CyclinD1反义寡核苷酸对胃癌细胞化疗敏感性的影响

Cyclin D1反义寡核苷酸对胃癌细胞化疗敏感性的影响 帅晓明 ,韩高雄 ,陈俊安 ,王国斌 　 (华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科 ,武汉 　430022) 摘 　要 : 　目的　研究 Cyclin D1反义寡核苷酸 (ASODN)对胃癌细胞 SGC27901和 HS2746T化疗敏感性的影响 ,并探讨其内在机制。 方法　在给予 Cyclin D1 ASODN和 Cyclin D1反义寡核苷酸转染细胞 24 h后 ,分别给予梯度浓度的 52氟尿嘧啶 ( 52FU )、氨甲喋呤 (MTX)、顺铂 (CDDP) ,观察各组的量效反应 ,计算 IC50。Cyclin D1 ASODN转染细胞后 24 h、48 h时应用 RT2PCR分别检测各组细胞中 胸苷酸合酶 ( TS)、胸腺嘧啶磷酸化酶 ( TP)、二氢叶酸还原酶 (DHFR)的表达情况。结果 　Cyclin D1 ASODN转染增加了两种胃癌细胞 对 52FU、MTX、CDDP的敏感性 , ASODN +化疗组对各化疗药物的 IC50与对照组相比均有显著下降。RT2PCR显示 Cyclin D1 ASODN转 染后 24 h时 Cyclin D1、TS、DHFR mRNA表达较对照组下降 ,而 TP mRNA表达较对照组升高 ,在 48 h时各种酶 mRNA表达的改变更加 明显。结论　Cyclin D1 ASODN能提高胃癌细胞对多种化疗药物的敏感性 ,可能是由于影响了化疗药物代谢相关酶表达的改变所致。 关键词 : 　胃癌 ; 　Cyclin D1; 　反义寡核苷酸 ; 　化疗敏感性 [中图分类号 ]R73512　[文献标志码 ]A　[文章编号 ]10052541X (2005) 042155204 Effects of Cyclin D1 An tisen se O ligodeoxyneucleotides on Chem osen sitiv ity of Ga str ic Carc inoma Cells SHUA I X iao2m ing, HAN Gao2x iong, CHENG Jun2hua, W ANG Guo2b in D epartm en t of Genera l Surgery, Un ion Hosp ita l, Tongji M ed ica l College, Huazhong Un iversity of Sc ience and Technology, W uhan 430022, Ch ina Abstract:　O bjectives　To exam ine the effect of Cyclin D1 antisense oligodeoxyneucleotides (ASODN) on chemosensitivity of gastric carci2 noma cell lines SGC27901 and HS2746T. M ethods　52FU,MTX, CDDP in different concentrations were given to every group after transfected with Cyclin D1 SOND or ASODN for 24 h, the dose2effects response was observed and IC50 was calculated in every group. The mRNA exp ressions of Cy2 clin D1, Thym idylate Synthase ( TS) , Thym idine Phosphorylase ( TP) , D ihydrofolate Reductase (DHFR ) were detected by reverse transcrip tion2 PCR (RT2PCR) in every group at 24 h and 48 h after transfection. Results　Cyclin D1 ASODN could increase the sensitivity to 52FU,MTX, CD2 DP in the two gastric carcinoma cell lines. The IC50 of different chemotherapeutic agents in ASOON + chemotherapy group swere significantly lower than those in chemotherapy group s. RT2PCR showed that tranfection with Cyclin D1 ASODN lead to a decrease in Cyclin D1, TS and DHFR mRNA and an increase in TP mRNA as determ ined by RT2PCR at 24 h, the alterationswere more significant at 48 h. Conclusion　Cyclin D1 can enhance the chemosensitivity to multip le chemotherapeutic agents in gastric carcinoma cells, and this effect maybe due to the altered exp ression of enzymes related to metabolism of chemotherapeutic agents. Key words:　Gastric carcinoma; 　Cyclin D1; 　Antisense oligodexoyneucleotides; 　Chemosensitivity 　　胃癌对化疗中度敏感 ,单药化疗常不能取得理想 的效果 ,如 52氟脲嘧啶或顺铂单用对胃癌的有效率只 有 20%左右。在研究中我们发现 , Cyclin D1反义寡 核苷酸 (ASODN )能有效地抑制 SGC27901和 HS2746T 等两种胃癌细胞的生长 ,为进一步研究 Cyclin D1 ASODN的作用 ,我们检测了它与传统化疗药物 52氟 尿嘧啶 (52FU )、氨甲喋呤 (MTX)、顺铂 ( CDDP)联合 对胃癌细胞的杀伤作用 ,并研究了 Cyclin D1 ASODN 对 52FU、MTX代谢相关酶表达的影响 ,包括胸苷酸合 酶 ( TS)、胸腺嘧啶磷酸化酶 ( TP)、二氢叶酸还原酶 (DHFR) ,进一步明确其中的机制 ,以便将传统化疗与 基因治疗结合起来 ,寻找更为有效、低毒性的联合化 疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。 材料和方法 111　试剂 　Cyclin D1反义寡核苷酸 5’2GGA GCT GGT GTT CCA TGG23’(ASODN ) ,与 Cyclin D1 cDNA翻译起始位点互补 ,以正义链 5’2CCA TGG AAC ACCAGC TCC23’( SODN )作为对照 [ 1 ] ,采用全硫代修饰 ,由上海申工生物技术公司合成。ODN冻干粉用无菌水溶解 ,使其浓度为 25μmol/L , 0122μm微孔滤膜过滤除菌 , - 20℃储存备用。L ipofect AM INE 2000 (LF2000)购自 Invitrogen公司。LF20002ODN复合物的制备参照 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 ,用无血清培养基分别稀释 LF 2000和 ODN,按比例混合。室温孵育 30 m in。转染时用无血清培养基稀释成所需的浓度。52FU、MTX、CDDP均购自 Sigma公司。112　细胞培养和分组 　SGC 7901由第四军医大学西京医院消化疾病研究所樊代明教授惠赠。HS 746T购自武汉大学典型培养物保藏中心。采用含 100 m l/L小牛血清的 DMEM培养基 ( GIBCOBRL) ,于 37℃, 5%CO2 培养。按处理方法不同分为 3组 : ( 1)单纯化疗组 ,给予不同浓度的化疗药物处理。 (2) SOND +化疗 ·551·　临床消化病杂志 2005年第 17卷第 4期 　　　　　 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 组 ,给予 012μmol/L Cyclin D1 SODN转染 24 h后 ,再 给予不同浓度的化疗药物处理。 ( 3) ASODN +化疗 组 ,给予 012μmol/L Cyclin D1 ASODN转染 24 h后 , 再给不同浓度化疗药物处理。 113　Cyclin D1 ASODN不同化疗药物的联合作用 　 细胞接种于 96 孔培养板 , 贴壁后 , 分别加入 012 μmol/L的 ASODN、SODN与 LF 2000的复合物。转染 24 h后 ,更换为含有梯度浓度的化疗药物的培养基继 续培养 72 h。弃去培养上清 ,每孔加入 5 mg/m l的 MTT 20μl, 37℃孵育 4 h,加入 DMSO,各 100μl,充分 振荡并放置 15 m in。将样本置酶标仪测定 490 nm波 长的吸光度值 (A490 ) ,计算存活率 ,绘制量效曲线。采 用 Graph Pad公司的 Prism 3软件计算各个化疗药物 的 IC50。 114　RT2PCR　细胞接种于 96孔培养板 ,设立空白对 照组和正义对照组 ,按上述方法转染并培养。于转染 后 24 h和 48 h时收获转染细胞 , Trizol ( GIBCO )提取 总 RNA。取 1μg RNA用于逆转录 , 20μl反应体系包 括 O ligo ( dT) 011μg、2 mmol/L dNTPs 4μl、Rnasin 011 μg和 MMLV 200 u。反应条件 42℃ 1 h, 95℃ 5 m in。 215μl逆转录产物用于 PCR, 40 μl反应体系加入 dNTPs, 上、下游引物各 100 pmol, Taq 酶。采用 G3PDH作为参照。 11411　引物设计 　见表 1。 表 1　引物设计 引物序列 扩增片段长度 Cyclin D1 5’2GGA TGC TGG AGG TCT GCG AGG AAC23’ 514 bp 5’2GAG AGG AAG CGT GTG AGG CGG TAG23’ (332 bp～845 bp) TS 5’2CAC ACT TTG GGA CAT GCA CAT ATT T23’ 208 bp 5’2CTT TGA AAG CAC CCT AAA CAG CCA T23’ (853 bp～1060 bp) TP 5’2ACA AGG TCA GCC TGG TCC TC23’ 353 bp 5’2TCC GAA CTT AAC GTC CAC CAC23’ (491 bp～834 bp) DHFR 5’2TCC ATT CCT GAG AAG AAT CGA CCT T23’ 231 bp 5’2CAC AAA TAG TTT AAG ATG GCC TGG G23’ (657 bp～887 bp) G3PDH 5’2TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA23’ 309 bp 5’2AGA TCC TCA ACG GAT ACA TT23’ 11412　反应体系及循环过程 　各反应管 94℃变性 5 m in,分别按下列条件进行 35个循环 : Cyclin D1, 94℃ 60 s→65℃ 115 m in→72℃ 115 m in; TS, 94℃ 30 s→ 55℃ 30 s→72℃ 30 s; TP, 94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 30 s; DHFR, 94℃ 30 s → 60℃ 30 s → 72℃ 30 s; G3PDH, 94℃ 30 s→54℃ 30 s→72℃ 30 s。 RT2PCR产物 (Cyclin D1: 514 bp, TS: 208 bp, TP: 353 bp, DHFR: 231 bp, GAPDH: 309 bp )经 2%琼脂糖 凝胶电泳 , EB染色 ,通过凝胶扫描仪进行 DNA电泳 条带分析。各产物与 G3PDH丰度的比值作为表达水 平的参数。对 mRNA表达进行相对定量。 115　统计学处理 　结果用 €x ±s差表示 ,采用 t检验 进行统计学分析。P < 0105为差异有显著性。 2　结 　　果 211　Cyclin D1 ASODN增加 SGC27901细胞的化疗敏 感性 　在 Cyclin D1 SODN和 Cyclin D1 ASODN转染 细胞后 ,分别给予不同浓度的 52FU、MTX、CDDP,发现 在两种胃癌细胞中 Cyclin D1 ASODN转染后 24 h能显著增加 52FU、MTX、CDDP的细胞毒性。ASODN +化疗组对各化疗药物的 IC50 明显低于单纯化疗组和SODN +化疗组。 SGC27901和 HS2746 T细胞对不同处理的 IC50见表 1。表 2　各组细胞对 52FU、M TX、CDD P的 IC50 ( ×106 mol/L)52FU MTX CDDPSGC27901单纯化疗组 3195 ±0192 1127 ±0132 2112 ±0122SODN +化疗组 4143 ±0141 1125 ±0110 1188 ±0107ASODN +化疗组 0198 ±01153 △ 0138 ±01043 △ 0152 ±01073 △HS2746T单纯化疗组 2180 ±0187 2163 ±0113 5144 ±0151SODN +化疗组 2146 ±0143 2140 ±0136 5147 ±0163ASODN +化疗组 0184 ±01053 △ 0159 ±01083 △ 1113 ±01123 △　　3 与单纯化疗组相比 P < 0105。△与 SODN +化疗组相比 P < 0105。212　Cyclin D1 ASODN对 Cyclin D1和化疗药物代谢相关酶 mRNA表达的影响 　发现经 Cyclin D1 ASODN转染 24 h后 ,在两种胃癌细胞中都发现了 Cyclin D1、 ·651· 　临床消化病杂志 2005年第 17卷第 4期　　　　　　 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net TS、DHFR mRNA不同水平的下降 , 48 h时这种下降更 明显 ,而在 24 h和 48 h时两种胃癌细胞中都有 TP表 达的升高。两种胃癌细胞中 Cyclin D1、TS、TP和 DH2 FR的表达情况见图 1、2。ASODN组与空白对照组各 基因表达相对强度的比值见表 2。 图 1　Cyclin D1 ASOD N对胃癌细胞 SGC27901中 Cyc2 lin D1、TS、TP、D HFR表达的影响 　11空白对照组　21正义对照组 24 h　31正义对照组 48 h 　41反义组 24 h　51反义组 48 h 图 1　Cyclin D1 ASOD N对胃癌细胞 HS2746T中 Cyclin D1、ST、TP、D HFR表达的影响 　11空白对照组　21正义对照组 24 h　31正义对照组 48 h 　41反义组 24 h　51反义组 48 h 表 2　Cyclin D1 ASOD N对胃癌细胞中 Cyclin D1、TS、TP、 D HFR m RNA的影响 3 SGC27901 HS2746T 24 h 48 h 24 h 48 h Cyclin D1 0126 0150 0117 0147 TS 0183 0148 0159 0139 TP 1124 1148 1146 1160 DHFR 0153 0137 0146 0131 　　3 ASOND组表达相对强度 /空白对照组表达相对强度 3　讨 　　论 研究发现 ,细胞周期相关蛋白可以影响肿瘤细胞 对化疗药物的敏感性 ,在骨肉瘤细胞 SaO s22中转染 p21基因 ,增加了细胞对化疗药物阿霉素、氨甲喋呤、 TOMUDEX的敏感性 [ 2 ] , 而针对不同目的基因的 ASODN与传统的化疗药物相结合成为了一个新的研 究方向。在实验中 , Cyclin D1 ASODN能显著抑制 Cy2 clin D1 mRNA的表达 ,因此我们进一步检测了 Cyclin D1 ASODN对化疗药物敏感性的影响及其机制。 52FU抑制 TS活性是其抗肿瘤作用的主要机制。 对 TS阻断的程度和持续性是决定 52FU作用的基本 因素 [ 3 ]。TP是参与嘧啶核苷代谢的一种重要酶 , TP 使 52FU转变成 52FudR。52FudR能进一步被激活为 52FdUMP,阻断 TS的活性 ,从而发挥 52FU的抗增殖作 用 [ 4 ]。DHFR是参与 RNA 和 DNA 合成的一种重要 酶 ,是 MTX的主要作用靶点。MTX的化学结构与叶 酸相似 ,可竞争性抑制 DHFR活力。实验 Cyclin D1 ASODN作用两种胃癌细胞 24 h后 ,细胞对 52FU 和 MTX的 IC50显著下降 ,同时发现两种细胞中 TS、TP、 DHFR的 mRNA表达有明显改变 ,在 48 h时表达的改 变更明显。在其中起关键作用的是 E2F。E2F是一种 细胞转录活化因子 ,能诱导多种对通过 G1 /S期转换 和起始 DNA合成起重要作用的基因表达。其调节的 目的基因包括 Cyclin D1、E、A、DHFR、核糖核苷酸还 原酶、TS、胸苷激酶、DNA 聚合酶 α激酶、原癌基因 MYC、BMYB产物等 [ 5 ]。这些基因启动中都有 E2F结 合位点。E2F可以直接活化这些基因 ,启动 DNA 合 成 ,使细胞进入 S期。pRb蛋白可与 E2F基因活化转 录功能区内的一段 18个氨基酸残基序列结合 ,抑制 其活化转录功能 ,从而发挥其抗增殖作用。推测 Cyc2 lin D1 ASODN通过抑制 Cyclin D1的表达 ,影响 Cyclin D1 /CDK/pRb /E2F通路 ,改变了细胞中 TS、TP、DHFR 的表达。这可能是 Cyclin D1 ASODN 能增加 52FU、 ·751·　临床消化病杂志 2005年第 17卷第 4期 　　　　　 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net MTX化疗敏感性的内在机制。 W arenius等 [ 6 ]在 16株不同类型的肿瘤细胞中发 现 Cyclin D1高表达与 CDDP耐受有关。CDDP对 Cy2 clin D1反义基因转染的喉鳞状细胞癌 CCL223细胞有 更高的杀伤率 , IC50明显降低 ,提示降低 Cyclin D1表 达可能会增强 CDDP的 DNA 损害作用 [ 7 ]。另外 ,降 低 Cyclin可能通过阻断自分泌的有丝分裂信号 ,从而 增加细胞对 CDDP的敏感性 [ 8 ]。Cyclin D1 ASODN能 增加胃癌对 CDDP化疗的敏感性 ,其具体机制还有待 进一步研究。 我们的研究证实 , Cyclin D1 ASODN能抑制胃癌 细胞的生长 ,并能增加细胞对 52FU、MTX、CDDP的化 疗敏感性 ,说明 ASODN技术是一种提高化疗药物疗 效的可行方法。通过对细胞周期调控元件表达的影 响 ,改变化疗药物代谢相关酶的表达 ,从而改变了肿 瘤细胞对化疗药物的敏感性 ,为改善化疗的疗效提供 了新的途径。 参考文献 [ 1 ]　CagnoliM, Barbieri F, B ruzzo C, et al. Control of cyclin D1 exp ression by antisense oligonucleotides in three ovarian cancer cell lines[ J ]. Gynecol Oncol, 1998, 70 (3) : 372. [ 2 ]　L i W , Fan J, Hochhauser D, et al. Overexp ression of p21 /waf1 leads to increased inhibition of E2F21 phosphorylation and sensitivity to an2 ticancer drugs in retinoblastoma2negative human sarcoma cells [ J ]. Cancer Res, 1999, 57 (11) : 2193. [ 3 ]　Ghoshal K, Jacob ST. 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(收稿日期 : 2004208231) 重组人表皮生长因子局部灌注治疗急性直肠出血性溃疡 1例 高 　燕 ,石德红 ,张亚萍 ,张 　冲 ,赵明利 　 (中国人民解放军第三医院消化内科 ,宝鸡 　712000) 关键词 : 　重组人表皮生长因子 ; 　直肠出血性溃疡 ; 　局部灌注 [中图分类号 ]R574163　[文献标志码 ]D　[文章编号 ]10052541X (2005) 042158201 患者女性 , 57岁 ,因间断性便血半月余 ,加重 4 h于 2004年 3月入院。2004年 2月患者因“急性脊髓炎 ”口服强的松 50 mg, 2 周后间断排暗红色大便 ,入院前 4 h持续排暗红色血便 ,外院测血压 60 /40 mm Hg,血红蛋白 66 g/L,建立静脉通路后送来我院。 查体 :血压 100 /60 mm Hg,重度贫血貌 ,胸 2以下感觉、运动功能丧失 ,余无特殊。入院后查血常规示正细胞性贫血 ,大便常规红细 胞 3～6个 /HP,白细胞 +。反复多次大便培养及找寄生虫未发现病原体。胃镜检查正常。肠镜查示距肛门 5 cm处可见环形约占 肠腔 2 /3范围黏膜不规则隆起 ,凹凸不平 ,质软 ,表点状糜烂、渗血、脓苔 ,病变旁黏膜正常。多部位活检显示肠黏膜慢性炎症。给 予静脉止血、补充血容量、抗炎、生理盐水加去甲肾上腺素灌肠、蒙脱石散剂灌肠、肛管缠凡士林油纱条局部压迫止血治疗 12 d,效 果均欠佳。因考虑患者高位截瘫 ,手术治疗伤口不易愈合 ,遂予生理盐水 50 m l加重组人表皮生长因子 5 m l加去甲肾上腺素 6 mg 保留灌肠 9 d, 2 d后出血完全停止 , 10 d后停药。复查血常规 ,大便隐血阴性 ,出院。2月后肠镜复查病变完全消失。 急性直肠出血性溃疡 (AHRU)是一种原因不明 ,多伴发于其他严重的全身性疾病之后出现的直肠溃疡。临床特点为突出性 无痛性大量便血。内镜下可见不规则或圆形浅溃疡 ,多位于直肠末端近齿状线部位 ,约占直肠周长的 1 /3或整个周长。此类溃疡 的预后取决于原发病 ,如能止血 ,溃疡本身预后良好。 表皮生长因子 ( EGF)是一类广泛存在于人和动物体内的 ,可促进或抑制多类细胞生长的多肽 ,与细胞膜上受体结合可激活多 种酶 ,对炎性细胞、成纤维细胞、表皮细胞及血管内皮细胞有趋化作用 ,能促进 DNA、RNA和羟脯氨酸的合成 ,调节蛋白质合成 ,完 善胶原蛋白的构建 ,加快创面愈合速度。 通过对本例患者的治疗 ,我们认为对于内科常规治疗无效 ,且不宜手术治疗的急性直肠出血性溃疡的患者 ,选择 EGF局部用 药不失为一种有效方法。 (收稿日期 : 2004207215) ·851· 　临床消化病杂志 2005年第 17卷第 4期　　　　　　 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. 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