第九章_外源基因的表达和检测

null转基因植株的鉴定及 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 转基因植株的鉴定及分析转基因植物的筛选与检测转基因植物的筛选与检测 无论使用哪种转基因方法，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数。为获得真正的转基因植株，需要进行以下工作： 第一步工作是筛选转化细胞。 在含有选择压力的培养基上诱导转化细胞分化，形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形成转化植株。 第二步是对转化植株进行分子生物学鉴定。 第三步是进行性状鉴定及外源基因的表达调控研究。 转基因植株的鉴定及分析转基因植株的鉴定及分析一、抗性基因检测法 二、 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因检测法 三、分子生物学检测法 PCR Southern blot Northern blot Western blot一、抗性基因一、抗性基因抗性基因应满足以下几点： 1、抗性基因应是显性基因； 2、在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。 3、抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或发育有抑制作用。 4、选择物价廉易得。1、抗生素抗性基因1、抗生素抗性基因（1）npt新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、巴龙霉素、新霉素具有抗性。 （2）aphⅣ潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性。 （3）spt链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性。 （4）cat氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗生素活性。氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）氯霉素乙酰转移酶的编码基因cat，是位于大肠杆菌转座子Tn9上的一种抗药基因。它在真核细胞中并不存在，这一特性使其成为真核生物表达调控研究中最早使用的报告基因之一。2、抗除草剂基因2、抗除草剂基因除草剂抗性基因在植物遗传转化中可同时用作选择标记和培养抗除草剂的作物。 抗除草剂基因主要有抗 ppt 关于艾滋病ppt课件精益管理ppt下载地图下载ppt可编辑假如ppt教学课件下载triz基础知识ppt 的bar和pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。载体构建中常用的报告基因载体构建中常用的报告基因 报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。二、显色或发光报告基因nullReporter genes demonstrate transgene expression in plant tissues 载体构建中常用的报告基因载体构建中常用的报告基因 报告基因的作用 对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞作进一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体； 是在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到表达； 被用于启动子表达特性的评估和亚细胞区间的研究分析等。载体构建中常用的报告基因载体构建中常用的报告基因 必须具备以下五个条件： 已被克隆和全序列已测定； 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶； 基因较小，可构成嵌合基因； 能在转化体中得到充分表达； 检测容易，并且能定量分析。报告基因报告基因1、绿色荧光蛋白基因 （GFP green fluorescence protein） 2、B-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因b-D-glucuronidase） 3、荧光素酶基因（LUC fire fly luciferase） 4、冠瘿碱opine基因nullnullnullnullnullnullnull绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP cDNA开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长（395nm）或蓝光照射（490nm）下发出绿色荧光（508nm）。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。GFP transgeniuc 9.5 dpc mouse embryo nullTwo cuttings of canola (Brassica napus) the one on the left is engineered with mGFP5-ER (courtesy of Jim Haseloff, Cambridge Univ.) under the control of the CaMV 35S promoter. The one on the right is wild type. These samples were viewed with the Illumatool Tunable Lighting System LT-9500 with the excitation light at 470nm, emission long pass filter at 515nm. nullnullnullLeft, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of fluorescent images of a GFP-transformed Arabidopsis root, viewed under fluorescent conditions. green box = mean green level inside the syncytium; blue box = mean green level outside the syncytium. null -葡萄糖苷酶(-Glucuronidase,GUS)能催化裂解一系列的-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。gus基因（-葡萄糖苷酸酶基因）B-glucuronidase (GUS)B-glucuronidase (GUS)GUS酶的底物是无色的X-葡萄糖苷酸（X-glucuronide, X-gluc) GUS酶的显色反应以底物不同而不同： 5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 靛蓝 5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 橘红 4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide 荧光产物null GUS基因广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是在研究外源基因瞬时表达转化实验中。 GUS基因的最大优点是它能研究外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。nullnullnull组织化学染色法：利用该酶催化底物为X-Gluc (5-bromo-4-choro-3-indoyl--D-Glucuionic acid)发生反应，发生蓝色沉淀。Blue shoots of Eucalyptus occidentalis expressing the GUS gene Histochemical analysis of a gene trap transposant. The blue colour reveals gene expression in the base of lateral branches in the inflorescence stem, and in the developing sepals of flowers. null分光光度计、荧光计：催化底物4-甲基伞形酮基-葡萄糖酸苷生成发荧光（=455nm）的产物4-甲基伞形酮。检测方法检测方法用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性组织化学染色定位法组织化学染色定位法该方法是将底物浸入被测的植物组织。 将被检 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质。 初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色。 注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色程度不能准确反映Gus活性。nullFigure 1 Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activitynullTransgenic Arabidopsis stained for GUS activity showing promoter activity of the constitutive promoter CaMV35S and the PsMTA promoter from peanullPattern of atao1 activity visualized by GUS expression following infection with either H. schachtii or M.incognita. Left The atao1 promoter drives GUS expression at the boundary of the symcytium of H. schachtii (n). Right In a gall induced by M. incognita (n) the disrupted vasculature shows strong expression of GUS driven by atao1 (gc, giant cells). 荧光素酶基因（LUC）荧光素酶基因（LUC）1986年以来，荧光素酶基因被广泛地用作植物基因工程研究的一种新的报告基因。 最常用的是来自荧火虫的荧光素酶。 分子量为60.7 KD的单体蛋白质多肽，共有550个氨基酸，它编码的基因luc已经被克隆； 在转染的细胞中，荧光素酶蛋白质的半衰期比较短，其适用于做瞬时分析。荧光素酶活性测定荧光素酶活性测定先用去污剂处理细胞使之裂解，然后加入ATP、Mg2+离子和荧火虫的荧光素，于是在有氧的条件下，荧光素酶会催化荧光素进行氧化反应，产生出AMP、CO2和黄-绿色的光。利用发光计对荧光素酶反应作出定量测定。null 冠瘿碱opine基因 Nos和Ocs基因不在细菌中表达，故它们在植物组织中的出现，通常是转化已发生的很好证据。 优点：检测和分析非常快、简单和廉价 缺点：受伤的植物组织有时能产生冠瘿碱null冠瘿碱合成酶基因 冠瘿碱是正常植物不存在的单一的氨基酸衍生物。它们是由T-DNA区的冠瘿碱合成酶基因编码的冠瘿碱合成酶合成的。 如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，菲醌染色后在紫外光下观察荧光即可。三、分子生物学检测方法三、分子生物学检测方法 为了验证外源基因整合到染色体， 我们采用PCR技术和Southern杂交技术。 为了验证外源基因是否表达， 我们采用RT-PCR技术、Northern杂交技术和 Western杂交技术。PCR检验外源基因PCR检验外源基因 在转基因个体的检测中，通过设计外源基因两端的特异引物，采用PCR技术可以使外源基因得到大量扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测特异扩增条带的有无，从而判断外源基因是否整合到受体植物的基因组。 优点：由于对 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA的要求少，适合与转基因个体的早期检测。 缺点：容易受到外界因素的干扰，易出现假阳性，需采用Southern杂交进一步验证。null分子杂交分子杂交核酸杂交：两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。 分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。nullSouthern印迹杂交 Southern印迹杂交 Southern blot DNA杂交由 E.Southern于1975年提出。 DNA琼脂糖凝胶电泳 转移到NC膜上 DNA或RNA探针杂交 放射自显影显杂交带 Southern印迹杂交，有时又称为DNA印迹杂交或Southern DNA印迹杂交等。 null它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。null其基本步骤是： 1、固定 将待检测的DNA样品固定在固相载体上。 2、杂交 与标记的核酸探针进行杂交， 3、显带 在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。null通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度、多寡。 该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。Southern杂交Southern杂交纪念发明者—— Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析null在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是应用最广的一种固相支持物，但它也存在一些不足之处： 第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固。 第二、硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎(待别是经烘烤后)。 第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。 第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。硝酸纤维素滤膜尼龙膜尼龙膜现在人们更倾向于使用尼龙膜。 尼龙膜结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合，经烘烤或紫外线照射后，这种结合更加牢固。同时尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。但其杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高，这可通过增加预杂交液中的非待异性封闭试剂用量的方法加以克服。Northern印迹杂交 Northern印迹杂交 Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后、从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法，又称为Northern RNA印迹杂交等。 该法是在southern印迹杂交基础上发展起来的，主要针对RNA分子的检测，基本步骤与southern印迹杂交相似。 但RNA分子与DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处理。nullNorthern杂交是研究基因表达的最严谨的方法之一，可以定量分析组织中某一特异mRNA的表达丰度，根据其迁移的位置也可判断基因分子大小。这一技术应用十分广泛，常用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异及病理研究。 注意：需在变性条件下电泳，防止RNA形成二级结构。null在RNA变性凝胶电泳中常用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。 nullnull谢谢！