动脉粥样硬化家兔主动脉中胶原和基质金属蛋白酶的变化及PACAP的影响

基础研究 　3 国家自然科学基金资助项目 (编号 : 30240076) 　△通讯作者。电话 : 020 - 85220254; E - mail: qingchangv@163. net 动脉粥样硬化家兔主动脉中胶原和基质金属 蛋白酶的变化及 PACAP的影响 3 程增兰 　常青△ 暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室 (广州 510632) 　　【摘要 】　目的 　通过观察胶原和 MMP - 2在动脉粥样硬化 (AS)家兔主动脉中的变化 ,探讨 AS过程中垂体 腺苷酸环化酶激活肽 ( PACAP)的干预作用。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 　雄性新西兰家兔 60只 ,随机等分为正常对照组 (C组 )、AS模 型组 (AS组 )和 PACAP干预组 ( P组 )。分别于实验的第 4, 8, 12周末随机处死每组家兔各 5～8只 ,取胸主动脉固 定 ,常规石蜡切片 ,行 HE染色、Masson染色及免疫组化染色 ,光镜下观察主动脉的组织学变化、胶原的变化和 MMP - 2的表达并利用图像 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 系统对胶原进行半定量。结果 　与 C组相比 , AS组及 P组主动脉斑块检出率及 斑块内胶原容积分数处于上升趋势 , MMP - 2在斑块内阳性表达也呈增强趋势 ,但 P组的斑块检出率、胶原容积 分数及 MMP - 2的表达强度均低于同期 AS组水平。结论 　PACAP可能通过抑制内膜中胶原沉积从而发挥抗 AS 的效应。 【关键词 】　动脉粥样硬化 　垂体腺苷酸环化酶激活肽 　胶原 　细胞外基质 　基质金属蛋白酶 - 2 The changes of collagen and M M P - 2 in a therosclerotic rabb it aorta and effect of PACAP　CHENG Zeng - lan, CHANG Q ing. D epartm en t of H istology and Em bryology, M edical College of J inan U niversity, Guangzhou, 510632, Ch ina 　　【Abstract】　O bjective　To observe the changes of collagen and MMP - 2 in atherosclerosis and to study the effect of PACAP. M ethods　60 male New Zealand rabbits were equally random ly divided into 3 group s: control group ( C group) and atherosclerosis model group (AS group ) and PACAP intervention group ( P group ). A t the 4 th, 8 th, 12 th weekends of the experiment, 5～8 animals in each group were sacrificed, and arterieswere harvested for paraffin sections. Sections were stained with hematoxylin - eosin and Masson separately, the distribution of collagen were exam ined and ana2 lyzed quantitatively with computer system and MMP - 2 was detected by immunohistochem isty. Results　Comparing with the C group, the content of both collagen and percentage of p laque formation in AS group and P group increased in aortic intimae, the exp ression of MMP - 2 was increased in AS group and P group, but P group was lower than those in AS group. Conclusion　PACAP may have good effect on AS by decrease of collage in aortic intimae. 【Key words】　A therosclerosis　PACAP　Collagen　Extracellular matrix　Matrix metallop roteinase - 2 　　动脉粥样硬化 ( atherosclerosis, AS)是严重危害人 类健康的疾病 ,其发病机制尚未完全阐明。胶原作为 血管壁细胞外基质 ( extracellular matrix, ECM )中主要 成分 , 在 AS过程中伴有质和量的变化。近年来胶原 合成与分泌对 AS血管壁胶原网络的作用成为研究热 点 ,胶原因沉积异常作为导致 AS的一种独立危险因素 而被重新认识 [ 1 ]。基质金属蛋白酶 (matrix metallop ro2 teinases,MMP)是降解胶原的主要酶类 ,近年研究认为 其与 AS关系密切。笔者前期研究结果证实垂体腺苷 酸环化酶激活肽 ( p ituitary adenylate cyclase activating polypep tide, PACAP)具有抗 AS效应 ,可通过对心肌胶 原网络的调节对心脏重塑起到干预作用 ,但其对 AS形 成过程中血管壁胶原的影响尚不清楚。本实验通过建 立 AS模型 ,拟探讨 AS过程中胶原、MMP - 2的变化及 PACAP的干预作用。 1　材料与方法 1. 1　材料　胆固醇 (广州器化医疗设备公司 , 进口分 装 , 批号 030708) ,MMP - 2一抗工作液 (北京博奥森 公司 ) , S - P试剂盒及 DAB显色剂 (福州迈新生物技 术开发有限公司 ) , 显微图像分析系统 ( Leica - Q900MC)。 1. 2　方法 1. 2. 1　动物模型的建立　新西兰雄性家兔 60只 (购自 广州穗北实验动物养殖场 ,合格证号 2003A015) ,体重 2110～2115 kg,随机等分为 3组 : ①正常对照组 (C组 ) :喂饲普通颗粒兔饲料 ; ②AS模型组 (AS组 ) :喂饲含 胆固醇饲料 ,每只兔每天进食 115 g胆固醇 ; ③PACAP干 预组 ( P组 ) :除喂饲高胆固醇饲料外 ,另从耳缘静脉注 射 PACAP,使药物血浆终浓度约为 10 - 8 mol/L,每周 3 次。实验共进行 12周。 1. 2. 2　标本的采集和处理 　分别于实验的第 4, 8, 12 周末 ,用气体栓塞法随机处死每组家兔各 5～8 只 ,取 胸主动脉 , 生理盐水洗净后 ,置于中性甲醛溶液固定 , 常规脱水、透明、石蜡包埋、切片。 ·7011·广东医学　2008年 7月 第 29卷第 7期　 Guangdong M ed ica l Journa l　Jul. 2008, Vol. 29, No. 7 gxh 高亮 gxh 高亮 gxh 高亮 gxh 高亮 gxh 高亮 gxh 高亮 gxh 高亮 1. 2. 3　组织形态学观察 　常规 HE染色的切片在普 通光镜下观察主动脉组织形态学改变。 1. 2. 4　组织化学及免疫组织化学 　Masson染色观察 血管壁胶原含量的变化 ,并利用图像分析系统计算斑 块内胶原的容积分数。MMP - 2免疫组化染色按试剂 盒 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作 ,镜下观察 MMP - 2的表达情况。 1. 3　统计学方法 　采用 SPSS 1310 统计软件进行单 因素方差分析 ,组间两两比较用 q检验。 2　结果 2. 1　主动脉组织学观察 　光镜下可见 C组主动脉内 膜表面由内皮细胞衬附 ,光滑平整 ,管壁未见异常。AS 组与 P组 4周末时内膜开始增生 , 内弹性膜基本完 整 ,未见明显断裂 ,部分血管可见小斑块隆于管腔表 面。8周末时 AS组及 P组内膜明显增厚 ,内皮细胞缺 失 , AS组形成较大的偏心性斑块 ,内膜中富含泡沫细 胞同时可见红染的 ECM。12周末时 AS组病变严重 , 以内膜增厚为主 ,可形成同心性大斑块覆盖于管腔表 面 ,斑块深部中膜与内膜交界处泡沫细胞丰富 ,斑块浅 层可见密集的 ECM。观察发现 P组各时间点病变范 围及斑块大小大多小于同期 AS组 ,于 12周末时未见 形成严重病变。AS组及 P组主动脉头段斑块检出率 结果见表 1。 表 1　AS组与 P组各时间点头段斑块检出率 % 时间 AS组 P组 4周末 66. 67 (4 /6) 60. 00 (3 /5) 8周末 87. 50 (7 /8) 83. 33 (5 /6) 12周末 100. 00 (8 /8) 80. 00 (4 /5) 　括号内数字为计数的血管数 ,分子为有斑块出现的血管数 ,分母为 总血管数 2. 2　组织化学染色结果 　经 Masson染色后 ,切片中 见平滑肌纤维呈红色 ,胶原纤维呈蓝色。C组主动脉 内膜处胶原着色较淡 ,中膜胶原呈粗细不等的条状或 波浪状环行排列 ,平滑肌肌纤维散在分布其间 (图 1)。 与 C组相比 , AS组及 P组主动脉内膜胶原含量增多 , 不同时间点内膜胶原含量变化及分布均有不同。AS 组与 P组 4周末时 ,小斑块中有胶原沉积 ,数量较少呈 丝状 ,散在分布 ,中膜胶原排列稍紊乱。8周末时 ,斑 块内胶原沉积增多且胶原增粗 ,胶原明显交织成网状 排列 ,其间可见大量的脂质空泡 ,中膜胶原较稀疏、排 列紊乱。12周末 AS组斑块内出现大量蓝染的胶原纤 维 , 呈条索状分布 ,占据内膜体积的大部分 ,中膜胶原 稀疏、排列明显紊乱。观察中发现 P组与同期 AS组相 比 ,内膜胶原沉积不如 AS组显著 ,以 12周末时的变化 尤为显著 (图 2～3)。实验中发现胶原的分布存在一 定规律 :在斑块近浅层部位胶原比较密集 ,而在斑块深 部胶原比较稀疏同时该部位可见多量脂质空泡 ,与 HE 染色显示的 ECM的分布结果相一致。AS组及 P组各 时间点胶原容积分数的比较见表 2。 表 2　主动脉头段斑块内胶原容积分数 ( €x ±s) % 时间 AS组 P组 4周末 22. 45 ±5. 15 20. 65 ±3. 26 8周末 36. 01 ±6. 87△ 30. 57 ±4. 183 △ 12周末 48. 15 ±5. 74△▲ 32. 46 ±8. 783 △ 　3 与同期 AS组相比 P < 0101; △与同组 4周末相比 P < 0101; ▲ 与同组 8周末相比 P < 0101 2. 3　免疫组织化学染色结果 　MMP - 2阳性表达位 定位于细胞浆内 ,为棕黄色颗粒 ,MMP - 2在 C组兔动 脉组织中低水平表达 ,主要表达在内膜 ,中膜 ECM 中 也有少量表达 (图 4)。与 C组相比 , AS组及 P组的 MMP - 2表达明显增强 ,内皮细胞、泡沫细胞均呈阳性 染色。在 AS组与 P组的斑块内 ,MMP - 2阳性区域主 要分布在内膜与中膜交界处靠近内膜的部位 ,该部位 染色阳性较强 ,而其在斑块浅层着色较浅 ,MMP - 2 的 表达与胶原分布区域相符。MMP - 2主要在中等大小 的空泡状细胞胞浆中表达丰富 ,随着胞浆的空泡化 , MMP - 2表达减弱。随着时间的推移 ,MMP - 2的表达 范围及强度在 AS组及 P组均增强 ,而 P组阳性表达的 范围及强度均低于同期 AS组 (图 5～6)。 3　讨论 随着对 AS发病机制研究的不断深入 ,胶原在 AS 发生中的作用日益受到重视 ,其与血管壁的张力和伸 延性关系密切 ,该蛋白表达增强是致 AS的机制之 一 [ 2 ]。MMP - 2分布及降解底物非常广泛 ,其通常与 特异性组织抑制因子处于动态平衡状态 ,共同影响着 胶原的沉积与降解 ,维持着血管的正常形态和功能 [ 3 ]。 本实验通过观察主动脉的形态学改变 ,比较主动脉 头段斑块检出率 ,所得结果证明 PACAP具有抗 AS病变 的作用。AS发生时内膜中的胶原是组成 AS斑块的主 要成分 ,MMPs的含量和活性与斑块面积的增大和减小 存在密切关系 [ 4 ] ,这一研究结果与本实验结果相符 : AS 组病变严重 ,斑块较大、胶原密集且 MMP - 2的表达较 强。本实验中 AS组、P组斑块内胶原的沉积及 MMP - 2 的表达均随病变进展呈上升趋势 , 但 P组低于同期 AS 组水平 , P组的胶原容积分数低于同期 AS组且差异有 显著性 ,也说明斑块内胶原的异常沉积是 AS发生的机 ·8011· 广东医学　2008年 7月 第 29卷第 7期　 Guangdong M ed ica l Journa l　Jul. 2008, Vol. 29, No. 7 gxh 高亮 制之一 , PACAP可通过干预胶原的沉积与降解之间的平 衡而影响 AS的形成过程。 本研究发现 AS组及 P组斑块中胶原含量增加的 同时 MMP - 2的表达也升高 ,经分析认为该现象进一 步证明了其他研究者的结论 : MMP - 2表达水平的变 化和胶原的合成及降解的失衡相关 [ 5 ]。一方面 ,胶原 含量的增加反映出胶原合成的增多 ,合成大于降解的 速度 ,而平滑肌细胞是胶原的主要来源 ,与本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 组前 期的研究斑块内平滑肌细胞增多是一致的。另外 ,斑 块内胶原的增加对病变有促进作用 ,它网络许多具有 促 AS的物质 ,如修饰的脂蛋白、糖基化终产物、生长因 子等 ,刺激巨噬细胞 ,促进平滑肌细胞迁移、增殖 [ 6 ]。 其次 ,胶原被 MMP - 2降解后的一些成分也具有促进 平滑肌细胞迁移和生长的作用 ,进一步促进 AS发展。 因此 ,根据本实验研究结果 ,笔者认为 PACAP的抗 AS作用与胶原及 MMP - 2是密切相关的 , PACAP可能 通过影响 MMP - 2的表达从而影响胶原的降解及沉积 , PACAP对胶原的影响正是其发挥抗 AS作用所在。 参考文献 [ 1 ]　ORLAND IA, FRANCESCON I A, MARCELL IN IM, et al. Role of ageing and coronary atherosclerosis in the development of cardiac fibrosis in the rabbit[ J ]. J Cell B iol, 2005, 169: 191 - 202. [ 2 ]　郑建杰 , 马爱群 , 王鸿雁 , 等. Ⅰ型胶原及核因子 -κB与动脉 粥样斑块的关系 [ J ]. 临床心血管病杂志 , 2006, 22 ( 7) : 410 - 413. [ 3 ]　王丽萍 , 杨方. 基质金属蛋白酶及其抑制因子与心肌纤维化 [ J ]. 中国动脉硬化杂志 , 2005, 13 (4) : 517 - 519. [ 4 ]　SILENCE J, LUPU F, COLLEN D, et al. Persistence of athero2 sclerotic p lague but reduced aneurysm formation in m ice with stromelysin (MMP - 3) gene inactivation[ J ]. A rterioscler Thromb Vasc B iol, 2001, 21 (9) : 1 440 - 1 445. [ 5 ]　RODELLA L F, BONOM IN I F, REZZAN I R, et al. A therosclero2 sis and the p rotective role p layed by different p roteins in apoli2 pop rotein E - deficient m ice[ J ]. Acta H istochem ica, 2007, 109, 45 - 51. [ 6 ] 　REKHTER M D. collagen synthesis in atherosclerosis too much and not enough[ J ]. Cardiovasc Res, 1999, 41: 376 - 384. (收稿日期 : 2008 - 01 - 15　编辑 : 蔡欣 ) 　3 广东省广州市科技计划项目 (编号 : 2003J1 - C0221) ;广东省医 学科研基金资助项目 (编号 : B2008064) 　▲2002～2005年为中山大学中山医学院博士研究生 　△通讯作者。教授 ,博士研究生导师 MAGE - A3在肝癌组织中的表达及意义 3 肖刚▲ 　谭敏 1 　胡少为 1 　石灵春 1 　文剑明 2△ 1广东省中医院病理科 (广州 510120) ; 2中山大学中山医学院病理学教研室 (广州 510080) 　　【摘要 】　目的 　检测黑色素瘤抗原 - A3 (MAGE - A3)在肝癌组织中的表达 ,为应用 MAGE - A3抗原对肝癌 患者进行特异性抗肿瘤免疫治疗及判断预后提供理论依据。方法 　逆转录 - 聚合酶链反应 (RT - PCR)检测 31 例肝癌组织及相应癌旁组织中 MAGE - A3基因的表达 , 应用组织芯片技术、免疫组织化学方法分析 178例肝癌 组织及相应癌旁组织中 MAGE - A3抗原的表达。结果 　31例肝癌组织标本中有 23例 ( 74119% )表达 MAGE - A3基因 ,而相应的癌旁组织 MAGE - A3 基因均不表达。178 例肝癌组织中 102 例表达 MAGE - A3 抗原 (57130% ) ,相应的癌旁组织 MAGE - A3抗原均不表达。MAGE - A3蛋白表达与肿瘤转移有关 ( P < 0105) ,而与 HB sAg、AFP水平和分化程度均无关 ( P > 0105)。结论 　MAGE - A3基因在肝癌组织中有较高表达 ,这使得以该 基因编码蛋白作为肿瘤疫苗用于肝癌的免疫治疗成为可能。表达 MAGE - A3的肝癌患者预后较差。 【关键词 】　黑色素瘤抗原 - A3　肝细胞癌 　逆转录 -聚合酶链反应 　组织芯片 　免疫组织化学 　　1991年 , VAN DER BRUGGEN等 [ 1 ]使用基因转染 技术发现了黑色素瘤细胞系上的黑色素瘤抗原 - A1 (melanoma antigen - A1, MAGE - A1)基因。此后 ,随 着 T细胞表位克隆和 SEREX等新方法的建立和应用 , MAGE家族成员不断扩充 ,人们逐渐认识到 MAGE实 际上是一个大家族 [ 2 ] ,进一步的研究发现 : MAGE - A 基因家族由 15个基因成员组成 ,将其命名为 MAGE - A l～MAGE - A15。MAGE - A家族基因都有着严格的 表达限制性 ,其编码蛋白见于多种肿瘤组织及正常的 睾丸组织 ,而其他正常组织不表达 ,因此又称之为肿瘤 - 睾丸抗原 ( cancer/ testis antigen ) [ 3 ]。近年来利用 MAGE抗原制备特异性肿瘤疫苗用于抗肿瘤治疗 ,已 在临床治疗中取得初步成果 [ 4 ] ,为肿瘤的特异性免疫 治疗开辟了一条新途径。然而有关中国人肝细胞癌 ( hepatocellular carcinoma, HCC)中 MAGE - A3基因表 达的阳性率及其与肿瘤预后相关指标的关系却罕见报 道。本研究即采用逆转录 - 聚合酶链反应 ( reverse transcrip tion polymerase reaction, RT - PCR)和免疫组织 化学 ( immunohistochem istry)的方法开展相关研究 ,为 MAGE - A3肿瘤疫苗用于 HCC患者的免疫治疗及预 后判断提供理论依据。 1　材料与方法 1. 1　材料 1. 1. 1　原发性肝癌标本 　收集中山大学附属第一医 院外科 2002～2003年收治的原发性肝癌病例 31例 , ·9011·广东医学　2008年 7月 第 29卷第 7期　 Guangdong M ed ica l Journa l　Jul. 2008, Vol. 29, No. 7