膜片钳技术及其发展概况（烟台绿叶）

null膜片钳技术及其发展概况膜片钳技术及其发展概况广州医学院生理系 汪鹏 null主要内容一、膜片钳技术的原理 二、膜片钳技术的发展历史 三、膜片钳技术的发展概况 四、膜片钳技术的仪器构成null一、膜片钳技术的原理 离子通道简介离子通道简介 离子通道是镶嵌在动、植物细胞膜上的一类特殊蛋白质，它们负责转运细胞膜内外的各种离子，参与各种细胞功能，主要包括： 维持细胞静息膜电位，产生动作电位，从而调节细胞的兴奋性、不应性和传导性； 调节细胞内Ca2+、cAMP、cGMP等第二信使 的浓度，触发肌肉收缩、腺体分泌、基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达等一系列细胞生理反应； 参与神经元的突触传递； 维持细胞的正常体积。null细胞膜上的离子通道null细胞膜上至少有400种不同类型的离子通道，目前只有大约100多种离子通道被克隆出来并进行了通道功能的研究。 离子通道具有如下特点： 1．离子选择性。大多数离子通道只运输一种离子，这是离子通道多以所运输离子的名称来命名的原因，如K+离子通道。 2．开启与关闭受不同门控机制控制。电压门控性离子通道，配体门控性离子通道，机械敏感性离子通道，酸感受离子通道等等。 3．大多数离子通道至少具有开放、关闭、失活等几种状态。药物可能通过作用于离子通道的不同状态来影响通道功能。nullnull人类的很多疾病，如： 囊性纤维化（Cystic fibrosis） 癫痫（Epilepsy） 青春晚期糖尿病（MODY） 长QT综合征（Long QT syndrome） 以及多种神经、肌肉疾病，都是由于离子通道功能缺陷所致。这类疾病被称为离子通道病（Channelopathy）。 离子通道病可由编码离子通道基因的突变引起，也可由编码调节离子通道的一些蛋白的基因突变引起。 离子通道重要的生理作用以及众多离子通道病的存在，使离子通道成为新药的热门作用靶点。目前约有20%的注册药物是通过作用于离子通道而发挥药物作用的，药物通过调节特定的离子通道功能来影响细胞行为。 nullDiabetes离子通道病nullnull海马脑片CA1区锥体神经元的IR-DIC影象10μmnull海马脑片CA1区中间神经元的IR-DIC影象10μmnull什么是膜片钳技术（Patch clamp）？ 膜片钳技术是一种通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，采用电压钳或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动进行 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 的微电极技术。 nullnull在对膜片钳概念的理解上不能将膜片钳技术与电流钳、电压钳技术完全分割开，实际上在使用膜片钳技术时不可避免地要使用到电压钳或电流钳技术。 在进行单通道记录时，电极下的膜片往往含有不止一个离子通道，所记录的通道电流因此往往也不是一个通道的电流。 对膜片钳技术概念的理解null膜片钳技术的基本记录模式膜片钳技术的基本记录模式null膜片钳技术的基本记录模式null 全细胞记录模式 〈优点〉 （1）便于更换细胞外液，可用于研究电压和配体门控性离子通道、泵电流、交换体电流等，适合于离子通道药理学的研究； （2）可进行细胞内灌注，如灌注药物、信使物质、荧光染料等； （3）可进行细胞内容物的抽吸，如抽取mRNA等； （4）可研究细胞胞吞、胞吐机制。 null 全细胞记录模式 〈缺点〉 （1）对工作台的机械稳定性要求较高，维持长时间记录难度较大； （2）破裂的细胞膜残片易堵塞电极口，导致记录的不稳定； （3）存在Rundown现象； （4）大细胞存在空间钳制问题； （5）存在液接电位的校正问题； （6）存在串联电阻补偿问题 。 null二、膜片钳技术的发展历史 null1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。这是人类首次记录到单通道的离子电流，这一创造性结果发表在著名的Nature杂志上。 null电极接触细胞负压吸引形成Ω形膜囊泡提起电极,囊泡与细胞脱离ABCD大鼠肌球细胞ACh受体单通道电流null1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cm H2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接，大大降低了记录时的噪声，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill、Marthy、Neher、Sakmann和Sigworth等五人在 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 膜片钳技术的基础上对其进行了重大改进，并完善了游离膜片技术和全细胞记录技术，从而使膜片钳技术走向成熟，他们的这一重要结果发表在后来的著名杂志“欧洲生理学杂志（Pflügers Archive）”上 null1983年10月，Sakmann和Neher主编的《Single-Channel Recording》一书问世，对当时的膜片钳技术进行了全面、系统的总结，从此奠定了膜片钳技术的里程碑。 1995年，《Single-Channel Recording》一书再版，增添了大量膜片钳技术的新内容，几乎当时国际上所有的知名膜片钳专家都参与了编写，成为目前膜片钳技术研究领域的最经典著作。 null1983年第一版1995年第二版 《Single-Channel Recording》null 内尔(Neher) 萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家） 合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。该成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。null三、膜片钳技术的发展概况 null膜片钳记录技术自创立以来，经历了许多发展变化 简单介绍如下： （1）记录方式有很大变化 除了传统的单通道记录方式以及普通全细胞记录方式外，又陆续发展了膜穿孔记录方式（Perforated patch clamp）、巨膜片记录方式（Giant membrane patch）、松散封接记录方式（Loose patch clamp）等等。null（2）应用技术不断涌现 为了更换电极内液和从电极内施加药物，发展了微电极内灌注技术（Micropipette perfusion technique）； 在研究细胞间的缝隙连接（Gap junction）通道时，发展了双膜片记录法（Double patch recording）； 将富含神经递质受体的游离膜片靠近突触部位，可检测递质释放和突触活动，这一技术称为膜片探针技术（Detector-patch technique）； 若将特异的膜片探针插入卵母细胞，可检测细胞内第二信使含量，此为膜片填塞技术（Patch cramming technique）； 为研究细胞的胞吞与胞吐机制，发展了膜电容测定法（Mem-brane capacitance measurement）。null（3）使用的标本种类繁多 从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到昆虫细胞、鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等；从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上。null（4）研究对象已经不局限于离子通道 从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。 （5）膜片钳电极已经不单单是传统意义上的电信号记录电极 它还作为其它研究方法的工具使用，如用于进行单细胞PCR技术时的细胞内容物抽吸工具。 （6）应用范围日趋广泛 为解决实际问题的需要，膜片钳技术已经渗透到生物学领域的许多学科中，如分子生物学、药理学、免疫学等等，成为生物学研究中的一种主要技术手段，与其它生物学技术的结合应用已经成为膜片钳技术的主要发展趋势。 null（7）全自动膜片钳技术的崛起 传统膜片钳技术的局限 ☆每次只能记录一个细胞，是一项耗时耗力的工作 ☆不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选 ☆不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。 全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且记录质量均匀、稳定，此外从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这些优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！null 全自动膜片钳的发展 1998年，由NeuroSerach和Pfizer公司合作开发出Neuro-Patch自动膜片钳设备，可对哺乳动物细胞进行自动化膜片钳操作。随后，丹麦Sophion公司将其改进并推出世界上第一台全自动膜片钳Apatchi-1。 德国Flyion公司的Flyscreen 8500和PatchBox 德国Cytocentrics公司的CytoPatch 美国MDS公司的PatchXpress 7000A和IonWorks系列 丹麦Sophion公司的QPatch 系列 德国Nanion公司的Patchliner系列和Port-a-Patch。 全自动膜片钳的记录技术方法： ☆ Flip-Tip翻转技术 ☆芯片技术 ☆ Population Patch Clamp技术 null传统膜片钳的记录模式全自动膜片钳的记录模式nullnullQPatch全自动膜片钳nullnullnull 全自动膜片钳技术的优势 ☆通量高。这是全自动平面膜片钳的最突出的优点，目前的最高通量是48，每天获得的数据量比传统膜片钳要高1,000到10,000倍。 ☆自动化。找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作全部是自动化，实验人员不再项耗时耗力了。 ☆“熟手”不再需要了，操作者只需要简单的培训就能上机使用。 ☆传统膜片钳技术中所需要的显微镜、微操纵器、微电极拉制仪、防震台/屏蔽网、灌流/给药系统、浴槽系统等等全部不需要了。 ☆获得数据的均一性高，人为的影响因素少。 ☆数据处理软件的自动化程度也高，可迅速获得离子通道的I-V曲线以及化合物的量效曲线与EC50/IC50值。 ☆全自动膜片钳技术的一个重要应用就是检测药物对人心脏hERG通道的毒性作用，主要用于先导化合物的筛选和hERG通道的安全性评价。 null 全自动膜片钳技术的局限 ☆成功率只有60-80%，仍然不够高。其中的主要原因来自于细胞。 ☆采用的标本必须是分散的悬浮细胞（目前多为细胞株），而诸如原代培养的神经元、脑片、心肌这类标本目前尚无法采用。 ☆只能进行全细胞记录模式、穿孔膜片钳记录模式、细胞贴附式单通道记录模式以及脂双层单通道记录模式，而不能进行其他模式的记录。 ☆相比传统膜片钳系统，它的仪器价格昂贵，芯片耗材仅能一次性使用，也增加了它的费用。null四、膜片钳系统的仪器构成 null刺激器防震台显微镜探头屏蔽网监视器nullnull膜片钳系统的仪器构成null 计算机控制 单、双、三、四探头null EPC 10 USB膜片钳放大器nullMultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器计算机控制双电极探头nullAxopatch 200B膜片钳放大器单通道记录（最佳） 全细胞记录 脂双层电压钳记录 电化学测量（伏安法） 松散封接记录 null高速、低噪音的Digidata 1440A数模/模数转换器nullpClamp 10数据采集分析软件nullPatchMaster采样软件null组织薄片 盲法膜片钳－ 普通解剖显微镜 可视膜片钳－ DIC显微镜 IR-DIC显微镜 （Olympus BX51, Nikon FN-1）正置显微镜null美国Sutter公司、SD公司、国产显微镜X-Y移动台与支撑平台null美国Sutter公司的新产品MT-1078/N65 显微镜X-Y移动台与支撑平台null倒置显微镜单细胞 急性分散细胞 体外培养细胞 基因转染细胞株 （如HEK293，CHO等） （Olympus IX71，TE2000, Ti-U/S）null显微镜加宽平台美国Sutter、国产nullSutter公司电动微操纵器微操纵器MP-285 MP-225MPC-385-2/325-2 null美国Siskiyou公司电动微操纵器微操纵器MX7600null美国Siskiyou公司手动微操纵器微操纵器MX160nullHUXLEY-WALL TYPE MICROMANIPULATORSutter公司 手动微操纵器 MP-85微操纵器nullWPI公司 电动马达式 DC3001微操纵器null微电极拉制仪Sutter公司 P-97null微电极拉制仪Sutter公司 P-1000nullSutter公司 P-2000微电极拉制仪null德国Zeitz公司 DMZ universal 全自动拉制仪微电极拉制仪 抛光前 抛光后nullWPI公司 MF200系列微电极抛光仪null双道TC－344B/单道TC－324BRC-26 浴槽恒温浴槽系统 控温系统美国Warner公司 null美国WPI公司 PERI-STAR™ High performance digital peristaltic pumps at an 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