下载

0下载券

加入VIP
  • 专属下载券
  • 上传内容扩展
  • 资料优先审核
  • 免费资料无限下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 流式细胞术检测凋亡的方法

流式细胞术检测凋亡的方法.pdf

流式细胞术检测凋亡的方法

慧爱永恒
2012-06-03 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《流式细胞术检测凋亡的方法pdf》,可适用于高等教育领域

多色流式分析试剂典范流式检测细胞凋亡几种方法的比较年月合肥wwwgotofcmcomwwwgotofcmcom多色流式分析试剂典范凋亡简介wwwgotofcmcomwwwgotofcmcom细胞膜事件线粒体事件Caspase事件细胞核事件检测中面临的问题多色流式分析试剂典范凋亡简介wwwgotofcmcomwwwgotofcmcomwwwgotofcmcom凋亡与坏死wwwgotofcmcom凋亡的途径外源性途径内源性途径wwwgotofcmcom凋亡启动细胞内Ca动员★Caspase激活脱水致细胞皱缩核染色质凝缩★线粒体膜电位丧失★细胞膜PS外翻★核碎片形成★DNA被切割成低分子量片段细胞内酸化凋亡小体形成凋亡启动凋亡早期凋亡中期凋亡晚期多色流式分析试剂典范wwwgotofcmcomwwwgotofcmcom细胞膜事件wwwgotofcmcom细胞膜事件AnnexinVƒ正常细胞(NormalCell):膜内磷脂酰丝氨酸(PS)膜外磷脂酰胆碱、鞘磷脂ƒ凋亡细胞(ApoptoticCell):膜内磷脂酰丝氨酸(PS)膜外磷脂酰胆碱、鞘磷脂、PSwwwgotofcmcom细胞膜事件AnnexinV坏死细胞早期凋亡细胞活细胞ƒ检测方法:收集细胞并重悬于BindingBuffer(结合液)中加荧光标记的AnnexinV和PI流式细胞仪检测结果室温、避光孵育分钟独立的核膜破损严重的细胞晚期凋亡细胞yujia高亮yujia高亮wwwgotofcmcom细胞膜事件AnnexinVƒ检测特点:简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。¾细胞制备(如贴壁细胞)或储存时细胞膜的破损会导致PS跨膜分布的改变造成假阳性¾巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时AnnexinV检测也会阳性。™注意事项:yujia高亮yujia铅笔yujia铅笔多色流式分析试剂典范wwwgotofcmcomwwwgotofcmcom线粒体事件wwwgotofcmcom线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃ƒ发生在凋亡的早期ƒ可能与细胞色素c和AIF的释放相关在存在活化Caspase的细胞中持续一段时间后恢复正常yujia铅笔yujia铅笔wwwgotofcmcom线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃ƒ染料JC(,’,’tetrachloro,’,,’tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineiodide)亲脂性阳离子荧光染料正常细胞线粒体内多聚体红色荧光(Ex:nm,Em:nm)凋亡细胞细胞质内单体绿色荧光(Ex:nm,Em:nm)喜树碱(CPT)诱导HL细胞凋亡小时后用JC检测线粒体膜电位的改变。可见凋亡细胞红色荧光降低。yujia铅笔yujia高亮wwwgotofcmcom线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃ƒ检测方法:收集细胞于MitoCapture溶液(含JC)中离心、去上清重悬于孵育缓冲液中oC孵育分钟流式分析FL:凋亡细胞FL:正常细胞ƒ检测特点:¾简便¾快速产品名称产品编号规格生产商KtestsBiovisionKtestsBiovisionMitoCaptureTMApoptosisDetectionKit™注意事项:¾最近研究发现线粒体膜电位的崩溃在有些细胞中并不是细胞色素c和AIF释放的必需条件。yujia高亮yujia铅笔多色流式分析试剂典范wwwgotofcmcomwwwgotofcmcomCaspase事件wwwgotofcmcom荧光标记的Caspase抑制性底物ƒ荧光标记的Caspase抑制性底物膜通透性高不可逆结合荧光标记的Caspase抑制性底物被凋亡细胞摄取并结合而正常细胞不能结合该底物。因此洗涤后凋亡细胞可检测到荧光正常细胞则不能。ƒ检测原理:FITC(Rhodamine)VADFMK(通用)FITC(Rhodamine)VDVADFMK(Caspase)FITC(Rhodamine)DEVDFMK(Caspase)FITC(Rhodamine)IETDFMK(Caspase)FITC(Rhodamine)LEHDFMK(Caspase)活化Caspase的检测细胞凋亡时活化Caspase的检测。Jurkat细胞无诱导(A)或用喜树碱诱导h后使用CaspGLOWTMFITCCaspaseStainingKit(产品编号:K)检测活化的Caspase。yujia铅笔wwwgotofcmcom荧光标记的Caspase抑制性底物活化Caspase的检测ƒ检测方法:诱导细胞凋亡加入荧光标记的抑制性底物(如FITCVADFMK等)离心、洗涤次oC孵育小时重悬细胞、流式分析FITC:FLRhodamine:FLƒ检测特点:¾简单¾灵敏¾快速(小时)yujia铅笔wwwgotofcmcom™注意事项:荧光标记的Caspase抑制性底物的特异性不够高在凋亡细胞中可能也会与Caspase以外的蛋白结合。适用于区分凋亡和坏死的细胞。荧光标记的Caspase抑制性底物活化Caspase的检测产品名称规格生产商CaspGLOWTMGreen(Red)MultiCaspaseStaningKitteststestsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)CaspaseStaningKitteststestsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)CaspaseStaningKitteststestsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)CaspaseStaningKitteststestsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)CaspaseStaningKitteststestsBiovisionwwwgotofcmcomƒDR(aspartyl)rhodamine二门冬氨酰罗丹明–Caspase通用底物¾膜通透性高¾DR为非荧光物质¾DR被活化的Caspase剪切后释放出Rhodamine发出绿色荧光Caspase底物活化Caspase的检测CaspSCREEN凋亡检测试剂盒对凋亡的分析。喜树碱(Campothecin)(uM)诱导Jurkat细胞小时收集细胞并用CaspSCREENCaspaseScreeningKit(产品编号:K)染色流式分析。wwwgotofcmcomCaspase底物活化Caspase的检测ƒ检测方法:收集细胞并重悬于DRIncubationBuffer(孵育液)中加DTT和DR流式细胞仪分析(FL通道)ExEm=nmoC孵育分钟¾简单¾高度敏感¾快速(分钟)¾特异性高ƒ检测特点:产品名称产品编号规格生产商KtestsBiovisionKtestsBiovisionCaspSCREENTMCaspaseScreeningKityujia铅笔多色流式分析试剂典范wwwgotofcmcomwwwgotofcmcom细胞核事件wwwgotofcmcom亚二倍体峰(凋亡峰)凋亡细胞比例细胞周期分布凋亡发生的时相ƒ染料:PI(碘化丙啶)wwwgotofcmcom亚二倍体峰(凋亡峰)™注意事项:¾固定:乙醇不能用多聚甲醛。联科公司即将引进小片段DNA高效抽提试剂盒。对照(未诱导凋亡)凋亡(常规方法抽提)凋亡(高效抽提)yujia高亮yujia高亮wwwgotofcmcom亚二倍体峰(凋亡峰)™注意事项:¾试剂的选择不能用抽提细胞核的试剂:BD公司的CycletestPlusDNAReagentKit(用去污剂Sperminetetrahydrochloride破膜)BeckmanCoulter公司的DNAPrepReagentSystem(用DNAPrepLPR破膜)凋亡细胞的核碎片被误认为多个凋亡细胞进行有丝分裂的标本破膜后释放出的多个染色体或其聚集体被误认为多个凋亡细胞细胞辐射等造成的微核体也可被误认为多个凋亡细胞。¾若凋亡发生在G,M或S期晚期DNA含量可能会等同于G期或S期早期导致检测失败¾现有DNA分析软件(ModfitMultiCycle)的缺陷。yujia铅笔wwwgotofcmcomTUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)ƒ检测原理:TdTdUTPBrdUTP荧光标记的dUTPBrdUTP抗体™注意事项:BrdUTP的掺入率显著高于dUTP因此检测灵敏度高而且经济。yujia铅笔wwwgotofcmcomTUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)用树碱(CPT)诱导HL细胞凋亡、和分钟时用TUNEL(BrdUTP)PI双染法检测DNA断裂同时分析细胞周期。可见凋亡随着诱导时间的增加而增多且可知凋亡发生的时相。凋亡细胞凋亡细胞wwwgotofcmcomTUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)ƒ检测方法:TdTFITCdUTP标记细胞固定细胞组织TdTBrdU标记细胞洗细胞AntiBrdUFITC染细胞PIRnase处理流式分析ApoBrdUKit洗细胞PIRnase处理ApoDIRECTKit洗细胞洗细胞流式分析洗细胞固定:多聚甲醛(交联型)TUNELPI双染:¾区分凋亡和非凋亡细胞¾同时分析细胞周期yujia铅笔yujia高亮yujia高亮yujia高亮wwwgotofcmcomTUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)产品名称产品编号规格生产商ApoBrdUDNAFragmentationAssayKitKtestsBiovisionApoDirectDNAFragmentationAssayKitKtestsBiovision¾成纤维细胞、上皮细胞凋亡时并不发生核小体间DNA的断裂(DNA仅断裂为kb的大片段即终止)TUNEL法的灵敏度无法检测出™注意事项:yujia高亮yujia高亮yujia高亮多色流式分析试剂典范wwwgotofcmcomwwwgotofcmcom检测中面临的问题wwwgotofcmcom检测时面临的问题阳性和阴性质控:产生误差的原因:¾非典型性凋亡¾操作不当TUNEL实验时TdT酶因保存不当而失活染色时出现错误。解决方法:¾设立阳性质控¾设立阴性质控自己制备质控细胞或由公司提供(如TUNEL法试剂盒内包含了阳性和阴性质控细胞)wwwgotofcmcom凋亡假阳性:产生原因:¾PS的外翻使得凋亡细胞和凋亡小体很容易被邻近的细胞所吸附并被吞噬¾吞噬细胞并非仅为专职的吞噬细胞(如单核和粒细胞)成纤维细胞或上皮细胞也具吞噬作用。尤其是实体瘤常可见在凋亡细胞周围的肿瘤和非肿瘤细胞中有含有凋亡小体的吞噬体。例证:¾化疗后患者骨髓中的非凋亡细胞主要是单核和巨噬细胞中可发现大量的凋亡小体且TUNEL法检测时强阳性。BednerE,LiX,etalCytometry:¾邻近细胞吞噬凋亡细胞后的残留物中即包含了变化的细胞膜、断裂DNA等凋亡特征物。¾即使很轻微的处理如胰酶消化、机械振荡、细胞刮取等均会造成PS的外翻。检测时面临的问题wwwgotofcmcom区分凋亡、坏死和凋亡的“坏死期”:产生原因:¾晚期凋亡与坏死相似细胞膜破裂用PI排染和AnnexinV结合实验无法区分。解决方法:¾形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。¾胰酶消化时间过长、机械损伤(如细胞刮取、肿瘤细胞分离或反复离心等)、电穿孔或某些药物处理时细胞膜的通透性和对称性均会改变。检测时面临的问题yujia高亮yujia高亮yujia高亮yujia高亮yujia高亮yujia铅笔wwwgotofcmcom样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失检测时面临的问题¾贴壁培养细胞的分离密度梯度离心(Ficoll或Percoll)选择性丢失即将死亡和死亡细胞因凋亡早期细胞脱水核和胞浆皱缩其密度高于非凋亡的细胞。¾密度梯度离心凋亡早期细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。将培养液和消化下来的细胞合在一起胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞导致丢失。¾反复离心和机械振荡离心时某些细胞可静电吸附在管壁上。如白细胞中的单核和粒细胞在反复离心时丢失而淋巴细胞仍留在悬液中。加入过量的载体细胞如鸡红细胞等凋亡细胞尤其是晚期凋亡细胞很脆弱在反复离心或振荡时易碎。加入血清或白蛋白、缩短离心时间、降低离心转速yujia高亮yujia高亮yujia高亮wwwgotofcmcomwwwgotofcmcomwwwantibodycn

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

评分:

/34

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利