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包涵体的分离纯化.ppt

包涵体的分离纯化

moonzax
2012-06-26 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《包涵体的分离纯化ppt》,可适用于高等教育领域

包涵体的分离纯化基因工程菌:将目的基因导入细菌体内使其表达产生所需要的蛋白的细菌称为基因工程菌。包涵体:在某些生长条件下基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子它们致密地集聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露结构这种水不溶性的结构称为包涵体(InclusionBodiesIB)。包涵体包涵体的组成及特性一般含有以上的重组蛋白其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等环状或缺口的质粒DNA以及脂体、脂多糖等大小为um难溶与水只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体与蛋白种类及表达系统无关仅为蛋白过量表达的结果。包涵体的形成在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适无法形成正确的次级键等原因形成的。最大缺点:一级结构正确高级结构错误。蛋白一级结构决定高级结构?包涵体形成的主要原因、表达量过高。原因可能是合成速度太快以至于没有足够的时间进行折叠二硫键不能正确的配对(并非所有)过多的蛋白间的非特异性结合蛋白质无法达到足够的溶解度等。  、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。、重组蛋白所处的环境:发酵温度高(℃)或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。  、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类致使中间体大量积累容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。  、降低了胞内外源蛋白的浓度有利于表达量的提高。  、包涵体中杂蛋白含量较低且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离有利于分离纯化。  、对机械搅拌和超声破碎不敏感易于破壁并与细胞膜碎片分离。包涵体的复性前准备洗涤:由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体通常用低浓度的变性剂如M尿素在mMTrispH左右、mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX洗涤去除膜碎片和膜蛋白。包涵体的溶解采用高浓度的变性剂使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素(M)、盐酸胍(GdnHClM)通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差异氰硫酸胍(GdnSCN)最强。变性剂的使用浓度和作用时间:一般在偏碱性的环境中如pH尿素在碱性环境中不稳定一般不要超过pH。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜但盐酸胍在度小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。去垢剂:如强的阴离子去垢剂SDS可以破坏蛋白内的疏水键避免蛋白形成疏水核心可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用(研究)。极端pH:可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH>溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。还原剂:由于蛋白间二硫键的存在在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是mMDTT也有使用mM浓度。实际还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶有时还原剂的使用也是必要的可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。(伸展态)U→(中间态)I→(自然态)N↓A(包涵体)从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低又无其它辅助手段存在时聚集趋势占主导地位导致蛋白质的自发复性效率极低。蛋白质折叠的三态模型复性目的牛胰核糖核酸酶复性:通过缓慢去除变性剂(避免折叠中间体重新聚集)使目标蛋白从变性的完全伸展状态(?)恢复到正常的折叠结构同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度M左右时复性过程开始到M左右时结束。对于盐酸胍而言可以从M开始到M时复性过程已经结束。信息体内蛋白折叠错误引发疾病。如:帕金森、疯牛病等。蛋白折叠理论也是蛋白质组学中的重要研究领域。复性常用方法稀释复性:直接加入水或复性缓冲液缺点是体积增加较大后续处理困难。稀释蛋白浓度:浓度高则容易形成聚集体(较低的复性收率)。有时需低于mgmL。脉冲流加复性:分批次加入到缓冲液中使折叠中间体保持在较低的水平。例:在mgmL终浓度下溶菌酶复性收率可达以上。透析复性:好处是不增加体积通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度速度慢不适合大规模操作无法应用到生产规模。超滤复性:选择合适载留分子量的膜允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用规模较大缺点是不适合样品量较少的情况且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性(蛋白聚集于膜上)。色谱复性:辅助手段。兼具分离。凝胶过滤复性:除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢对有些蛋白质的复性有利。吸附型层析复性:离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来在洗脱过程中完成复性。复性过程中的添加剂低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等在非变性浓度下是有效的促进剂。分子伴侣:主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解再加入分子伴侣帮助折叠。基因工程药物先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质然后利用基因工程手段大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质即基因疫苗或药物。需要基因及表达载体。例:要获取磅(g)纯干扰素其成本高达亿美元。而采用基因工程进行生产其成本不到亿美元。

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