高密度发酵工艺优化

发酵工艺优化 　 前言：发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平. 一、发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。 同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。 注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,我 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 了以下几累,也不是很全,当然从其他的方面进行交流也可以,但是希望你注明附加说明! 二. 好氧发酵 1. PH工艺的优化 2. 溶氧工艺的优化 3.原材料工艺的优化 4.消毒(灭菌)工艺的优化 5.菌种制备工艺的优化 6.小试到中试,中试到生产等扩大实验的工艺优化 7.成本工艺优化 8.种子罐工艺的优化 9.发酵罐工艺参数控制的优化 10.仪 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 控制的工艺优化 11.环境的工艺优化 12.染菌处理的工艺优化 13.紧急情况处理的工艺优化(停电\停水\停气\停汽等) 14.补料工艺的优化 15.倒种工艺的优化 16发酵设备的工艺优化 17.其他的工艺优化 三. 厌氧工艺的优化 四.固体发酵的工艺优化 五.其他 1. PH工艺的优化 A.配料中的PH 很重要,其中有配前PH,配后PH,消前PH,消后PH,接种前PH,工艺控制PH等,配前PH,配后PH,可以用来检测厡材料的质量,初步估计配料的情况,如果出了错误,有时候可以从PH中的变化看出来,能够减少错误的发生. B.另外,每次有新的配方我们总是要用PH方法检测其中的每种厡材料是否会和其他的发生反应,可以互相两两混合,检测PH的变化,也可以用来作为配微量元素的检测. C.消前PH可以用来减少消毒过程对培养基的破坏,因为培养基在消毒中会有PH的变化,在不同的PH条件下对培养基破坏也不一样,因此可以在消毒的时候选择合适的PH,消毒完后可以调节过来,这样一来可以对PH敏感的一些原材料减少破坏,这种方法在生产中已经取得了初步的成绩,提高了指标. D.工艺控制的PH,在发酵的产抗期间,通过在不同的发酵时间调整不同的PH,可以减少杂质的产生,同时还可以缓解溶氧,比如在头孢发酵中,通过在后期调整PH可以减少DCPC的含量,给提取工序带来很大的好处, E.补料罐通过PH的调节可以更好的通过流加物料而不影响发酵.(部分发酵在不同时期的PH有所不同,所以通过补料罐的调整可以对发酵指标有所提高) F.发酵过程中的PH调节可以通过各种方法,不一定要添加氨水和氢氧化钠,可以添加玉米桨等其他的物料来进行调节. G.控制放罐时的PH可以对后面的过滤有所影响,所以一定要控制好放罐前的PH H.绘制种子瓶和种子罐以及发酵罐等整个发酵过程的PH生长曲线,可以用来参考控制工艺,检测无菌情况的发生. 六、A. 华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象,研究细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性，高度重视细胞的生长变化，尽可能多地从生长变化中做出有实际价值的分析，进一步建立细胞生长变量与生物反应器的操作变量及环境变量三者之间的关系，以便有效控制细胞的代谢流，实现发酵过程的优化。　 B. 补料分批发酵技术该技术可以有效地减少发酵过程中培养基黏度升高引起的传质效率降低、降解物的阻遏和底物的反馈抑制的现象，很好地控制代谢方向，延长产物合成期和增加代谢物的积累。所需营养物限量的补加，常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。氨基酸发酵中采用这种补料分批技术最普遍，实现了准确的代谢调控。　　 C. 超声波的应用:超声波有很强的生物学效应。可应用于发酵过程的上、中、下游三个阶段。其在发酵工艺上的应用，可增加细胞膜的通透性和选择性，促进酶的变性或分泌，增强细胞代谢过程，从而缩短发酵时间，改善生物反应条件,高生物产品的质量和产量. 超声波的作用机制分为热作用、空化作用和机械传质作用。热作用是超声波在介质内传播过程中，能量不断被介质吸收而使介质的温度升高的一种现象，可用于杀菌或使酶失活。空化作用是超声波在介质中传播时，液体中分子的平均距离随着分子的振动而变化。当其超过保持液体作用的临界分子间距，就形成空化（空泡）。空泡内可产生瞬间高温高压并伴有强大的冲击波或射线流等，这足以改变细胞的壁膜结构，使细胞内外发生物质交换。机械传质作用是超声波在介质中传播时，可使介质质点进入振动状态，加速发酵液的质量传递，提高发酵过程的反应速度。超声波可广泛应用于生物发酵工程。不同频率和强度的超声波对发酵过程的作用是不同的，使用时应视具体的发酵工艺和使用条件进行选择。增加前体物的合成增加目的产物的前体物的合成或是直接添加前体物，均有利于目的产物的大量积累。如：在氨基酸的发酵中，通常在微生物的培养中加入前体，生产氨基酸；在花生四烯酸的发酵中，通过增加前体物或是加强糖代谢的途径，增加其前体物的合成，均有助于提高花生四烯酸的产量。去除代谢终产物改变细胞膜的通透性，把属于反馈控制因子的终产物迅速不断地排出细胞外，不使终产物积累到可引起反馈调节的浓度，即可以预防反馈控制。 七、发酵工程的优化不是很全,、其主要是在两个方面进行优化:营养条件与环境条件的优化.目前做发酵优化没有什么前途,发不了高水平的文章,应该说发酵工程优化是Technology,而不是science.其主要着眼点在于实现发酵过程的高产量\高产率\高生产强度的相对统一.从以下几个方面实现优化技术: 1 基于微生物反应原理的培养环境优化技术; 2 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术 3 基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术 4 基于代谢通量分析的过程优化技术 5 基于系统观点的生物反应系统优化技术 6 基于胁迫条件下微生物生理应答特性的发酵过程优化技术 八、 发酵工程包括不少内容，工艺的优化也有很多值得研究的地方。但是很多的理论是和生产实践相脱节的，也可以说对某些生产项目而言是没必要做过多的研究的（比如绝大多数的基因工程菌），说白了，就是看菌种好坏。 另外，个人认为，发酵工艺条件的优化，还是要结合具体的代谢产物和微生物来针对性研究。希望从理论和整体的角度做研究，对优化而言是没有效率的。 这里只是从实用性角度来说的，我并不怀疑发酵工艺的价值。 发酵工程优化是Technology,而不是science。但是有些事情可能不是你想象的那样，毕竟现在国内的公司和厂家主要以Technology为主，学校和科研单位以基础理论为主，现在的大体情况是科研和实际的生产应用有些脱钩，搞科研的大部分对搞生产的知识和应用有所缺陷，相反搞生产的觉得搞科研用处不大，尤其是现在的国内大的公司很少有出钱搞科研（基础理论研究）的，他们宁愿把大部分的钱用于工艺上的改进，而不愿意投资搞新产品的开发。其他方面我不是很清楚，但是在生物制药方面中国的新产品开发和应用成功的现在几乎占不到国外的 千分之一。根据调查（刚刚进行的在北京进行的国际首届生物高级经济论坛报告）指出，现在中国的公司和科研脱钩严重，搞科研的只关心发高水平文章，不关心应用，更不关心生产。他们并不了解公司真正需要什么技术，现在公司和科研单位（包括学校）真正联手搞发展的很少，走形式的很多。像国外大的公司自己出钱搞科研开发的几乎没有，因为大部分的公司宁愿花钱去买现成的工艺和技术。 九、至于公司和学校等科研单位合作很难的原因有很多，什么保密、付款、应用等等，我们关心的是我们毕业早晚要参加工作，如果搞理论和科研也好，但是大部分的人员是要参加公司工作的，所以多了解这方面的知识，尤其是理论和实践结合的知识对我们很有用处。因为我们公司近几年招徕的新学生（包括研究生和博士）对公司的生产和科研很不适应，他们往往只是从事某方面的工作，而且基础的东西占有很大的比例。为了更好的毕业后融入工作人员的大家庭，出于这个目的，所以我才开这个交流，希望对将要毕业从事工作的人有所帮助，也对刚刚参加工作的人有所启示。大家共同学习，提高，当然在更多的方面进行交流更好，我们可以学习更多的知识。 我再根据自己的经验谈谈：不足之处，敬请大家给与补充改正！ 十、 溶氧工艺的优化 A.影响溶氧的条件有：温度、通气量、发酵液性质、物料的性质、补料的情况、压力、搅拌的形式、设备的各种参数、菌丝本身的情况、染菌等等 b. 控制好的溶氧要从各个方面分析入手，比如说，在不同的周期要调整各种影响溶氧的条件顺序就不一样，前期可以调整通气量，罐压然后温度，经搅拌等对生产指标影响不大，但是在发酵后期则要注意：如果你的军种和产物的生产对温度敏感的话，则需要最后调整温度，如果对压力或者二氧化碳敏感的话则最后再调整压力。其他的情况一样。也可以通过顺序调整来节省成本。 c. 搅拌的形式很多，我们试过很多的形式，根据设备的不同选型有所不同，但是必须要根据你的发酵液的性质和电机的功率等进行选择。这方面在发酵设备这本书上有详细的描述。注意一点是：搅拌的选择要注意它的接口和缝隙，避免染菌。 d. 空气分布器可以根据设备的情况进行设计，保证它和物料的混合度达到最大当然最好。不过一定要考虑它对染菌的影响。以及对其进行清洗的方便和消毒的方便，不易杜塞等 。 e. 通过补料可以缓解溶氧，尤其是你的部料成分对发酵后其有很大影响的时候，通过合适的补料时间和补料量的控制可达到提高发酵指标的效果。具体问题具体分析了！ f. 通气量的控制可以根据菌丝的ph 的变化和溶氧计的测量进行控制，同时可以根据补料量 的多少进行控制，这些均可以作为调整溶氧的参考依据。 十一、做发酵优化一定要有针对性,在你做一个新品种时,一定要忘记你原来品种的所有特性,把注意力集中到你所从事的具体微生物的培养上来!就象人才培养一样要因才施教,要有感情的去对待它,微生物也是生物,在某方面同人一样,这是我做发酵几年的体会,对于发酵是TECHNOLOGY还是SCIENCE,以及前途如何均不重要,重要的是要把自己所做的事情做好,做精,做细,就能实现TECHNOLOGY与SCIENCE之间的转化,它们表象不同,本质一样! 无论工作和试验都是一样的，需要你尽心尽力去认真的对待，只有踏踏实实认认真真的努力去把试验和工作做好,做精,做细，我觉得任何人都会有很多的收获的。我做了好几年的生物制药工作，深感到做好一件工作并不是一件容易的事情，在发酵工艺改进这方面的工作也做了很多，有一点身有感触，就是其实我们做微生物试验不妨把自己的位置和微生物换个角度考虑，就会得到很多的启事。 举个例子来说吧！曾经有位博导说过，我们自己在培养微生物，用微生物进行试验，但是我们总是把他们当作微生物看待，当自己试验品，我们不妨换个角度，如果我们和微生物一样的话，即我们在微生物角度那么我们应该怎样进行试验呢！我们所用的大多数高产菌株几乎大部分是缺陷型菌株，也就是说是病态菌株，所以我们如果能够向对待病人一样对待他，知道他需要什么，病症在那里，如何维持我们所需要的状态等，就会理所当然的得到他的配合，也就是能够更多的得到我们所需要的产物。 从中我得到了很多的启事，当然我们不是微生物，但是我们可以从其他的角度去考虑问题，或许能够得到意想不到的效果！！呵呵！ 十二、从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等。 十三、补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 十四、连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 十五、消毒(灭菌)工艺的优化 1、消毒又叫灭菌，但是又很多的区别在里面（可以上网搜索资料参考，很多的），我们在公司一般把它称为消毒。消毒其实又很多的学问在里面，一个好的消毒工可以达到一年内千分之一的染菌率，非常的厉害！！ 2、发酵液经过消毒会遭到很大的破坏，所以首先需要控制消毒前的PH，而后控制消毒时的温度和时间（非常重要，有时候对发酵指标又很大的影响），在VB12发酵中，消毒的质量可以直接影响发酵的水平，从消后的指标就几乎能得出放罐时的指标。所以必须控制消毒的温度和时间。 3、消毒的方式的不同对发酵影响也很大，公司一般分实消（间断消毒）和连消两种，连消的发酵液质量较好，但是对设备仪器要求恨严格。实消操作简单，但是控制也不容易，对发酵噎破坏较大，因为它的升降温时间很长。对设备破坏较大，（震动和蛇罐等）。 4、现在出现一种是螺旋板换热器连续消毒，很方便也很经济。它的原理和连消鞳相似，只是它靠板式换热，不和蒸汽直接接触，而且它的消毒蒸汽冷凝水可以回流到原培养基进口处加热培养基，可以节约成本。而且可以控制培养基的体积。但是对设备的要求很严格（为了保证无菌要求），很少的设备公司能够做好这样的设备。 5、发酵的补料消毒可以通过调节好PH的几种料一起进行消毒，节约成本，如果部分的发酵中对几种物料的利用安比例进行，而且这些物料不发生任何反映，这样消毒既可以调节浓度控制蒸发量，又可以节约能源，一举两得。 6、部分得补料可以加入某种不容物质，消毒后再分开。保证设备的干净和无菌等，例如油里面可以加入其他的易溶于水的物质等，消毒后分水时可以把它分开。 7、消毒在保证无菌的前体下，还要考虑经济、对培养基破坏情况、操作方便（节省维修时间人员等）、工艺改进等等。 十六、剪切力的计算可以参考（发酵设备），一般的说 剪切力一般以搅拌叶的线速度测量，如果没有摇瓶没有搅拌可以参考摇瓶中最大的线速度， 计算公式 六西格玛计算公式下载结构力学静力计算公式下载重复性计算公式下载六西格玛计算公式下载年假计算公式 为 ：转速*3.14*摇瓶中最大的半径的平方。 不过我觉得影响你发酵可能是胞外次级代谢物或者其他的物质。摇瓶中的剪切力对菌种的影响很小，不过你的菌种我不是很熟悉，不过凭我的经验我觉得他不是主要的因素。 我考虑的 可能是氧气对你的影响较大，可能你搅拌时破坏了菌种的生长环境，导致他的代谢途径改变，产生了其他的物质（可能是有害物质）导致了菌种的生长环境改变影响了它的代谢。 还有一点是：你的培养基条件不是很适合菌种的生长，菌种在前期创造了自己生长条件，结果搅拌遭到破坏所以没有长好。 十七、浅谈在发酵工艺优化中统计手段的重要性。 1. 协同效应与关键因素：优化发酵工艺实质是考察各个变量对优化目标的效应以获得各因素（变量）对目标值的影响关系，进而以此为基础确定最优操作条件。同其他学科一样，在发酵优化时如果能建立各因素对目标的数学表达函数是最为理想的。但由于发酵中微生物性质的复杂性（微生物内部的代谢机理，调控机制等）及发酵环境多样的传递特性（热，质量、动量），使得要建立一个准确的机理模型十分困难。因此目前常见的发酵模型多为黑箱模型，即拟合模型（虽然随着对微生物代谢途调控机制的了解及生化反应动力学的发展，不少成功的机理模型也被建立并用于发酵的优化和调控——可参见诸多生化反应动力学教程及研究文献）。同时，更简单的单因素试验或稍复杂的正交试验也在发酵工艺优化中得到普遍应用。虽然针对不同的优化要求，优化手段当然可以也应该尽量简单，但目前很多国内学术研究文献还频频采用正交试验的确让人感觉很惋惜，特别是对试验数据的统计处理不够重视，相关的检验欠缺。因为在发酵时，涉及微生物性质（种类、种龄、活力，接种量），生长条件（pH、温度），培养基组成，传递条件（溶氧量或转速、搅拌速度）等多个变量，所以不仅要考察每个因素的效应，还应考察是否存在不同因素的协同效应。一般而言，存在如此多的因素，协同效应在所难免。而要高效判别协同效应，统计手段就不可不重视。此外，要高效的进行优化时，也应该借助统计手段确定各个因素的效应大小，选择重要的因素进行重点考察，即抓住主要矛盾把好钢（精力）用在刀刃（关键因素）上。因此，在优化发酵工艺时，一定要有意识的应用统计手段，首先确定关键因素（包括产生重要协同效应的因素），而后再集中精力优化关键因素。值得一提的是，要事半功倍地实现优化目标，就应该时刻牢记要抓住主要矛盾。 2. 用统计手段建立数学模型：前点已提及要建立数学模型，但为什么要用统计手段建立数模了？我们都知道盲人摸象的故事，其实优化发酵工艺也与此类似。试想，如果我们能准确地定量了解各个因素是如何影响发酵目标的，那要进行优化就是个简单地求最值的问题。之所以进行单因素试验或者正交试验，目的就是通过考察输入－输出关系建立变量－响应间的关系。我们如果仅仅通过考察几个孤立的点就想得到一个系统的全局的关系实在有盲人摸象的危险：获得一个局部的关系，得到一个局部的极值而非全局最值；或者获得失真的关系，得到连极值都不是的结果。而如果借助统计手段，我们可以有意识的选取一些有代表性的点，以获得全局的正确关系。比如，如果确定一个正方体的考察空间，那可以选择八个顶点＋一个中心点，还可以补充考察六个面上的中心点。如此一来，不仅对全局做到了有效考察，而且最少只用9个点就可以达到目标，胜于无目的地考察正方体的其他点。 3. 如何事半功倍确定有效因素：如果有12个因素需要考察，那考虑到因素间的两两协同效应，则要另增加12×11＝132个因素。如果采用单因素试验或正交试验，试验将非比寻常。如果借助适当的统计手段，则可大大减少试验次数。如Plackett－Burman（拼写可能有误）试验，n次试验可以考察n-1个因素，即进行12次试验可以考察11个因素。虽然PB有一定的缺陷，但一般而言的确是高效而又实用的。类似的非平衡或平衡块统计手段还有许多，我们可以根据需要选择合适的手段进行试验以达到目的。 4.应用统计优化的其他好处：在建立数学模型是，选择合适的方法也对优化过程和结果大有裨益。借助最陡爬坡试验、中心点试验，相应面方法，均匀设计等方法能让你准确、高效的完成试验。借助SAS，SPAA，Statistics等统计手段，你可以快速完成数据的分析、模型构建及假设检验。而且这些统计软件还特供了强大的绘图能力，你可以看到所建模型的三维图像，得到直观影响，轻松进行最优求解得到优化条件。另外，最优算法发展比较快，象基因算法，神经元网络算法也广为应用。 发酵工艺优化方法与思路 　 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。 　　为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。 　　发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。 　　在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。 　　基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性，高度重视细胞的生长变化，尽可能多地从生长变化中做出有实际价值的分析，进一步建立细胞生长变量与生物反应器的操作变量及环境变量三者之间的关系，以便有效控制细胞的代谢流，实现发酵过程的优化。 　　补料分批发酵技术该技术可以有效地减少发酵过程中培养基黏度升高引起的传质效率降低、降解物的阻遏和底物的反馈抑制的现象，很好地控制代谢方向，延长产物合成期和增加代谢物的积累。 　　所需营养物限量的补加，常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。氨基酸发酵中采用这种补料分批技术最普遍，实现了准确的代谢调控。 　　超声波的应用超声波有很强的生物学效应。可应用于发酵过程的上、中、下游三个阶段。其在发酵工艺上的应用，可增加细胞膜的通透性和选择性，促进酶的变性或分泌，增强细胞代谢过程，从而缩短发酵时间，改善生物反应条件，提高生物产品的质量和产量。 　　超声波的作用机制分为热作用、空化作用和机械传质作用。热作用是超声波在介质内传播过程中，能量不断被介质吸收而使介质的温度升高的一种现象，可用于杀菌或使酶失活。空化作用是超声波在介质中传播时，液体中分子的平均距离随着分子的振动而变化。当其超过保持液体作用的临界分子间距，就形成空化（空泡）。空泡内可产生瞬间高温高压并伴有强大的冲击波或射线流等，这足以改变细胞的壁膜结构，使细胞内外发生物质交换。机械传质作用是超声波在介质中传播时，可使介质质点进入振动状态，加速发酵液的质量传递，提高发酵过程的反应速度。 　　超声波可广泛应用于生物发酵工程。不同频率和强度的超声波对发酵过程的作用是不同的，使用时应视具体的发酵工艺和使用条件进行选择。 　　增加前体物的合成增加目的产物的前体物的合成或是直接添加前体物，均有利于目的产物的大量积累。如：在氨基酸的发酵中，通常在微生物的培养中加入前体，生产氨基酸；在花生四烯酸的发酵中，通过增加前体物或是加强糖代谢的途径，增加其前体物的合成，均有助于提高花生四烯酸的产量。 　　去除代谢终产物改变细胞膜的通透性，把属于反馈控制因子的终产物迅速不断地排出细胞外，不使终产物积累到可引起反馈调节的浓度，即可以预防反馈控制。 　　发酵工艺优化的方法有很多，它们之间不是孤立的，而是相互联系的。在一种发酵中，往往是多种优化方法的结合，其目的就是要控制发酵，按照自己的设计，生产出更多、更好的产品。 基因工程菌高密度发酵工艺研究进展 　 摘　要　　阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。 关键词:高密度发酵;　分批补料;　生长抑制因子 重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平[1,2]。　　 大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清[3]。产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。 1　重组大肠杆菌构建的几个影响因素 1.1宿主菌的选择　　 不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌[4]。表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性[5]。因此,不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化都有至关重要的作用。 1.2质粒载体　　 重组大肠杆菌中构建的质粒载体对外源基因的表达也产生了很大影响。常用的基因表达载体有ｐＥＴ、ｐＳＣ、ｐＰＢＢ、ｐＵＣ系列以及由它们衍生的一系列优化载体。 质粒载体的拷贝数和稳定性不仅受宿主菌生理状况及生长环境的影响,而且还取决于自身的遗传特性。质粒载体的拷贝数并不是越高越好,因为有些克隆的编码基因,当用高拷贝数质粒作载体时,其产物含量过高会严重地扰乱寄主细胞正常的新陈代谢活动。质粒不稳定性通常有以下两种情况1)分离不稳定性;(2)结构不稳定性。另外环境条件也会影响质粒的拷贝数,如葡萄糖、ＮＨ4+等因子的限量供应以及ｐＨ的变化都会引起质粒拷贝数的下降。已有报道通过正交实验考察了Ｅ.ｃｏｌｉＨＢ101(ｐＢＲ322)高密度培养过程中,不同培养条件对质粒的稳定性影响,结果表明当温度在33～39℃、ｐＨ为6.4～7.2、ＤＯ为40%～80%时质粒没有丢失现象[6]。 2　培养条件 2.1营养源　　 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要[7]。一般使用的培养基为半合成培养基,培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例。葡萄糖(Ｇｌｕ)因细菌利用快且价廉易得,已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。一般Ｇｌｕ浓度控制在10ｇ/Ｌ左右,如果超过20ｇ/Ｌ将会抑制细胞的生长。同时已有人用甘油代替Ｇｌｕ作为细菌生长的碳源,以减少代谢抑制物质———乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。ＮＯ3-、胰蛋白胨(Ｔｒ)、酵母提取物(Ｙｅ)作为氮源有利于细胞的生长。比如,在硅藻类(Ｎｉｔｚｓｃｈｉａｌａｅｖｉｓ)高密度培养过程中提高十二碳五烯酸ＥＰＡ的产量时,ＮＯ3-∶Ｔｒ∶Ｙｅ的最佳比例为1∶2.6∶1.3,Ｇｌｕ∶ＮＯ3-的最佳比例为32∶1[1]。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率,曾有报道在非洲绿猴肾成纤维细胞系(ＶＥＲＯｃｅｌｌ)培养过程中,加入半乳糖和谷胱甘肽可以阻止细胞程序性死亡[8]。　 　另外还有实验数据表明,在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳＨ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍[9]。2.2　控制条件 2.2.1　接种量　　接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要作用[10]。接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下[11]。 2.2.2　溶氧浓度　　溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与,溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大,溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中,由于菌体密度高,发酵液的摄氧量大,一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量。随着发酵时间的延长,菌体密度迅速增加,溶氧浓度随之下降。因此在高密度发酵的后期,需要维持较高水平的溶氧浓度。　　目前,提高溶氧量的方法主要有:通入纯氧来提高氧的传递水平,但可能导致局部混合不匀,易使微生物氧中毒;在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白(ＶＨＢ)[12];培养基中添加Ｈ2Ｏ2,利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生Ｏ2;提高氧的分压[13]。 2.2.3　ｐＨ值　　稳定的ｐＨ值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的ｐＨ值变化会改变菌体细胞内的ｐＨ值,从而影响细菌的代谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达。Ｅ.ｃｏｌｉ发酵时产生的有机酸(主要是乙酸)可导致发酵液的ｐＨ值降低,细胞释放的ＣＯ2溶解于发酵液内与Ｈ2Ｏ作用生成的碳酸也会导致发酵液ｐＨ值的降低。在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。必须及时调节ｐＨ值使之处于适宜的ｐＨ值范围内,避免ｐＨ值激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。　　菌体生长和产物合成过程中,常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠杆菌的生长。 2.2.4　温度　　培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量,而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白,以适应变化的环境,外源蛋白相对量降低,给后续的纯化造成困难。如果温度升高的范围不太大,热激蛋白合成的速度会很快下降,恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。 2.2.5　诱导剂及诱导时间控制　　乳糖基因(ｌａｃ)及其衍生的启动子被广泛地应用于重组蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。这类启动子通常都用异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)作为诱导剂进行外源蛋白的表达,但它成本高,污染环境,因而不适于工业生产。已有人用乳糖代替异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)做为诱导剂[14]或者以一定比例混合[15],诱导外源蛋白的表达。　　诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。　　诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。 2.2.6　补料控制　　重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略,即采用合理的营养流加方式。常用的流加模式[5]:非反馈补料,反馈补料,其主要工作原理见下表。 除了补料技术的影响外,补料培养基成分及补料时间的选择对外源基因的表达也是至关重要的。如在大肠杆菌表达重组绵羊生长激素(ｒ-ｏＧＨ)时,补料培养基的成分就包含有Ｇｌｕ和Ｙｅ,并在培养16ｈ后进行补料[16]。 3　生长抑制因子 3.1　乙酸的积累　　以Ｇｌｕ为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。乙酸的分泌可以通过维持较低浓度的Ｇｌｕ或补充Ｙｅ等来减少合成代谢。当残留的Ｇｌｕ浓度<1ｇ/Ｌ和乙酸浓度<2ｇ/Ｌ时,不存在大肠杆菌细胞生长的抑制因子[17]。　　乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。目前国外已有研究希望通过代谢工程改变重组大肠杆菌的代谢途径,从而降低乙酸的生成。 3.2　ＣＯ2的积累　　高密度发酵过程中,细菌代谢产物ＣＯ2的积累也会抑制外源蛋白的表达[18]。因为ＣＯ2对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致ｐＨ值的下降。有报道多变鱼腥藻(Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ)[19]可以利用ＣＯ2为碳源,进行高密度培养,这样可以消除ＣＯ的抑制作用。 4　发展与展望　　随着发酵控制手段的进一步发展,临控技术的掌握,发酵装置在线检测或控制物理化学参数、化学测量、生物学和生化测量,并提供反映环境变化和细胞生长的许多重要信息,作为控制发酵过程的依据。生物反应器也有了巨大的发展,比如膜反应器就可以透析除去发酵液中有害物质,从而实现工程菌的高密度发酵。　　 基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,其产品在化工、食品、环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。但能否实现高密度培养及高目标产物浓度,是工程菌能否以较低成本实现规模生产的决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的各个工艺条件,简化操作工艺,降低工业成本,最终使目标产物生产的规模化和产业化得以实现。