GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验

中华人民共和国国家标准 GB 4789.5—2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验 中华人民共和国卫生部 发布 2012-05-17 发布 2012-07-17 实施 GB 4789.5-2012 I 前 言 本标准代替GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》。 本标准与 GB/T 4789.5-2003 相比，主要变化如下： ——修改了标准名称； ——修改了培养基和试剂； ——修改了操作步骤中增菌部分和生化试验及附加生化试验部分； ——修改了 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 2； ——修改了表4。 GB 4789.5-2012 2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验 1 范围 本标准规定了食品中志贺氏菌(Shigella)的检验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。 本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a） 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃； b） 冰箱：2 ℃～5 ℃； c） 膜过滤系统； d） 厌氧培养装置：41.5 ℃1 ℃； e） 电子天平：感量 0.1 g； f） 显微镜：10×～100×； g） 均质器； h） 振荡器； i） 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头； j） 无菌均质杯或无菌均质袋：容量 500 mL； k） 无菌培养皿：直径 90 mm； l） pH计或 pH比色管或精密 pH试纸； m） 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录 A 中 A.1。 3.2 麦康凯（MAC）琼脂：见附录 A 中 A.2。 3.3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.3。 3.4 志贺氏菌显色培养基。 3.5 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.4。 3.6 营养琼脂斜面：见附录 A 中 A.5。 3.7 半固体琼脂：见附录 A 中 A.6。 3.8 葡萄糖铵培养基：见附录 A 中 A.7。 3.9 尿素琼脂：见附录 A 中 A.8。 GB 4789.5-2012 3 3.10 β-半乳糖苷酶培养基：见附录 A 中 A.9。 3.11氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.10。 3.12糖发酵管：见附录 A 中 A.11。 3.13西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A 中 A.12。 3.14粘液酸盐培养基：见附录 A 中 A. 13。 3.15蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.14。 3.16志贺氏菌属诊断血清。 3.17生化鉴定试剂盒。 4 检验程序 志贺氏菌检验程序见图 1。 GB 4789.5-2012 4 图 1 志贺氏菌检验程序 5 操作步骤 5.1增菌 以无菌操作取检样 25 g（mL），加入装有灭菌 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均 质器以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质；或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质 器连续均质 1 min～2 min，液体样品振荡混匀即可。于 41.5 ℃±１℃，厌氧培养 16 h～20 h。 5.2 分离 取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板 上，于 36 ℃1 ℃培养 20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大 于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至 48 h 再进行观察。志贺氏菌在 不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1。 36 ℃±１℃，20 h～48 h XLD 挑取可疑菌落 TSI，半固体， 营养琼脂斜面 MAC 或志贺氏菌显色培养基 生化鉴定 报告 血清学分型 志贺氏菌属分群及分型结果 检样 25 g（或 25 mL）样品+志贺氏菌增菌肉汤 225 mL 41.5 ℃±１℃， 16 h～20 h 厌氧培养 GB 4789.5-2012 5 表 1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 志贺氏菌的菌落特征 MAC 琼脂 无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 XLD 琼脂 粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 志贺氏菌显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定 5.3初步生化试验 5.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一 管，置36 ℃1 ℃培养20 h～24 h，分别观察结果。 5.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏 菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的营养琼脂斜面 上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。 5.4 生化试验及附加生化试验 5.4.1生化试验 用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即 β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱 羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌 13 型的鸟氨酸 阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌 1 型，鲍氏志贺氏菌 13 型的 β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺 氏菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌 6 型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相 似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧 化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得 判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表 2。 表 2 志贺氏菌属四个群的生化特征 生化反应 A 群：痢疾志贺氏菌 B 群：福氏志贺氏菌 C 群：鲍氏志贺氏菌 D 群：宋内氏志贺氏菌 ß-半乳糖苷酶 －a － －a ＋ 尿素 － － － － 赖氨酸脱羧酶 － － － － 鸟氨酸脱羧酶 － － －b ＋ 水杨苷 － － － － 七叶苷 － － － － 靛基质 －/＋ (＋) －/＋ － 甘露醇 － ＋c ＋ ＋ 棉子糖 － ＋ － ＋ 甘油 (＋) － (＋) d 注：+表示阳性；-表示阴性；-/+表示多数阴性；+/-表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d 表示有不同生化型。 a 痢疾志贺 1 型和鲍氏 13 型为阳性。 b鲍氏 13 型为鸟氨酸阳性。 c 福氏 4 型和 6 型常见甘露醇阴性变种。 5.4.2附加生化实验 由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型） 菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺 氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 ℃培养 24 h～48 h)。志 贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别见表 3。 GB 4789.5-2012 6 表 3 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别 生化反应 A 群：痢疾 志贺氏菌 B 群：福氏 志贺氏菌 C 群：鲍氏 志贺氏菌 D 群：宋内氏 志贺氏菌 大肠埃希氏菌 A-D 菌 葡萄糖铵 － － － － ＋ ＋ 西蒙氏柠檬酸盐 － － － － d d 粘液酸盐 － － － d ＋ d 注 1：+表示阳性；-表示阴性；d 表示有不同生化型。 注 2：在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱 性-异型）菌至少有一项反应为阳性。 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.3.2的初步判断结果，用5.3.1中已培 养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1抗原的准备 志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体 O 抗原又可分为 型和群的特异性抗原。 一般采用 1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 注 1：一些志贺氏菌如果因为 K 抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水做成浓菌液，100 ℃煮 沸 15 min～60 min 去除 K 抗原后再检查。 注 2：D 群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不 同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原。 5.5.2凝集反应 在玻片上划出 2 个约 1cm×2cm 的区域，挑取一环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其 中一个区域下部加 1 滴抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分 别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清 中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现 凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。 如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按 5.5.1 注 1 进行 试验。 5.5.3 血清学分型（选做项目） 先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用 B 群福氏 志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查。如果 B 群多价血清不凝集， 则用 D 群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其Ⅰ相和Ⅱ相血清检查；如果 B、D 群多价血 清都不凝集，则用 A 群痢疾志贺氏菌多价血清及 1～12 各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝 集，可用 C 群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用 1～18 各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的 型抗原和群抗原鉴别见表 4。 表 4 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表 型和亚型 型抗原 群抗原 在群因子血清中的凝集 3,4 6 7,8 1a Ⅰ 4 + - - 1b Ⅰ （4），6 (+) + - 2a Ⅱ 3,4 + - - 2b Ⅱ 7,8 - - + GB 4789.5-2012 7 表 4（续） 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表 型和亚型 型抗原 群抗原 在群因子血清中的凝集 3,4 6 7,8 3a Ⅲ （3，4）,6,7,8 (+) + + 3b Ⅲ （3,4）,6 (+) + - 4a Ⅳ 3,4 + - - 4b Ⅳ 6 - + - 4c Ⅳ 7,8 - - + 5a Ⅴ （3,4） (+) - - 5b Ⅴ 7,8 - - + 6 Ⅵ 4 + - - X - 7,8 - - + Y - 3,4 + - - 注：+表示凝集；-表示不凝集；（）表示有或无。 5.6 结果报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。 GB 4789.5-2012 8 附录A 培养基和试剂 A.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素（Shigella broth） A.1.1 志贺氏菌增菌肉汤 A.1.1.1 成分 胰蛋白胨 20.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸氢二钾 2.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 氯化钠 5.0 g 吐温 80（Tween 80） 1.5 mL 蒸馏水 1 000.0 mL A.1.1.2 制法 将以上成分混合加热溶解，冷却至25 ℃左右校正pH至7.00.2，分装适当的容器，121 ℃灭菌15 min。 取出后冷却至 50 ℃~55 ℃，加入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5 μg/mL），分装 225 mL 备用。 注：如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一个月。 A.1.2 新生霉素溶液 A.1.2.1 成分 新生霉素 25.0 mg 蒸馏水 1 000.0 mL A.1.2.2 制法 将新生霉素溶解于蒸馏水中，用 0.22 µm 过滤膜除菌，如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一 个月。 A.1.3 临用时每 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤（A.1.1）加入 5 mL 新生霉素溶液（A.1.2），混匀。 A.2麦康凯（MAC）琼脂 A.2.1 成分 蛋白胨 20.0 g 乳糖 10.0 g 3 号胆盐 1.5 g 氯化钠 5.0 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.001 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL A.2.2 制法 将以上成分混合加热溶解，冷却至 25 ℃左右校正 pH 至 7.2±0.2，分装，121 ℃高压灭菌 15 min。冷 却至 45 ℃～50 ℃，倾注平板。 注：如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存二周。 A.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 A.3.1 成分 GB 4789.5-2012 9 酵母膏 3 .0 g L-赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 脱氧胆酸钠 1.0 g 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 6.8 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 酚红 0.08 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL A.3.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，校正 pH 至 7.40.2。另将琼脂加 入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 ℃~55 ℃倾注平皿。 注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天 制备，第二天使用。使用前必须去除平板表面上的水珠，在 37 ℃～55 ℃温度下，琼脂面向下、平板盖亦向下烘干。另外 如配制好的培养基不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存二周。 A.4三糖铁（TSI）琼脂 A.4.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉浸膏 5.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵 (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.2 g 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 酚红 0.025 g 琼脂 12.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL A.4.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加于 400 mL 蒸馏水中,搅拌均匀,静置约 10 min,加热使完全溶化, 冷却 至 25 ℃左右校正 pH 至 7.40.2。另将琼脂加于 600 mL 蒸馏水中，静置约 10 min，加热使完全溶化。将 两溶液混合均匀，加入 5%酚红水溶液 5 mL，混匀，分装小号试管，每管约 3 mL。于 121 ℃灭菌 15 min， 制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一个月。 A.5 营养琼脂斜面 A.5.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g GB 4789.5-2012 10 蒸馏水 1 000.0 mL A.5.2 制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入 15%氢氧化钠溶液约 2 mL，冷却至 25 ℃左右校正 pH 至 7.00.2。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装小号试管，每管约 3 mL。于 121 ℃灭菌 15 min， 制成斜面。 注：如不立即使用，在 2℃ ~8 ℃条件下可储存二周。 A.6 半固体琼脂 A.6.1 成分 蛋白胨 1.0 g 牛肉膏 0.3 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.3g～0.7g 蒸馏水 100.0 mL A.6.2 制法 按以上成分配好，加热溶解，并校正pH至 7.40.2，分装小试管，121 ℃灭菌 15 min，直立凝固备 用。 A.7 葡萄糖铵培养基 A.7.1 成分 氯化钠 5.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.2 g 磷酸二氢铵 1.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 葡萄糖 2.0 g 琼脂 20.0 g 0.2%溴麝香草酚蓝水溶液 40.0 mL 蒸馏水 1 000.0 mL A.7.2 制法 先将盐类和糖溶解于水内，校正pH至6.80.2，再加琼脂加热溶解，然后加入指示剂。混合均匀后 分装试管，121 ℃高压灭菌15 min。制成斜面备用。 A.7.3 试验方法 用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不到混浊，以每一接种环 内含菌数在 20~100 之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对 照。于 36 ℃1 ℃培养 24 h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但在对照 培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。 注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时 不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。 A.8 尿素琼脂 A.8.1 成分 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 0.4%酚红溶液 3 .0mL GB 4789.5-2012 11 琼脂 20.0 g 20%尿素溶液 100 .0mL 蒸馏水 900.0 mL A.8.2 制法 除酚红和尿素外的其他成分加热溶解，冷却至25 ℃左右校正pH至7.20.2，加入酚红指示剂，混匀， 于121 ℃灭菌15 min。冷至约55 ℃，加入用0.22 µm过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100 mL，混匀，以 无菌操作分装灭菌试管，每管约3 mL~4 mL，制成斜面后放冰箱备用。 A.8.3 试验方法 挑取琼脂培养物接种，在 36 ℃1 ℃培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为 红色。 A.9 β-半乳糖苷酶培养基 A.9.1 液体法（ONPG法） A.9.1.1 成分 邻硝基苯 β-D-半乳糖苷(ONPG) 60.0 mg 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.50.2) 10.0 mL 1%蛋白胨水(pH7.50.2) 30.0 mL A.9.1.2 制法 将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10 mm×75 mm试管内，每管0.5 mL， 用橡皮塞塞紧。 A.9.1.3 试验方法 自琼脂斜面挑取培养物一满环接种，于36 ℃1 ℃培养1 h~3 h和24 h观察结果。如果β-D-半乳糖苷 酶产生，则于1 h~3 h变黄色，如无此酶则24 h不变色。 A.9.2 平板法（X-Gal法） A.9.2.1 成分 蛋白胨 20.0 g 氯化钠 3.0 g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal) 200.0 mg 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL A.9.2.2 制法 将各成分（A.9.2.1）加热煮沸于1 L水中，冷却至25 ℃左右校正pH至7.20.2，115 ℃高压灭菌10 min。 倾注平板避光冷藏备用。 A.9.2.3 试验方法 挑取琼脂斜面培养物接种于平板，划线和点种均可，于36 ℃1 ℃培养18 h~24 h观察结果。如果 β-D-半乳糖苷酶产生，则平板上培养物颜色变蓝色，如无此酶则培养物为无色或不透明色，培养48 h~72 h后有部分转为淡粉红色。 A.10氨基酸脱羧酶试验培养基 A.10.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0 mL L型或DL型赖氨酸和鸟氨酸 0.5 g/100 mL 或 1.0 g/100 mL GB 4789.5-2012 12 蒸馏水 1 000.0 mL A.10.2 制法 除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按 0.5% 加入，DL-氨基酸按 1%加入，再校正 pH 至 6.8±0.2。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内， 每管 0.5 mL，上面滴加一层石蜡油，115 ℃高压灭菌 10 min。 A.10.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 ℃1 ℃培养 18 h～24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由 于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。阴性对照管应为 黄色，空白对照管为紫色。 A.11 糖发酵管 A.11.1 成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠（NA2HPO4·12H2O） 2.0 g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1 000.0 mL A.11.2 制法 A.11.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分装于有 一个倒置小管的小试管内，121 ℃高压灭菌15 min。 A.11.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100 mL，121 ℃高压灭菌15 min。另将各种糖 类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。 注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 A.11.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36 ℃1 ℃培养，一般观察2 d~3 d。迟缓反应需观察14 d~30 d。 A.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基 A.12.1 成分 氯化钠 5.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.2 g 磷酸二氢铵 1.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 柠檬酸钠 5.0 g 琼脂 20 g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40.0 mL 蒸馏水 1 000.0 mL A.12.2 制法 先将盐类溶解于水内，调至pH 6.80.2，加入琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装 试管，121℃灭菌15 min。制成斜面备用。 A.12.3 试验方法 挑取少量琼脂培养物接种，于36 ℃1 ℃培养4 d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养 基从绿色转为蓝色。 A.13 粘液酸盐培养基 A.13.1 测试肉汤 GB 4789.5-2012 13 A.13.1.1 成分 酪蛋白胨 10.0 g 溴麝香草酚蓝溶液 0.024 g 蒸馏水 1 000.0 mL 粘液酸 10.0 g A.13.1.2 制法 慢慢加入5 N氢氧化钠以溶解粘液酸，混匀。 其余成分加热溶解，加入上述粘液酸，冷却至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分装试管，每管约5 mL，于121 ℃高压灭菌10 min。 A.13.2 质控肉汤 A.13.2.1 成分 酪蛋白胨 10.0 g 溴麝香草酚蓝溶液 0.024 g 蒸馏水 1 000.0 mL A.13.2.2 制法 所有成分加热溶解，冷却至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分装试管，每管约5 mL，于121 ℃高压灭菌 10 min。 A 13.3 试验方法 将待测新鲜培养物接种测试肉汤（A.13.1）和质控肉汤（A.13.2），于36 ℃1 ℃培养48 h观察结果， 肉汤颜色蓝色不变则为阴性结果，黄色或稻草黄色为阳性结果。 A.14蛋白胨水、靛基质试剂 A.14.1成分 蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL pH7.4 A.14.2制法 按上述成分配制，分装小试管，121 ℃高压灭菌 15 min。 注：此试剂在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一个月。 A.14.3靛基质试剂 A.14.3.1 柯凡克试剂：将 5 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75 mL 戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。 A.14.3.2 欧－波试剂：将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL 95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。 A.14.4试验方法 挑取少量培养物接种，在36 ℃±1 ℃培养1 d～2 d，必要时可培养4 d～5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL， 轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面， 阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。 注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用，此试剂在 2 ℃～8 ℃条 件下可储存一个月。