DNA甲基化与检测方法简介

37 提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。其实，早在1942年， C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关 系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能 的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因 表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基 因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴 定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号 染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003 年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国立卫生院(NIH)下属的国立癌 症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划 (Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA 甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化以及DNA甲基化的重要检测方法。 该区域的CpG二核苷酸数（#CpG） 该区域的胞嘧啶C的数目（#C） 鸟嘌呤G的数目（#C） 该区域的碱基数（#N）* DNA甲基化与CpG岛： 在人类表观遗传学研究中，最常见的就是 C p G二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要 过程是，在C p G甲基化结合蛋白 ( M e t h y l - C p G Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核 苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正 常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在 哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中 70%被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸 并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组 的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端 非翻译区和第一个外显子区，CpG序列密度非常 高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富 集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。 CpG岛的概念最早由Adr ian B i rd提出， 他称之为未甲基化的HapII小片段 (HpaII Tiny Fragment，HTF)，更正式的定义是“区域”，该 区域的序列长度至少200个碱基对，GC含量超过 50%，CpG比值(观测值/期望值) 超过0.6。 CpG 比值的计算方法如下： 最近，为了排除那些Alu重复序列，提出了更 DNA甲基化与检测方法简介 * 回目录 技术方法 38 严格的标准：长度至少500碱基对，GC含量超过55%，CpG比值大于0.65。 据估计，哺乳动物基因组中的CpG岛约有4万个。在健康人的基因组中，CpG岛中的CpG位点一般处 于非甲基化状态，而CpG岛外的CpG位点通常是被甲基化的。研究表明，DNA的甲基化在遗传印记(genetic imprinting)，胚胎发育以及维持正常细胞功能等方面发挥着重要作用。 E1 E1 E1E1 E2 E2 E2 E2E3 E3 正常细胞 肿瘤细胞 抑癌基因启动子区域的CpG岛 染色质构象发生改变，处于正常的开放状态 CpG岛高度甲基化 DNA高度甲基化 染色质处于‘开放’或‘松散状态’染色质处于关闭状态 重复序列 eg.转座元件 进入细胞周期 凋亡丧失 DNA修复缺陷 血管生成 细胞粘附功能缺失 基因化的5'-调控区域 eg.种系特异性基因 基因印记丢失，细胞过度增长 不合适的细胞特异性表达 基因组脆性增加 内寄生序列被激活 肿瘤发生 未甲基化的CpG 甲基化的CpG 肿瘤生成中的DNA甲基化改变模式 (取自Esteller M，Nat Rev Genet 2007, 8(4):286-298) DNA甲基化与肿瘤发生： DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的 一个重要因素。这些变化包括CpG岛局部的高甲基 化和基因组DNA低甲基化状态。如图1左所示，在 正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的CpG岛处 于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常 的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。 而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化， 染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从 而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺 陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致 肿瘤发生。同样，如图1右所示，对于在正常细胞 中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其 甲基化水平降低，这些基因将表达和重复序列将激 活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合 适的细胞特异性表达，基因组脆性增加，以及内寄 生序列(endoparasitic sequence)激活，最终也导致 肿瘤发生。 生命奥秘 www.lifeomics.com 回目录 39 由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组 水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。近 年来，不断有研究显示人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，而且早在肿瘤临床确诊之前就可检 测出特异基因的甲基化异常现象。所以甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿 瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。 DNA甲基化检测方法： 随着DNA甲基化研究的不断深入，其检测方 法也层出不穷。这些方法针对不同研究目的，运用 不同的处理方法，几乎涵盖了从基因到基因组各 个层次水平的研究。据检测样本不同，可以分为 DNA和mRNA。现有方法，绝大部分都是取样于细 胞的DNA，根据研究水平，又将这些方法归为3大 类，即：基因组甲基化水平(Methylation Content) 的分析，候选基因甲基化的分析以及基因组层次 的DNA甲基化模式(Methylation pattern)与甲基化 谱(Methylation Profiling)的分析。主要方法分述如 下： A．基因组甲基化水平 (Methylation Content) 的分析: 1. 高效液相色谱 (High-performance Liquid Chromatography, HPLC) HPLC是一种比较传统的方法，是根据DNA或 蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在 动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以 定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增高。故 而能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。 该方法由Kuo等1980 年首次报道。过程是将DNA样 品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色 谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值 及其量，计算5 mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基 因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化 水平的标准方法。 2 . 高效毛细管电泳法 (High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物 中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下 不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水 性等不同而相互分开。用HPCE方法处理DNA水解 产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。 在这两种方法的基础上，不断有新方法改 进，包括，变性高效液相色谱(DHPLC)，逆向高 效液相色谱(Reversed phase HPLC)以及HPLC与 薄层色谱(Thin-layer Chromatography, TLC)相结 合的HPLC-TLC方法。除上述方法外，还有其他 原理的检测方法，如单纯的TLC方法以及最佳近邻 TLC(Nearest neighbour TLC)，基于抗5mC的免 疫学技术(Anit-5mC immunological techniques)， SssI 甲基转移酶法 (SssI methyl Acceptance Assay)，在重亚硫酸盐处理的基础上而进行的氯 乙醛反应法(Chloacetaldehyde reaction)和酶区甲 基化分析(Enzymatic Regional methylation Assay, ERMA)。 必须指出，以上各种方法虽然能够明确检测出 目的序列中所有CpG位点的甲基化状况，但并不能 对甲基化位点进行定位。 B．候选基因 (Candidate Gene)甲基化分析: 1 .甲基化敏感性限制性内切酶 - P C R / Southern法 ( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/ Southern) 这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对 甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小 的片段后，进行Southern或PCR扩增分离产物， 明确甲基化状态再进行分析。常使用的甲基化敏感 的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ- Xmal(CCCGGG)等。 2. 重亚硫酸盐测序法 (Bisulphite Sequencing) 该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基 化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧 啶保持不变，行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部 转化成胸腺嘧啶，最后，对PCR产物进行测序并且 与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲 基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每 一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测 序，过程较为繁琐、昂贵。 3. 甲基化特异性的PCR (methylation-specific PCR, MS-PCR) 同样，该方法中，DNA先用重亚硫酸盐处理， 随后行引物特异性的PCR。其 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 两对引物，分别 与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合 处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲 基化DNA链。检测MS-PCR扩增产物，如果用针对 处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明 回目录 该被检测的位点存在甲基化；反 之亦然。 4. (MethyLight) 结合重亚硫酸盐处理待测 DNA片段，设计一个能与待测位 点区互补的探针，探针的5’端 连接 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 荧光，3’端连接淬灭 荧光，随后行实时定量PCR。 如果探针能够与DNA杂交，则 在PCR用引物延伸时，TaqDNA 聚合酶5 '到3 '端的外切酶活性会 将探针序列上5'端的报告荧光切 下，淬灭荧光不再能对报告荧光 进行抑制，这样报告荧光发光， 测定每个循环报告荧光的强度即 可得到该位点的甲基化情况及水 平。本方法高效，迅速，具备可 重复、所需样本量少、不需要电 泳分离的特点。 5. (Pyrosequencing) 该方法，由4种酶催化同一 反应体系中的酶级联化学发光反 应，在每一轮测序反应中，只加 入一种dNTP，若该dNTP与模 板配对，聚合酶就能将其加入到 引物链中并释放出等摩尔数的焦 磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可 见光信号，并由PyrogramTM转 化为一个峰值，其高度与核苷酸 数目成正比。当用于甲基化检测 时，经重亚硫酸盐处理的序列可 以看作是C-T型的SNP改变。其 操作简单，结果准确可靠，可以 行大规模分析。 6. (combined bisulfiterestriction analysis, COBRA) 这种方法对标本DNA行重 亚硫酸盐处理及PCR扩增，处 理后原甲基化的胞嘧啶被保留， 而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧 啶。随后用限制性内切酶对转化 40 后PCR产物切割的特性以识别 原标本DNA的甲基化状况。该 方法相对简单，不需预先知道 CpG位点及样本序列。 C. 基因组范围的DNA甲基 化模式 (Methylation　pattern) 与甲基化谱 ( M e t h y l a t i o n Profiling)分析: 1 . 限制性标记基因组 扫描 (Restriction Landmark Genomic Scanning, RLGS) RLGS是最早适用于基因 组范围DNA甲基化分析的方法 之一。该方法先用甲基化敏感 的稀频限制性内切酶NotⅠ消 化基因组DNA，甲基化位点保 留，标记末端、切割、行一维 电泳，随后再用更高频的甲基 化不敏感的内切酶切割，行二 维电泳，这样甲基化的部分被 切割开并在电泳时显带，得到 RLGS图谱与正常对照得出缺失 条带即为甲基化的可能部位。 2 . 甲基化间区位点扩 增 (ampl i f i ca t ion o f in ter - methylated sites, AIMS) A I M S是基于任意引物 PCR (Arbitrary Primed PCR)的 一种方法，由于任意引物PCR 使用寡核苷酸连接子(linker) 进 行连接，不需要依赖任何序列 的先验信息。在该方法中，用 来进行扩增的模板序列首先通 过甲基化敏感的限制性内切酶 进行消化而富集，其特异性由 该酶酶切片断一端的特定序列 结合连接子来保证。随后，由 内切酶进行第二次消化，再次 连接，提纯进行PCR扩增，最 后电泳，提取目的序列进行测 序。 3 . 甲基化 C p G岛扩增 (Me thy la ted CpG- i s l and amplification, MCA) M C A也是基于任意引物 PCR的方法，该方法使用两种 对甲基化具有不同敏感度的限 制性内切酶 (如SmaI和XmaI)先 后进行消化，然后对甲基化敏 感的限制性酶切片断进行接头 (Adaptor)连接，行PCR，那些 富含CpG的序列就会被选择性 的扩增。该方法对甲基化分析 和克隆甲基化差异性基因都非 常有帮助。 4 . 差 异 甲 基 化 杂 交 (D i f f e ren t i a l Me thy l a t i on Hybridization,DMH) D M H属于一种芯片技 术，在该技术中，包括扩增子 (Amplicon)生成和CGI文库筛 选两个重要组成部分。在扩增 子生成中，首先用MseI来酶切 DNA样本，然后接上连接子， 并去除重复序列，这时的样本 一分为二，其一直接进行PCR 扩增，生成仅由MseI处理过 的扩增子，而另一半则用甲基 化敏感的酶BstUI进行消化， 然后进行P C R扩增，生成由 MseI/BstUI共同处理过的扩增 子。CGI文库通过筛查出重复 序列，然后进行PCR，选出含 有BstUI位点的克隆，最后这些 克隆一式两份点到芯片上，制 备成CGI芯片。然后把两种不 同的扩增子分别杂交到相应的 CGI克隆点上，最后通过差异 性对比检测出那些未甲基化位 点。 5. 由连接子介导PCR出的 HpaII小片断富集分析 (HpaII t iny fragement Enrichment by Ligation-mediated PCR, HELP) 该方法用HpaII与其对甲基 化敏感同裂酶MspI对同一基因 组序列进行消化，产生不同的 代表性序列，然后对此序列进 行连接子介导的PCR，瑞和进 甲基化荧光法 焦磷酸测序 结合重亚硫酸盐的限制 性内切酶法 生命奥秘 www.lifeomics.com 回目录 41 行电泳等比较分析或将此DNA样本共杂交到基因 组芯片上进行分析。这种方法已经揭示了大量的组 织特异性，差异甲基化区域，并用于正常细胞和癌 症细胞的基因组比较分析。 6. 甲基化DNA免疫沉淀法 (Methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP) 这是一种高效富集甲基化DNA的方法。在该 方法中，可与5mC特异性结合的抗体加入到变性的 基因组DNA片段中，从而使甲基化的基因组片断 免疫沉淀，形成富集。通过与已有DNA微芯片技 术相结合，从而进行大规模DNA甲基化分析。该 方法简便，特异性高，适合DNA甲基化组学(DNA Methylome)的分析。 [1] Esteller M: Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. 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