质谱差谱方法及其在中药复方研究中的应用

Vo1．28 2 0 0 7年2月 高 等 学 校 化 学 学 报 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES No．2 250—253 质谱差谱 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 及其在中药复方研究中的应用 冉小蓉 ，杨辉华 ，梁琼麟 ，陈 君 ，王义明 ，罗国安 ， 李 平 ，李克明 ，陈玉武 (1．清华大学化学系，北京 100084；2．中13友好医院临床医学研究所，北京 100029) 摘要 采用HPLC．ESI．MS 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 得到了复方合煎液中有效部分提取物的指纹图谱数据，通过比对找出对复方 指纹谱有贡献的有效成分峰．再用质谱差谱方法处理多级质谱数据，提取不同类型的中性丢失，实现了对复 方有效成分化合物的快速分类鉴定．用该法研究了复方柴苓汤有效部分黄芩总黄酮和柴胡总皂苷． 关键词 质谱差谱方法；液相色谱一质谱；中药复方；有效部分；柴苓汤 中图分类号 065 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2007)02-0250-04 液相色谱．质谱联用(LC．MS／MS)，已被广泛用于各种复杂样品的分析，然而对这些复杂样品中的 化合物指认却一直是质谱分析的关键和难点，迫切需要发展相关方法对化合物进行快速筛查． Qu等⋯利用空间串联质谱中性丢失扫描模式对中性丢失明确的类别化合物进行了分类搜索．中药复 方有效部分研究是推动中药现代化的关键环节 l3 J，中药有效成分组成复杂，需要采用一套系统的研 究手段，以便快速并尽可能全面地搜索有用信息．高效液相色谱-电喷雾多级质谱联用技术(HPLC．ESI． MS )作为一种复杂系统的分析手段为中药复方研究提供了有利工具 ]．传统中药柴苓汤为仲景《伤 寒论》中著名方剂小柴胡汤及五苓散的合方，在临床上广泛用于治疗慢性肾脏病，疗效确切" 】．柴胡 和黄芩被认为是柴苓汤中的君、臣两味药，柴胡中最有效的成分是以柴胡皂苷 d为代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的皂苷类化合 物 ]，黄芩中最有效的化合物是以黄芩苷为代表的黄酮类化合物 ． 本文利用 HPLC-ESI-MS“分析，发展了质谱差谱方法对复方复杂体系中未知化合物的分类搜索， 并以中药复方柴苓汤为研究对象，对其有效部分黄芩总黄酮和柴胡总皂苷进行了研究． 1 质谱差谱方法原理 质谱多级碎片扫描(MS )可使母离子进行多级分离和碎裂，这种逐级碎裂允许有单独的碎裂路径， 并由此提供复杂基质离子碎裂过程中彼此间的亲缘关系，为了解化合物的结构特征提供重要的信息． 中药中的有效部分是一类化学性质和结构近似的化合物，这些化合物在电喷雾质谱中易通过母离 子产生相同的中性碎片．例如羧酸类化合物在负离子扫描模式中产生中性丢失m／z 44；苷类化合物在 正负离子模式中产生糖丢失行为，如中性丢失鼠李糖(m／z 146)和中性丢失葡萄糖(m／z 162)等．这些 特征丢失在电喷雾质谱中极易发生，丢失后得到的二级子离子往往强度最高．但对于中药这一复杂体 系，一张图谱中包含有成千上万个化合物的信息，如何快速对这些信息进行提取，找出关键有用的信 息是中药分析的关键环节．为实现这一目的，本文发展了质谱差谱方法，将多级质谱数据导出，应用 计算机程序按照离子碎裂过程中的亲缘关系将母离子的m／z与其丰度最强的二级子离子m／z相减，得 到该母离子在碰撞诱导解离(CID)中的中性丢失m／z．根据此 m／z值，可对不同中性丢失的化合物进 行归类，从而实现对化合物进行快速分类搜索，并进行有针对性的指认． 基于上述思想，本文选取复方中药柴苓汤为研究对象，对其有效部分黄芩总黄酮和柴胡总皂苷进 收稿日期：2006-03—17． 基金项 目：国家“九七三” 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项 目中医理论专项(批准号：2005CB523503)、科技部“十五”攻关项 目(批准号：2004BA721A13)、 国家“九七三”计划(批准号：2001CB510305)和清华基础研究基金(批准号：jCqn2OOSO3S)资助． 联系人简介 ：~ (1946年出生)，男，教授，博士生导师，从事生命分析化学研究．E-mail：luoga@mail．tsinghua．edu．cn 维普资讯 http://www.cqvip.com No．2 冉小蓉等：质谱差谱方法及其在中药复方研究中的应用 行了系统研究．首先建立了一套重现性好、分离度高的HPLC．ESI．MS 指纹图谱分析方法 ， 利用保留时 间、分子量及多级碎片信息综合将有效部分提取物与复方合煎液指纹图谱峰进行比对 ， 确定在复方指 纹图谱中的有效成分峰．然后，借助质谱差谱处理，对有效部分化合物进行了快速分类搜索鉴定 ． 2 实验部分 2．1 试剂与仪器 黄芩苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 对照品购于中国药品生物制品检定所；色谱纯乙腈购自 Fisher公司，二次水由imiQ系统制备．Agilent 1100 LC／MSD Trap电喷雾．离子阱质谱仪 ， Kromasil KR100-10Cls(250 mill×4．6 mm)色谱柱．流动相：A相，含有体积分数为0．4％乙酸及 10 millol／，L醋酸 铵的二次水；B相： (乙腈)： (水)=9：1，含有体积分数为0．4％乙酸及 10 mmol／L醋酸铵 ． 流速 1·2 mL／min．梯度洗脱：0～10 min，0～5％B；10～35 min，5％ ～19％B；35～50 min ， 19％ ～23％ B： 50～75 min，23％ ～50％ B；75～8O min ， 50％ -60％ B；8O-90 min，60～80％ B． 柱温4O℃．质谱检测 为负离子扫描模式，自动3级，电喷雾离子源，雾化气压力为262 kPa ， 干燥气流速为9．0 L／min，干燥 气温度为350℃．质谱扫描范围为m／z 100～1400． 2．2 样品制备 复方合煎液：将柴胡粗粉用5倍量 60％的乙醇于室温浸提 2次 ， 药液经减压浓缩得稠膏①．将泽 泻粗粉加4倍量95％乙醇回流提取2次，回流1 h，药液经减压浓缩得稠膏② ． 将黄芩、半夏、人参、 甘草、生姜、大枣、茯苓、猪苓、白术和桂枝用 12倍水煎煮2次 ， 每次煎煮 1．5 h，用 120目筛网滤过，‘ 药液经浓缩得稠膏③．合并稠膏①，②和③，混匀，经真空干燥、粉碎和过60目筛 ， 得干粉．柴胡总皂 苷制备：将柴胡粗粉加5倍量体积分数为60％乙醇浸渍提取2次 ， 浸泡 3 d，药液经减压浓缩得提取物 干膏，加质量分数为2％NaHcO，溶解，通过D。。。型大孔吸附树脂柱后 ， 将水液弃去，用95％乙醇洗脱， 收集洗脱液，减压浓缩至干，得柴胡总皂苷．黄芩总黄酮制备：将黄芩饮片加 10倍量水煎煮2次 ， 每 次 1 h，合并提取液，加浓 HC1酸化至 pH=1-2，加热至 8O℃ ， 冷却，离心，将沉淀物用少量水洗涤， 晾干，得黄芩总黄酮．分析前取 3种样品适量溶于 1：1(体积比)甲醇．水溶液 ， 以 10000 r／min速度离 心，取上清液进样． 3 结果与讨论 3．1 有效成分峰对复方指纹图谱的贡献 确定有效成分峰对复方指纹图谱的贡献，有利于寻找在复方中发挥药效的药物成分 ． 复方中药成 )(I多于刖 侏 笛 u2rln, 、万 丁 里 夕 驭 J贝懵 佰 思 进 仃 苜 珂 照 ，比牧 荑 今 l8 I _(A)l l： 15 ． 17 9 。 ^ 1 JL．．^ 2 一 25f l ；f 。 _ ．』I J )f l2fI bfJ lI 18f 一 l1f I 17t"1 吼6 (C) 27s s Z0s 2 S ／ s ：^NJl^ 完． 一～一 。^ J1 一九 H ．IL F ·1 base peal【elaro~ of Chj峨 multiherb remedy ChaUin-tang(A) ． aav蚰 oi凼 in ＆ (B)and Saikasaponim~in bup／eur~and(C) 维普资讯 http://www.cqvip.com 高 等 学 校 化 学 学 报 V01．28 皂苷与柴苓汤复方的指纹图谱来确定对复方指纹图谱有贡献的有效成分．通过比对发现，保留时间前 20 min所属的极性较强区域，黄芩总黄酮和柴胡总皂苷成分对复方色谱峰的贡献小，主要贡献都在 20 min以后．柴胡总皂苷的贡献更是集中在70 rain后的弱极性区．图1中峰 1，2，4，7，9～13，15～19 和25对应于黄芩总黄酮指纹图谱中峰1f，2f，4f，7f，9f～13f，15f～19f和25f的贡献，峰3，5，6，8， 14，20～24和26～32对应于柴胡总皂苷指纹图谱中峰 3s，5s，6s，8s，14s，20s～24s，26s～32s的贡 献．柴苓汤复方成分复杂，很多峰属于共流出峰，除了有效成分的贡献外还有其它成分的叠加，因此 在有效成分和复方指纹图谱的对比中，有的峰面积相差较大．但研究发现，复方配伍后，部分成分的 含量发生了变化，如峰9在复方中的含量明显升高，而峰27在复方中含量降低，说明复方配伍后对部 分化合物的溶出会有影响．各峰的分子量及保留时间及在有效部分中的对应峰号见表1． Table 1 The m／z and retention 6nle of the peaks Peak No． m／z t ／ ra’in Pea ‘No． 口 m／z t ／nll‘n Peal【N0 ． m／z t ／nll’n ． R tract；on traeuon traeUon 1 1f 303 20．8 12 12f 429 46．3 23 23s 941 75．1 2 2f 461 21．6 13 13f 459 48．1 24 24S 779 76．3 3 3s 515 25．3 14 14s 287 49．9 25 25f 283 78．7 4 4f 301 26．0 15 15f 459 53．1 26 26s 763 80．6 5 5s 515 28．2 16 16f 299 64．3 27 27s 779 82．6 6 6s 577 30．1 17 17f 299 65．3 28 28s 313 84．1 7 7f 475 30．6 18 18f 269 66．3 29 29S 313 84．9 8 8s 383 32．8 19 19f 269 68．4 30 30s 295 90．7 9 9f 445 35．1 20 20s 925 70．4 31 318 293 92．1 10 10f 447 39．8 21 21s 821 73．9 32 32s 293 92．7 11 11f 44 5 43．1 22 22s 329 74．2 3．2 质谱差谱有效部分化合物分类研究 柴苓汤有效部分黄芩总黄酮和柴胡总皂苷的提取物中大部分为苷类化合物，在正负离子模式中易 产生糖丢失行为，如中性丢失鼠李糖(一146)、葡萄糖酸(一176)及葡萄糖(一162)等．本文利用质谱 差谱方法对有效部分提取物的多级质谱数据进行了分析，对各种中性丢失进行整体搜寻并归类，实现 了对化合物的快速分类筛查，并重点对在复方指纹图谱中有贡献的化合物进行了鉴定． 3．2．1 中性丢失m／z 176搜索黄芩葡糖苷酸类化合物 对于葡糖苷酸类化合物，糖苷键在 CID下很 容易断裂中性丢失m／z 176(葡糖酸)，产生子离子[M—H一176]一，这是本文利用中性丢失搜索葡糖 苷酸类化合物的依据．采用质谱差 Table 2 The identification ofthe gincuronides found in P．at／／x Seutellatiae 谱方法处理了黄芩有效部分提取物 的多级质谱数据，对中性丢失 m／z 176的化合物进行了归类 ，其中在 复方中有贡献的葡糖苷酸类化合物 见表2，利用标准品鉴定了黄芩苷， 其它化合物结合文献[11，12]报道 和碎片信息也进行了结构推测． 3．2．2 中性丢失m／z 162搜索含葡萄糖基柴胡皂苷类化合物 柴胡皂苷类化合物的母核上接有 1个 或多个糖元，糖元多为葡萄糖和鼠李糖．采用质谱差谱法处理柴胡有效部分提取物的多级质谱数据， 对中性丢失m／z 162的化合物进行了归类，在复方中有贡献的葡萄糖基柴胡皂苷类化合物见表3，用 Table 3 Th e identification ofthe gineosides found in Rad／x bupleuriand P al【No． Transition Comment and postulated identity Peak No． Transition Comment an d postulated identity 3 515／353 24 779／617 SSa 5 515／353 26 763／l 1 21 821／763 2"-0一Aeetyl SSa 27 779／617 Ssd 23 941／7 79 SSs1 ． 维普资讯 http://www.cqvip.com No．2 冉小蓉等：质谱差谱方法及其在中药复方研究中的应用 253 标准品对柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d(SSd)这对异构体进行了指认，结合文献[13]结果和Ms 碎片 信息对峰2l和峰23所属化合物进行了推测，分别为柴胡皂苷s1(SSs1)和2-0一乙酰基柴胡皂苷a． 3．2．3 中性丢失m／z 146搜索含鼠李糖基柴 胡皂苷类化合物 通过质谱差谱结果并结合文 献[13，14]，搜索了中性丢失 m／z 146含鼠李 糖基柴胡皂苷类化合物，推测了对复方指纹图 谱有贡献的化合物结构，结果见表 4． nIbk 4 The identification of the rhamnosides found in Radix bupleuriand 参 考 文 献 QII J．，I~ang Q．L．，Luo G．A．，et ．Ana1．Chem．[J]，2004，76：2239--2247 LUO Guo-An(罗国安)，WANG Yi—Ming(王义明)．Chinese Traditional Patent Medicine(中成药)[J]，1997，19(8)：44—45 LUOGuo—An(罗国安)，WANGYi—Ming(王义明)．World Science and Technology(世界科学技术)[J]，1999，1：I1—15 LIU Chun—Ming(刘春明)，LIU Zhi—Qiang(刘志强)，DOU Jian—Peng(窦建鹏)，et a／．．Chem．J．Chinese Universities(高等学校化学 学报)[J]，2003，24(12)：2115_2l17 YU Wen-Jia(于文佳)，HE Jian(何坚)，SHEN Jin—Can(沈金灿)，et a／．．Chem．J．Chinese Universities(高等学校化学学报)[J]， 2004，ZS(1)：85—暑9 Montoro P．，Carbone V．，Pizza C．，Phytochem．Ana1．[J]，2005，16：210_216 KimuraK．，Nanba S．，TojoA．，et a1．．Am．J．Chin．Med．[J]，1990；18：45_50 uu x．Y．．Am．J．Chin．Med．[J]，1995，23：255--260 Li P．，Kawaehi H．，Suzuki Y．，d a／．．J．Am．Sec．Nephrol[J]，1998，9：502A Lyu S．Y．，Rhim J．Y．，ParkW．B．．Archives ofPharmacalResearch[J]，2005，ZS(II)：1293--1301 GUO Ji-Fen(郭继芬)，CHEN Si—Ping(陈四平)，QIAO Shan-Yi(乔善义)，et a／．．Chin．J．Pharm．Ana1．(药物分析杂志)[J]， 2005，25(3)：267—269 WEN Hua-Zhen(温华珍)，XIAO Sheng-Yuan(肖盛元)，WANG Yi—Ming(王义明)，et a1．．Natural Product Research and Development (天然产物研究与开发)[J]，2004，16(6)：575—580 Bao Y．W．，Li C．，Shen H．W．，et ．．Ana1．Chem．[J]，2004，76：4208----4216 HU Xi—Ming(胡熙明)，ZHANG wen—KalIg(张文康)，Yu Sheng-Long(于生龙)，d a／．．Chinese Horb(中华草本)[M]，Shanghai： ScienceandTechnology Press，1998：1358-- 1360 Difference Analysis of Mass Spectra and Its Application to Research of Chinese Multiherb Remedy RAN Xiao—Rong ，YANG Hui—Hua ，LIANG Qiong—Lin ，CHEN Jun ，WANG Yi—Ming ， LUO Guo—An ’，LI Ping2 ， LI Ke—Ming2 ， CHEN Yu—Wu (1．Department ofChemistry，Tsinghua University，Belting 100084，China； 2．Clinical Medicinal Research Institute，China—Japan Friendship Hospital，＆ 100029，China) Almtraet The constituents in effective groups of Chinese multiherb remedy possess the similar chemical and structural characters，and the sanle neural lOSS under collisional induced dissociation(CID)．Based on this． the fingerprints of the muhiherb remedy and the effective extracts were established by using HPLC—ESI—MS“in this paper，the information of retention time，molecular weights an d the fragment inform ation was compared to confirm the attribution of effective constituents to the peaks in the fingerprint of Chinese multiherb remedy ， then，the difference an alysis ofmass spectra was employed to deal with the fragment data for rapidly identifying the effective constituents according to the neutral loss． Taking Chinese multiherb remedy Chailin．tang for example，its effective fractions flavonoids in Rad／x Scutellariae and Saikosaponins in Rad／x bup／eur／and were studied． Keywords Difference analysis of mass spectra；HPLC—ESI—MS ； Chinese multiherb remedy； Effective fraction；Chailin·tang (Ed．：K，G) 1{ 1j 1{ 1i 1J 1J ● 2 3 4 5 6 7 8 9 m n M r} rL rL r} r} r； 维普资讯 http://www.cqvip.com