HPLC法测定银杏叶中6种黄酮成分的含量

药学学报 Acta Pharmaceutiea Sinica 1997，32(8)：62．5--628 ·625 HPLC法测定银杏叶中6种黄酮成分的含量 池静端 何秀峰 刘爱茹 徐礼棠 2乒 r／ — — — — ～ _ — — — — — ～ ， (中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所，北京 100050) 摘要 用反相高效液相色谱法测定了银杳叶中 6种黄酮成分即槲皮素(quereetin)、异鼠李素 (isorharrmetin)、山萘酚 (kaempferot)、白果黄 素 (bilobetin)、银 杏黄 素 (ginkgetin)、西 阿多黄 素 (sciadopitysin)。单酚酸B(salvianolic acid B)为内标。井对 l8个样品进行了测定。色谱柱为Zorbax ODS 柱．流动相：A．MeOH，B．THF—H2O--HC(X)H(34：65：1)，梯度洗脱。流速：1．0 ml·min ．检测波长：350 nm。线性范围0．10--2．57 g，相关系数 =0．9994～0．9998，回收率 98．0％～102 0％。本法准确、快 速、重现性好，为生产及工艺研究提供质量控制依据。 关键调 银杳；黄酮；反相高效液相色谱法 『1J，L 银杏(Ginkgo biloba L．)又名公孙树，是最 古老的植物之一，有裸子植物活化石之称。据 (本草纲目)记载，银杏果具有敛肺平喘、止遗 尿、白带的作用⋯。近20年来，药理研究表明， 银杏叶中的黄酮成分具有扩张冠状动脉血管， 增加脑血流量，改善脑营养及抗菌作用_2]，有 较高的药用开发价值。国内外学者对银杏叶中 黄酮成分的定量分析方法较多，有比色法_3]、 胶束毛细管电泳法H 和 HPLC法 J。在已 舯 阳 【 ：R=OH Ⅱ ：R=OCII8 m ：R=H 材 料 与 方 法 报道的HPLC法中，未见6种黄酮成分同时测 定的方法。本文首次采用反相高效液相色谱 法，测定了银杏叶中 6种黄酮成分槲皮素 (quercetin，I)，异鼠李素( rhal'nnetin，II)，山 奈酚(kaempferol，III)，白果黄素(bilobetin， Iv)，银杏黄素(ginkgetin，V)，西阿多黄素 (sciadopitisin，vi)。考察了6种黄酮成分的提 取、分离及测定等条件。本法可用于银杏叶及 银杏叶提取物的分析。6种黄酮结构如下： ⋯ ： Y V ：Rl=Me'Rz=H 、『I：Rl=Rz=Me 仪器、药品 仪器 HP高效液相色谱系 统：HP1090型高效液相色谱仪，79994A分析 工作站，1040型二极管阵列检测器。 本文于 1996年9月23日收到。 标准品 内标物单酚酸B(salvianolic acid B)由本所提供。6种黄酮成分由作者从银杏叶 中提取、分离获得。经HPLC检查，纯度均在 99％以上。 样品 银杏提取物由徐州药厂提供。银杏 叶自采。试剂规格均为AR级。 维普资讯 http://www.cqvip.com 626· 药学学报 Acta Pimrmac~utica Sird~ 199"7．32(8)：625--628 色谱条件 色谱柱：ZorSax ODS cl8柱 (150 him X 4 mm ID，5脚 )，流动相：A． MeOH B．四氢呋喃 (THF)一H2O---HCOOH (34：65：1)，梯度洗脱，洗脱程序见表 1；流速：1 ml·rain。；检测波长：350 rtrrt；色谱柱温25℃。 Tab 1 Gradients of mobile phase (flow rate：1．0 ml·min ) 结 果 1 流动相、内标物和检测波长的选择 比较了不同系统和比例的流动相，如甲醇 一 水，甲醇一0．5 tool·LI1磷酸二氢钠，乙腈一 水．四氢呋哺一水一甲酸一甲醇等系统。结果 表明以A．甲醇，B．四氢呋哺一水一甲酸(34：65 ：1)为流动相，梯度洗脱，分离效果好。圈1为 6种黄酮粗提物的HPLC色谱图。 l0 如 帅 t~(min) Fig 1 HlPLC chromatogram of sample extracts and internal standard． I． Quercefin； II． Isorhanmetin；III．Kaempferol；IV．Bilobetin； V．Ginkgetin VI．Scladopitisin；IS．S vial∞· lie addB． 试验了维生素B12、单酚酸A、单酚骏B、迷 迭香酸、大豆甙元、葛根素等为内标。结果表明 单酚酸B作为内标较合适，内标物与银杏叶中 的黄酮成分及其杂质蜂不重叠。 将从银杏叶中得到的6种黄酮及内标物单 酚酸B在UV-3000型(岛津)分光光度计上分 别进行光谱扫描，单酚酸B在350 nn2波长处 吸收最强．而6种黄酮成分在350 nm处均有较 强吸收，故选择350 nm为检测波长。 2 线性关系 精密称取 6种黄酮标准品各约 l0～20 mg，加 THFmMeOH(1：2)溶解并定窖至 l0 mI。精密称取单酚酸B 10 rag，以甲醇溶解并 定容于2 ml量瓶中。分别吸取各标准溶液 10 -- 60 I，置 5只1 ml量瓶中，各加入内标液(5 mg·ml0)60 l，加甲醇至刻度，摇匀。按上述 色谱条件，进样1O l测定，得到6条直线。其 线性范围及相关系数为 I：0．107～1．284 g， 7=0．9998；II：0．104～1．041／zg，7=0 9996； III：0．100～1．920旭 ，T=0．9996；IV：0．10l～ 1．010 ，7=0．9997；V：0．192～ 1．920 ， ：0．9994；VI：0．115--2．574 g， =0．9995。 3 校正因子 精密吸取各标准溶液50 ，置 1 ml量瓶 中，加内标液60 l，加甲醇至刻度、摇匀。在上 述色谱条件下进样-10 l，渊得校正因子：I= 4．941，II=3．102，III：4．403，IV=4．401，V= l4．97，VI=10．43。 4 回收率硬精密度试验 取等量的样品5份，其中3份加入一定量 混合标准液，依法提取、分离及渭定。计算回收 率。结 果 为 I：98．0％．II：102．0％，III： 100．1％。IV：98．7％，V：104．2％，VI：96．0％。 取“校正因子项”标准混合溶液10 l，连续 进样 1O次，进行测定。计算相对标准偏差 (P．SD)为 I：1．2％，II：1．8％，III：1．1％，IV： 1．3％，V；3．0％，VI：4．1％。 5 提取条件的选择 提取方法：首先选用不同溶剂(甲醇、丙酮、 乙醚)直接对银杏叶粉进行热回流提取。在 I-IPLC上可看出银杏叶中双黄酮含量很高，而 山奈酚、异鼠李素、lI}皮素等单黄酮甙元的含量 很低，它们多以各种甙的形式存在于银杏叶中， ． ， } ． 维普资讯 http://www.cqvip.com 药学学报 Acta Pharrnaceutica Sinica 1997．32(8)：625--628 ·627 无法在 HPLC上直接检测到，故改用酸解后热 回流的方法。 提取溶剂：选择甲醇、乙醇、丙酮作为溶剂， 按“测定方法”项操作，测定黄酮含量。结果表 明丙酮提取效率最好。 提取时间：曾试验了丙酮回流提取 0．5， 1．0，1．5，2．0 h及2．0 h(提取2次)测定总黄酮 含量，结果表明回流提取 1．5 h已使黄酮成分 提取完全。 6 测定方法 准确称取银杏叶细粉(60目)4 g，加丙酮 80 ml，25％盐酸 20 ml，回流 1．5 h，滤过，滤渣 用100 ml丙酮冲洗，浓缩后加 甲醇一僻 (2：1)于50ml量瓶中，取适量于离心管中，离 心10rain，吸取上清液0．5 ml，加入内标液60 l，加甲醇--THF(2：1)溶液定容于 l ml量瓶 中，摇匀，进样 l0 l。按上述色谱条件进行分 离测定，以内标法计算含量。 7 样品分析 用本法对不同产地银杏叶及银杏提取物进 行测定，结果见表2。 Tab 2 Results of determination of crude drugs (1)Male tree；(2)Female tree~(3)Extracts provided by factory 对银杏叶样品的测定结果表明．雌树中的 6种黄酮成分总量高于雄树。与文献报道【3]一 致。 在所测定的不同产地的样品中，广东南雄 产银杏叶中6种黄酮总含量最高．可能与广东 亚热带地理环境有关。 从北京不同地区、不同采集时间的银杏叶 中6种黄酮成分含量分析可以看出，9月下旬 采集的银杏叶中6种黄酮含量比10月下旬银 杏叶中黄酮含量高。与文献 报道结果一致。 讨 论 流动相中加入一定量的酸对黄酮成分的色 谱行为影响很大。加入适量的酸可改善黄酮色 谱峰的拖尾现象，使峰形对称。 甲醇和四萤呋喃对山奈酚与槲皮索分离作 用不同，前者使山奈酚先于异鼠李索流出色谱 维普资讯 http://www.cqvip.com 628· 药学学报Acta Phalt~naeeutica Siniea 1997．32(8)：625--628 柱，而后者则相反。但甲醇一水系统不能使上 述两种成分完全分离，而甲醇一THF一水系统 因甲醇和THF对两种成分的分离作用相反也 5 不能很好分离。TH卜 水系统对上述两种成 分能够获得满意的分离效果。 双黄酮成分在多数溶剂中的溶解度较小， 而在THF中却能很好溶解，因此在配制双黄酮 6 标准溶液时可以选THF作为溶剂。 参 考 文 献 7 1 中国医学科学院药物研究所编．中药志．第三册．第 二版．北京 }^ 民卫生出版社．1982：295 2 <全国中草药汇编)编写组辅．全国中草药汇编 上 册．北京：人民卫生出版社，1982：295 8 3 陈秀珍．银杏叶不同生长期总黄酮的古量测定．广 西植物．1988．8：363 4 Pietta P， Mauri P， Rava A， et a1． Application of miceUar electrokinetic capillary ehronmtogmphy to the determination of flavonoid dru~s．J Chromatogr，1991，549：367 Hasler A，Sfieher O，Meier B．High·perfor· m~clce liquid chromatographic determination of five widespread aglycones．J Chromatogr， 1990，5O8：236 Pietta P Mauri P， Bruno A， et a1． Identification of flavonoids from G／nkgo 6口 L． by HPLC with diode-array UV detection．J CAromatogr，1991，553：223 Hasler A，Sticher O，Meier B．Identification and determ ination of the flavonoids from G／nkg~o biloba by HPLc．J Chromatogr， 1992．6O5：41 Lobstein A．Rietsch-jako L，Hang·Berrurier M． 甜 a1． Seasonal variations of the fla~noids c~ntent from Ginkgo biloba leaves．P nta Med．1991 57：430 HPLC DETERMINATION OF sIX FLAVONOID CONSTITUEN I IN GIN蠡 GO BILoBA LEA JDChi，XFHe，AR Liu and LXXu (Institute ofMaterla Medica，ChineseAcademy Medical Sciences andPekingUnionMedicalCollege，l~ijing100050， ABSTRACT Six ilavonoid constimants(quercefin，isorhamnefin，kaempfeml，bilobetin， ginkgetin and sciadopitysin)were isolated from G／~go b／／oba leaves and determined by ro／el'~d phase HPLC using salvianolic acid B as internal standard．T e coluran employed was Zorhax ODS(150 mm ×4 mm ID，5 m)．The mobile phase cons~ted of solvent A (methano1)and solvent B [tetrahydmfuran— water—formic acid(34：65：1)]for gradient elution．The flow rate was 1 rrd·min一 and detection was e{feeted at 350 nm．This method is acctliatc．rapid and reproducible． Analytical data for various samples were given． KEYWO砌】s Qnkgo biloba L．：171avonoids；RP．唧 LC 维普资讯 http://www.cqvip.com