动植物细胞培养

nullnull动植物细胞培养动植物细胞培养与产品动植物细胞培养与产品动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长,此时细胞不再形成组织。 其产品包括 疫苗 单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素 动、植物细胞培养与微生物培养区别动、植物细胞培养与微生物培养区别动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。null动植物、微生物细胞的培养比较第一节 动物细胞培养技术第一节 动物细胞培养技术动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。在随后的近一个世纪里，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领城的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。大规模动物细胞培养在生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。 动物细胞培养技术的发展动物细胞培养技术的发展一、培养基 一、培养基 工业用动物细胞培养基与实验室培养基基本一致，实验室用培养基需添加5％一10％小牛血清，但大规模培养动物细胞应用小牛血清，无论从经济上还是实际可能性来讲，都是不现实的，且血清产地、批号及动物个体不同，质量差异甚大，给大规模动物细胞培养及产品分离纯化带来许多困难。目前正大力开展无血清培养基研究 。null ①基本合成培养基； ②基本合成培养基加生长因子； ③基本合成培养基加组织抽提物。 已有商品市售无血清培养基主要有下述3类：null第二类亦称为添加生长因子培养基，其特点是组成物质的种类与数量均为已知，并可按需要增减与删除，其最大优点是： ①可用于培养不同种类的细胞及含血清培养基中不能生长的细胞； ②可用于杂种细胞、基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 细胞及突变体细胞培养，生产有用物质。大大简化细胞培养产物分离纯化操作。 null目前人们正研究起血清作用的各类激素及生长因子，如铁传递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促胃酸激素、维生素C、考的松及硒等成分的功能。以期获得更适宜于大规模培养动物细胞的培养基。 二、培养技术 二、培养技术 动物细胞大规模培养与实验室培养相比，培养条件更严格，控制难度更大，其培养方法可概括为： 悬浮培养 固定化培养 微载体（Microcarrier）培养法 1，细胞悬浮培养法 1，细胞悬浮培养法 动物细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法谓之悬浮培养法。其培养方式有 批量法 半连续法 连续法 适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞及淋巴组织细胞，用于大量生产疫苗、α-干扰素、白介素等药品。 此法不适于包括二倍体细胞在内的正常组织细胞的培养。 细胞悬浮培养法的优点细胞悬浮培养法的优点可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害。 细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。 null培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含5％CO2的无菌空气，保持细胞悬浮态并维持培养液溶解氧。 此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用HEPES缓冲盐溶液时尚可不必连续通入含5％CO2空气。 悬浮培养的反应器悬浮培养的反应器气升式反应器 笼式通气搅拌罐 中空纤维管 陶质矩形通道蜂窝状生物反应器2，固定化培养法 2，固定化培养法 动物细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术谓之细胞固定化培养法。动物细胞几乎都可采用固定化方法培养。固定化方法有： 吸附法（所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 ） 包埋法 （将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中） 固定化培养优点 固定化培养优点 细胞可维持在较小体积培养液中生长； 细胞损伤程度低； 易于更换培养液； 细胞和培养液易于分离； 培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。 固定化培养装置固定化培养装置多层平板装置 螺旋卷膜培养器 多层托盘式培养器 卷带式培养器 中空纤维及流化床式培养器 中空纤维培养器优点 中空纤维培养器优点 细胞生长密度高，可达l08个／毫升以上，细胞处于接近生理状态的理化梯度中； 营养物质可有效分布，代谢废物可及时排除； 细胞培养可达数月，易于实现连续培养； 细胞分泌的蛋白质浓度高。产品纯度可高达60％-90％；利于降低成本； 反应器体积小并可用于培养多种细胞。 3，微载体培养方法 3，微载体培养方法 将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法称为微载体培养法或微珠培养法。 制备微载体的材料主要有： 葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素 微载体培养优点 微载体培养优点 兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养。 细胞所处环境均一，放大容易。 培养操作可系统化、自动化，障低了污染发生的机会。三、培养条件控制 三、培养条件控制 动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污染，除反应器密封性能良好外，尚需添加抗生素，培养过程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放出对细胞有毒害的物质。 在分批培养时，随着细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需更换培养液或移植继代培养。 null动物细胞培养过程亦应控制一定的环境条件，如培养温度、溶解氧、pH、罐压及搅拌速度等。 动物细胞对环境变化适应能力较微生物细胞小得多，故条件控制精密度要求更高。其中特别重要的是溶解氧和pH的控制。 null动物细胞大规模培养工艺四、动物细胞培养存在的问题四、动物细胞培养存在的问题细胞密度低，细胞生产率低，产物浓度也很低。 细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题。 动物细胞培养基，培养设备以及培养用微载体颇为昂贵，限制了细胞培养工程在发展中国家的开展。五、动物细胞培养发展的方向五、动物细胞培养发展的方向总方向：大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。 开发能高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞系。 开发细胞生长性能优良、解离细胞容易，并能重复使用的新型廉价微载体。 研制更大规模的高无菌条件的生物反应器和剪切力小、混合性能良好的新型搅拌系统。 传感器、自动控制技术的应用 开发新型无血清培养基第二节 植物细胞培养技术 第二节 植物细胞培养技术 在人工控制下高密度大量培养有益植物细胞技术称之为植物细胞大规模培养，其目的在于通过细胞工业规模培养，获得细胞、初级及次级代谢产物，为药品、食品及化工行业提供服务。尽管植物细胞实验室与工业化培养在技术上有许多相似之处，但培养方式、设备及条件和培养基等亦有很大差别。 一、培养基 一、培养基 培养基的成分由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。 选择培养基的基本原则： 需要根据不同培养对象、培养目的及培养条件探索适宜培养基。 选择的培养基在培养过程使细胞总体积倍增时间1天左右为宜。 二、培养方式 二、培养方式 悬浮培养法 分批培养法 半连续培养法 连续培养法 固定化培养法 1，分批培养法 1，分批培养法 主要采用气升式反应器，其培养过程用通气代替搅拌，细胞产量高于平叶轮培养器。本培养方法中植物细胞生长规律与微生物相似，随着细胞增长，培养液营养物质不断下降。细胞增长过程也分为延迟期、对数生长期、转换期、静止期及衰减期等阶段。 2，半连续培养法 2，半连续培养法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称之为半连续培养法。反应过程通常以一定时间间隔进行数次反复操作以达到培养细胞与生产有用物质的目的。 3，连续培养法 3，连续培养法 采用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞与培养液，并以同样速度供给新鲜培养基，此种培养方式可使细胞生长环境长期维持恒定。 连续培养法细胞生产能力一般较分批法高，但因细胞生长缓慢，培养时间长，要维持系统无菌状态，技术条件要求相当苛刻。 4，固定化培养法 4，固定化培养法 固定化培养采用固定化反应器，这类反应器有网状多孔板、尼龙网套及中空纤维膜等形式。 固定化培养法的优点在于细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及建立细胞间物理学和化学联系，维持细胞间物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次生产物。 三、影响细胞培养因素 三、影响细胞培养因素 细胞种质影响 外界因素影响 光照影响 温度影响 培养基成分的影响 搅拌方式与通气的影响