成相盐溶解度下降甚至不溶破坏了双水相成相条件。不同的无机盐分相范围和分相能力不同需要选择合适的成相盐。成相盐质量分数增加体系中盐析作用增加蛋白质趋向分配在PEG相萃取率增高。但当成相盐质量分数过高时盐析作用过强蛋白质将被部分或全部析出且相比降低造成萃取率降低。成相盐用量不同上下相电位差不同而电位差的大小直接影响到分配系数和萃取率。pH值对被萃取物的分配有很大影响。一是影响蛋白质分子中可离解基团的离解度而改变蛋白质分子所带电荷的性质和数量最适合pH值因酶和底物的不同而异而过大或过小均会引起酶变性降低酶活性从而影响酶的萃取率和分配系数二是影响双水相体系中盐的离解度而改变相间电位差体系pH值与蛋白质的等电点相差越大蛋白质在两相中分配越不均匀pH值的微小变化甚可能使蛋白质分子的分配系数改变个数量级。对不同的分离对象要选取合适的pH。在双水相体系中加入电解质其阴阳离子在两相间会有不同的分配形成相间电势差对双水相体系的分离纯化有较大影响而且盐的加入可以加快分相速度但是增加到一定的程度后萃取相极性增强酶的溶解度下降而发生盐析现象蛋白质倾向于分配到下相分配系数和萃取率明显下降。萃取温度:温度首先影响相图在临界点附近尤为明显。但当远离临界点时温度影响较小。大规模生产常在常温操作但较高升温还是有利于降低体系黏度利于分相。随着温度的上升分配系数和萃取率也逐渐增大温度升高能够加速分子运动也可以增大蛋白质的溶解度但温度太高会使蛋白质变性。在双水相体系中当底液质量较低时分配行为才会起主导作用。随着底液质量的增加受蛋白质的溶解度限制纯的分配行为出现偏差。对一定量的萃取体系要选择合适的单次处理量。蛋白质和酶的分离根据不同用途有不同的要求有的追求高的萃取率即收率只要求和底液分离有要求高的纯化倍数要求能和性质相似的蛋白分离。PEG无机盐双水相体系对蛋白质和酶的萃取主要由以下性能参数:相比:R=V上V下其中V上为上相PEG相的体积V下为下相盐相的体积分配系数:K=C上C下其中C上为待分离物在上相中的浓度C下为待分离物在下相中的浓度对酶有:酶分配系数:Ke=上相酶活下相酶活对蛋白质有:蛋白质分配系数:Kp=上相蛋白质浓度下相蛋白质质量分数萃取率:Y=RK(RK)×比酶活=酶活蛋白含量纯化倍数=上相比酶活原酶比酶活PEG无机盐双水相体系在蛋白质和酶分离中的应用姜彬等在PEG盐双水相体系萃取小麦酯酶的研究中采用PEGNaHPO双水相体系分离提取小麦中的植物酯酶对构成双水相体系中的PEG分子量、浓度、pH、无机盐类型及浓度对萃取效果的影响进行了分析。确定了双水相组成体系为:PEG(质量比)和NaHPO(质量比)pH=在此体系中小麦的植物酯酶主要分布在上相分配系数K=纯化倍数达到回收率。游见明等在从发酵液中直接提取柚苷酶的研究中用双水相萃取方法直接从发酵液中提取柚苷酶进行了实验就聚乙二醇硫酸铵双水相系统中的聚乙二醇相对分子量、聚乙二醇浓度、硫酸铵浓度、无机盐的添加等因素对柚苷酶的分配行为的影响进行了探索。结果显示:在用浓度为~的PEG与浓度为~硫酸铵和氯化钠组成的双水相体系中柚苷酶的分配系数达以上酶活力回收率达提纯倍数为。周红航等在聚乙二醇硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶的研究中采用聚乙二醇(PEG)硫酸铵双水相体系对猪胰蛋白酶分离进行了研究。通过综合考察酶分配系数、蛋白质分配系数、相比和回收率探讨了PEG质量分数、硫酸铵质量分数、NaCl质量分数以及pH值对胰蛋白酶萃取的影响并通过正交实验进一步优化实验条件结果表明硫酸铵质量分数和PEG浓度对胰蛋白酶的萃取影响大在PEG质量分数为、硫酸铵质量分数为、pH值为所组成的双水相体系下可获得酶的高分配系数提取的胰蛋白酶活力达到Uml。周念波等在PEG(NH)SO双水相萃取法提取壳聚糖酶的研究中采用PEG(NH)SO双水相体系直接从BacillusspLS发酵液上清液中分离壳聚糖酶。研究了体系中PEG分子量、PEG质量分数、(NH)SO质量分数、NaCl质量分数和pH值对壳聚糖酶分配系数及萃取率的影响。结果表明,室温下双水相萃取最佳条件为:PEG、(NH)SO、NaCl、pH值在此条件下壳聚糖酶分配系数达萃取率达。涂绍勇等在双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究中对以PEG(NH)SO为双水相系统提取的木瓜蛋白酶进行了研究。实验考察了不同分子量PEG对木瓜蛋白酶活性的影响以及PEG浓度、(NH)SO浓度、pH和温度对木瓜蛋白酶分配系数的影响。结果表明:双水相体系最佳条件为PEG(NH)SOPh和温度℃。在上述条件下木瓜蛋白酶的分配系数可达。GiselaTubio,GuillermoA等利用PEG柠檬酸钠双水相体系从牛胰腺中萃取胰蛋白酶。实验探讨从α胰凝乳蛋白酶中分离胰蛋白酶的最佳条件然后将其应用到从牛胰腺中分离胰蛋白酶。实验最佳条件为:PEG(ww)与柠檬酸钠组成双水相体系在pH值为时具有最佳分配性能。增加NaCl的浓度到以及减少相比到时能在上相获得的胰蛋白酶是纯化前的倍。胰蛋白酶质量浓度增大到整个体系(ww)时对产率和纯化因子都没有特别大的影响。因此能证明该双水相的灵活性以及将其应用到规模生产的前景。SaroteNitsawangRajniHattiKaul等利用(ww)的PEG及(ww)的(NH)SO组成的双水相体系从番木瓜乳浆中萃取木瓜蛋白酶这种方法能在较短的时间内获得高纯度的木瓜蛋白酶并且不会破坏酶的成分同时在分离时可以直接使用木瓜胶乳而不需要除去其它可溶性的物质这种更快更简单以及稳定性好的方法能大规模地应用到木瓜蛋白酶的萃取当中去。Mirjana、GAntov等人用(ww)PEG和(ww)(NH)SO作为双水相体系萃取木聚糖酶。当酶的初级制品浓度为(ww)调节pH值在的条件下分配系数和上相产率分别达到了和纯化因子为。实验结果表明了把双水相体系作为下游过程分离纯化木聚糖酶的可行性。Lorena、Capezio等用聚乙二醇磷酸盐双水相体系分离转基因牛奶中的乳清蛋白。研究了牛奶乳清蛋白中种成分牛血清白蛋白(BSA)、α乳清蛋白(ALA)、β乳球蛋白(BLG)、α抗胰蛋白酶(AAT)在双水相体系中的分配行为。BSA和ALA富集在PEG相分离系数分别达到了和BLG和AAT对磷酸盐相更具有亲和性分离系数分别为和。pH值增大会使这些蛋白质的分离系数增加然而PEG分子量的增加使分离系数减少。使用PEG以及在pH值为相比R为:时对于AAT能达到最佳萃取条件产率达到纯化因子为之间。董海莉等在双水相法萃取分离α淀粉酶体系的初步研究中采用PEG(NH)SO双水相体系对双水相萃取法分离纯化米曲霉α淀粉酶进行了研究探讨了PEG分子量、pH值、PEG浓度、(NH)SO浓度、NaCl浓度对α淀粉酶的分配系数及回收率的影响并通过正交实验确定了几个因素的最优组合。结果发现在pH=PEG浓度(重量比)(NH)SO浓度加入NaCl溶液的双水相体系中α淀粉酶分配系数酶回收率。杨建军等在双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶的研究中对南极假丝酵母脂肪酶(CAL)在双水相中的分配情况进行了研究,考察了温度、聚乙二醇(PEG)相对分子质量、NaCl质量分数和(NH)SO质量分数对分配系数K(CAL)的影响。结果表明:温度对K(CAL)影响不大低相对分子质量PEG与蛋白质的疏水作用可促进CAL的分配两相间电势差等对分配平衡、有较大影响。在PEG(NH)SO双水相体系中,CAL最佳的萃取分离条件为:室温下质量分数PEG(NH)SONaCl此时K(CAL)为CAL回收率为。陈利梅等在PEG(NH)SO双水相体系萃取葡萄糖氧化酶的研究中采用聚乙二醇硫酸铵双水相体系对葡萄糖氧化酶的萃取进行了研究。以双水相系统的上、下相的酶活、比酶活、相比R、分配系数K和萃取率Y等为参数探讨了PEG质量分数、不同PEG浓度和不同硫酸铵浓度对葡萄糖氧化酶在PEG(NH)SO双水相系统中分配行为的影响。实验结果表明:葡萄糖氧化酶在的PEG和硫酸铵的双水相体系中可获得较高的萃取率达分配系数为。苏玉春等双水相法提取木聚糖酶的初步研究中用双水相法从黑曲霉AS的发酵液中提取木聚糖酶通过正交试验对双水相的组成进行优化。结果表明双水箱体系最佳组成为:选用PEG其浓度为(WW)磷酸氢二钾浓度为(WW)氯化钠浓度为(WW)。此条件下木聚糖酶的提取效果较好分离系数和上相产率分别为和。杜学敏等在双水相提取糖化酶的研究中利用PEG(NH)SO双水相系统从粗酶液中提取糖化酶。研究了PEG、(NH)SO、NaCl溶液浓度对糖化酶分配系数、回收率以及分相时间的影响确定了提取糖化酶的最佳条件即PEG溶液浓度为(NH)SO溶液浓度为时分配系数最小为糖化酶回收率最高为。乐薇等在双水相体系萃取木瓜蛋白酶的研究中采用聚乙二醇(PEG)(NH)SO双水相体系对木瓜蛋白酶进行萃取分离研究了PEG相对分子量、PEG质量分数、(NH)SO质量分数和pH值对木瓜蛋白酶分配系数及酶活力回收率的影响。结果表明,最佳萃取条件为:PEG质量分数、(NH)SO质量分数、pH值在此条件下木瓜蛋白酶的酶活力回收率为分配系数为。舒国伟等在双水相体系萃取纤维素酶的研究中研究了PEG(NH)SO双水相体系中PEG浓度(NH)SO浓度及pH对从商品纤维素酶样品中萃取纤维素酶的影响结果表明:双水相体系的质量组成为(NH)SOPEGpH时分配系数为萃取率为。冯菁等在人溶菌酶的双水相萃取法分离的研究中采用双水相体系直接从重组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶研究了体系中聚乙二醇(PEG)平均分子量,PEG、硫酸钠和氯化钠浓度pH对人溶菌酶和总蛋白的分配系数、相体积比、萃取率和纯化因子的影响。结果表明:在PEG、NaSO和NaCl质量分数分别为、、pH为时在室温下的双水相萃取率达纯化因子为。李静等在双水相体系在糖化酶提取纯化中的应用研究中对PEGKHPO、PEG(NH)SO和PEGMgSO三种体系进行了研究。通过制作相图分析得出PEG(NH)SO双水相体系是萃取糖化酶最合适的体系。并且研究了PEG分子量、PEG溶液浓度(NH)SO溶液浓度对糖化酶分配系数和回收率的影响确定了萃取糖化酶的最佳条件即PEG分子量为、PEG溶液浓度、(NH)SO溶液浓度为时分配系数为糖化酶回收率最高为。谢云飞等在用双水相体系分离血红蛋白的研究中利用聚乙二醇(PEG)硫酸铵双水相系统分离纯化盐析得到了血红蛋白(HB)样品考察了PEG相对分子质量、PEG质量分数、(NH)SO质量分数、pH、温度等因素对HB分离的影响。结果表明PEG双水相系统的最佳分离条件为:PEG=(NH)SO=pH=温度为℃。在此条件下HB分配系数可达到回收率可以达到纯度达到。冯自立等在无花果蛋白酶在PEG(NH)SO双水相体系中的分配行为的研究中考察了PEG相对分子质量、成相物质量分数、pH值、温度对无花果蛋白酶在两相体系中分配系数的影响。结果表明:当两相体系中PEG相对分子质量为、PEG质量分数为、(NH)SO质量分数为、pH值为、温度室温(℃)时蛋白酶在两相体系中分配系数最高可达。LRRodrigues等研究了PEG(NH)SO双水相体系中α乳白蛋白和β乳球蛋白的分离纯化在PEG(NH)SOpH条件下α乳白蛋白和β乳球蛋白的分配系数和回收率分别为:和和。在干酪乳清的分离纯化中可以降低一半的成本。PEG(NH)SOpH条件下也能经济的分离干酪乳清的蛋白质。KuenShanJaw等研究了PEG磷酸盐双水相体系分离甘薯中胰蛋白酶抑制剂在PEG浓度为(wv)磷酸盐浓度为(wv)KCl浓度为(wv)pH时胰蛋白酶抑制剂纯化系数增加了倍回收率为。JianminXing等在双水相法和超滤法结合分离纯化芦荟多糖的研究中在第一步用到了PEG硫酸铵pH和MNaCl形成的双水相体系。NuntiyaWongmongkol等在PEG磷酸盐双水相分离碱性蛋白酶的研究中在pHPEG磷酸钾(ww)的条件下获得了的高分配系数和的萃取率。WenboZhi等在枯草芽孢杆菌培养液上清液中初步纯化α淀粉酶的研究中在pH下在PEG柠檬酸盐体系中的纯化系数和的收率。PEG柠檬酸盐体系中加入氯化钠后纯化系数增加到收率许多蛋白在PEG和盐组成的双水相体系中有相同的分配行为。Vaidya等认为小分子质量的PEG不适合分离蛋白质。PEG无机盐双水相体系在生物工程中的分离流程双水相体系已经被广泛的应用于生物大分子,如蛋白质、核酸和抗生素等的提取和纯化过程中。在生物产品的生产中分离过程占成本的而双水相萃取技术以其廉价、易于工程放大和连续操作的优点在工业中有很大德应用价值。在进行工业上大规模分离纯化操作时要特别注意原料的回收利用这样既有利于环保又节约了成本。PEG的回收有两种方法:一种是加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收另一种是将PEG相通过离子交换树脂用洗脱剂先洗去PEG再洗出蛋白质。常用的方法是将第一步萃取的PEG相或除去部分蛋白质的PEG相循环利用。无机盐的循环:将盐相冷却结晶然后用离心机离心进行分离回收。其它方法有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。以下是PEG无机盐双水相体系在生物工程中的分离流程其中料液加入双水相体系前需打碎以使细胞内的产物游离出来。结语在双水相系统中有许多因素影响分配系数包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等。尽管目前对聚合物溶液浓度热力学引起的生物大分子在两相间不规则扩散的机理还不清楚还没有相应的理论指导设计特定生物大分子的分配系统但是利用双水相技术通过大量实验研究是可以获得特定生物大分子最适宜分离的相系统和最优分配的。与传统溶剂萃取相比双水相萃取最大的优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的环境在萃取过程中保持生物物质的活性及构象而且双水相萃取还有收率高、成本低、可连续化操作等优点现已被广泛的应用于生物化学产品的分离和提取尤其在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化方面备受关注。分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质向来是一项艰巨的工作。由于蛋白质的市场价格昂贵如能提高回收率将带来巨大的经济效益所以有关蛋白质在分离纯化中的失活及其对策成为近年来研究的热点而双水相萃取技术也因此得到了广泛的关注然而该在应用和研究过程中也有一些技术难题:易乳化、相分离时间长成相聚合物的成本较高水溶性高聚物大多数粘度较大不易定量控制水溶性的高聚物难以挥发使反萃必不可少高聚物回收困难等而且目前对于双水相体系的双水相动力学研究、双水相萃取设备流程研究、成相聚合物的重复使用等方面相关文献报道比较少有待于进一步研究和开发。随着对双水相体系研究的深入以及其他双水相体系的不断开发其形成机理热力学模型、动力学模型以及工艺技术等方面的问题最终会被突破和解决其应用领域将进一步拓宽。参考文献JosefinePersson,HansOlofJohansson,etalAqueouspolymertwophasesystemsformedbynewthermoseparatingpolymersJBioseparation,,():AnitaJain,BNJohriPartitioningofanextracellularxylanaseproducedbyathermophilicfungusMelanocarpusalbomycesIISinanaqueoustwophasesystemJBioresourceTechnology,,:GerbenMZijlstra,CornelisDdeGooijer,JohannesTramperExtractivebioconversionsinaqueoustwophasesystemsJCurrentOpinioninBiotechnology,,():ArmandoVenâncio,CatarinaAlmeida,JoséATeixeiraEnzymepurificationwithaqueoustwophasesystemscomparisonbetweensystemscomposedofpurepolymersandsystemscomposedofcrudepolymersJJournalofChromatographyB,,:BAAndrews,JAAsenjoProteinpartitioningequilibriumbetweentheaqueouspoly(ethyleneglycol)andsaltphasesandthesolidproteinphaseinpoly(ethyleneglycol)salttwophasesystemsJJournalofChromatographyB,,:LauraBulgariu,DumitruBulgariuExtractionofmealionsinaqueouspolyethyleneglycol–inorganicsalttwophasesystemsinthepresenceofinorganicextractants:CorrelationbetweenextractionbehaviourandstabilityconstantsofextractedspeciesJJournalofChromatographyA,,():汪家鼎,陈家镛溶剂萃取手册M北京:化学工业出版社,:戴猷元新型萃取分离技术的发展及应用M北京:化学工业出版社,:王志辉,朱建航,郑楠,等葛根素在乙醇硫酸铵两水相体系中的分配特性J时珍国医国药,,():张春秀,胡小玲,卢锦花,等双水相萃取法富集分离银杏叶浸取液的探讨J化学研究与应用,,():周红航,王维香聚乙二醇硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶J化工进展,,():房耀维,刘姝,吕明生,等双水相萃取法分离低温α淀粉酶的研究J食品科学,,():冯自立,马娜无花果蛋白酶在PEG(NH)SO双水相体系中的分配行为J食品科学,,():谢云飞,常雅宁,谢志镭,等用双水相体系分离血红蛋白(HB)J华东理工大学学报:自然科学版,,():魏玲,李学琴,孟宪锋,等PEG()NaHPO双水相体系在鹰嘴豆蛋白萃取中的应用J食品研究与开发,,():舒国伟,王长凤,陈合,等双水相体系萃取纤维素酶的研究J食品科技,,():郭会灿双水相萃取技术及其在药物分离中的应用J河北化工,,()::周念波,周吉祥,涂绍勇,等PEG(NH)SO双水相萃取法提取壳聚糖酶的研究J化学与生物工程,,():涂绍勇,李路,杨爱华,等双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究J食品工业科技,,NataliaLuizaPennaDallora,JoaoGabrielDe

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/29

双水相萃取体系及其在蛋白质和酶分离中的应用

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利