细胞培养和离心技术

nullnull细胞培养 和 离心技术null应用实例：诱导性多能干细胞（iPS）Cell. 2006 ;126(4):663-76. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Takahashi K, Yamanaka S. Department of Stem Cell Biology, Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto 606-8507, Japan.These data demonstrate that iPS cells can be induced from MEF culture by the introduction of four transcription factors, Oct3/4, Sox2, c-Myc, and Klf4.null分化潜能 （组织）分化潜能 （个体）null研究的层次细胞组织动物nullMRC-5 人肺成纤维细胞U-937细胞，人血液病细胞PC-3，人前列腺癌细胞A549 ，肺癌细胞体外培养的细胞株 倒置显微镜null体外培养的细胞,应注意： 来源：人、鼠、猴 分化程度：肿瘤细胞、正常细胞、胚胎干细胞 形态：贴壁、悬浮null培养的宫颈癌细胞 扫描电镜null培养的人骨肉瘤细胞 细胞周期研究-U2OS细胞流式细胞技术免疫荧光技术细胞培养技术细胞培养技术一. 基本知识 二. 基本技术 三. 常见问题 四. 应用举例细胞培养技术细胞培养技术一. 基本知识 二. 基本技术 三. 常见问题 四. 应用举例一、 细胞培养的基本知识一、 细胞培养的基本知识1. 细胞培养的基本概念 2. 培养细胞的生存条件 3. 培养细胞的类型及其特点 4. 培养细胞的增殖过程null. 1900’: 开始，1907年Harrison，1912年Carrel . 1940’: 细胞冻存 . 1950’后: 培养基改进，生长因子的促进 . 1975年：杂交瘤细胞的成功培养 . 与分子生物学及其他学科的结合，飞速发展发展史1.细胞培养(cell culture)1.细胞培养(cell culture) 从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长，并维持其结构和功能的技术。 * 大量 * 遗传性状等条件相同的细胞； * 可操控性； * 动态、可观察性等null成功的细胞培养： 1.Well-established,properly equiped cell culture facility; 2.Practice of sterile techniques; 3.Appropriate,quality controlled reagents and supplies; 4.The knowledge and practice of the fundamental techniques involved in the growth of the cell type of interest.体内、外细胞的差异体内、外细胞的差异 体内细胞 机体神经体液调节 多种类型细胞相互影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能 特征：高度特化； 体外细胞 无神经体液调节 无其他类型细胞影响 细胞的许多外来信号被切断 1.特定分化基因表达减弱或停止 2.增殖活动维持 （由特殊到一般） 与体内细胞结构和功能的差异 特征：失去原有形态; 分化特性减弱 null特点 对环境适应差；容易污染； 对营养要求高； 大部分需要附着载体生长； 可能失去原有的形态功能特征。一、 细胞培养的基本知识一、 细胞培养的基本知识1. 细胞培养的基本概念 2. 培养细胞的生存条件 3. 培养细胞的类型及其特点 4. 培养细胞的增殖过程2.培养细胞的生存条件2.培养细胞的生存条件 高要求的营养物质 严格的环境条件 营养物质营养物质培养基(culture medium)，合成培养基： 提供基本的、与体内相同的小分子营养物质： 葡萄糖、氨基酸、无机离子、维生素、微量元素。 血清（serum), 天然培养基： 提供多种生长因子等活性物质（大分子物质）。 null常用培养基：DMEM, RPMI1640, MEM, HAM F-10, HAMF-12, McCoy’s 5A等注意营养物质的种类和浓度提供特殊细胞所需的特定营养成分和生长因子提供特殊细胞所需的特定营养成分和生长因子 基本营养成分含量改变： 高糖 加入中间代谢产物： 辅酶A、ATP、丙酮酸钠 激素： LH/FSH、胰岛素 生长因子和细胞因子： EGF、FGF、BFGF 特异性小分子物质： 维甲酸 LIF (白血病抑制因子) ：维持胚胎干细胞的未分化状态 饲养层细胞 （feeder layer） 特殊培养基提供特殊的成分，只允许特定细胞生长的条件提供特殊的成分，只允许特定细胞生长的条件 特殊抗菌素：新霉素、潮霉素 －用于筛选阳性细胞：表达外源导入基因的细胞 2.特殊物质：特异性生长因子、血清撤除、饲养层撤除 －用于原代细胞筛选培养和干细胞诱导分化 选择培养基（条件培养基）null阳性克隆表达潮霉素抗性基因 阴性克隆在含潮霉素培养液 中无法生存选择培养基用于筛选：成功导入基因的阳性细胞 阳性克隆表达新霉素抗性基因 阴性克隆在含新霉素培养液 中无法生存环境条件环境条件温度 35~37℃ 气体 95%空气/5%CO2 酸碱度 pH 7.2~7.4 （酚红指示） 支持物 玻璃、塑料、饲养层、微载体 培养细胞浸浴于培养液，生长在玻璃或塑料容器中，置于恒温、恒湿的二氧化碳孵育箱中。null二氧化碳培养箱null超净工作台（生物安全柜）null培养皿 (dish)培养板 (6-,24-,96-well plate)支持物 (Substrates) ，培养容器 (Vessels)培养瓶 (flask)null培养容器的容积、细胞数null细胞培养室设备液氮容器倒置显微镜null细胞培养四大要素1.Aseptic techniques； 2.Facilities； 3.Reagents and supplies；4.Cells.一、 细胞培养的基本知识一、 细胞培养的基本知识1. 细胞培养的基本概念 2. 培养细胞的生存条件 3. 培养细胞的类型及其特点 4. 培养细胞的增殖过程3.培养细胞的类型及其特点3.培养细胞的类型及其特点 贴附型 (adhensive cell) 悬浮型 (suspensory cell) 悬浮型 贴附型null 1. 贴附型 (adhensive cell) 大多数细胞属此型； 贴附于支持物表面，单层生长； 失去在体内特有形态； 接触抑制和密度依赖。 2. 悬浮型 (suspensory cell) 各种源自血液的细胞、骨髓、脾细胞。 悬浮生长，单个分散或成团。 成纤维细胞型、 上皮细胞型、 游走型、多形型 悬浮型 一、 细胞培养的基本知识一、 细胞培养的基本知识1. 细胞培养的基本概念 2. 培养细胞的生存条件 3. 培养细胞的类型及其特点 4. 培养细胞的增殖过程4.培养细胞的增殖过程4.培养细胞的增殖过程细胞增殖 细胞分裂形成子代细胞的过程。 增殖周期（细胞周期）： 间期（ G1-S-G2 期）和分裂期（M期）null 群体中 1.多数细胞处于间期，少数处于分裂期。 2.间期较长，分裂期较短。HNSCC cell G1: 56.42% S: 14.85% G2: 22.33% M: 2.65%HeLa cell M phase: 20-40 min; Interphase: around 17hs培养细胞一代的过程培养细胞一代的过程传代 (passage,subculture)： 培养容器中细胞增殖至一定密度（对贴壁细胞，80- 90%汇片）时，分离出一部分 细胞和更新营养液的过程。 一代: 细胞接种后到 下一次传代的一段时间。 细胞一代的三个阶段： 潜伏期、指数增生期、平台期 实验研究多在指数增长期进行null一定密度 “汇片”接种下一次传代前贴壁分裂 增殖生长、 培养细胞一代 (贴附型细胞 )培养细胞的生命期培养细胞的生命期 Life span: 细胞在体外培养中持续增殖和存活的时间。 一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。 *原代培养：从体内取出细胞接种后到第一次传代。 一般维持1－4周。 *传代期： 原代细胞一经传代就成为细胞系（cell line）， 进入传代期。持续时间最长. 一般传10－50代 (Hayflick 极限) 。 *衰退期： 细胞增殖缓慢、停止至死亡。 肿瘤细胞：无限细胞系，永久增殖 nullLife spanPhase衰退期培养细胞的整个生命期传代期，每代细胞的增殖时相nullHayflick极限*体外培养细胞的增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限。 *传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 *传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。 nullHayflick极限提示的意义细胞不是不死的，细胞会由于内在的因素出现增殖衰退而衰老死亡。 衰老机制的研究：“衰老钟”等增殖和衰老的秘密null细胞衰老（衰老敏感的β半乳糖苷酶染色指示） 正常细胞 衰老细胞二、 细胞培养的基本技术二、 细胞培养的基本技术1、细胞分离和原代培养 2、培养细胞的传代 3、细胞计数 4、细胞观察 5、细胞的冻存、复苏和运输 6、污染的检测和对策 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术1、细胞分离和原代培养 4、观察 2、传代 5、污染的检测和对策 3、冻存、复苏 6、计数 常规维持实验前准备1.细胞分离1.细胞分离 细胞悬液：离心收集 组织块： 1. 机械分散 2. 剪切分离 3. 消化分离 胰蛋白酶法 胶原酶法2.细胞传代 （subculture)2.细胞传代 （subculture)悬浮细胞的传代：离心或更新培养液 贴壁细胞的传代：消化（0.25%胰酶+0.66mM EDTA)消化传代过程null肿瘤细胞株的传代http://www.atcc.org/Portals/1/Pdf/tb07.pdf原代培养的首次传代数量: 过少时不能传代 传代时组织块可继续保留 纯度：注意可能多数混杂几种细胞消化液的浓度和使用时间、细胞传代的频率和总的次数细胞系维持 细胞系维持 ⑴ 细胞系档案要 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 好。 ⑵ 维持传代的规律性。 ⑶ 防止不同细胞系交叉污染。 ⑷ 保存充足的冻存储备；及时冻存。 null Passage Number Effects In Cell Lines Why they happen and what you can do about it ATCC Technical Bulletin no. 7 注意：肿瘤细胞的传代次数 null细胞活力检测 （0.4% trypan blue 拒染）应用计数板或活力检测仪3.细胞计数 （Counting)4.细胞观察 (Observation)4.细胞观察 (Observation)培养液 细胞生长概况 细胞形态变化 微生物污染 5.细胞冻存（Cryopreservation) 5.细胞冻存（Cryopreservation)目的：1.保存细胞株 2.保持尽量少的传代次数和较均一的细胞状态方法：低温保存法（Cryogenic storage)：-130 ℃ 装置：液氮罐（liquid nitrogen freezer） null 在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，影响细胞功能甚至死亡，冻存失败。 * 培养基中加入保护剂: 甘油或二甲基亚砜（DMSO）； * 缓慢地冻结. * 贮存在－130℃以下低温减少细胞内水分，减少冰晶形成低温保存原理null缓慢冻结nullhttp://www.atcc.org/Portals/1/Pdf/Cryopreservation_Technical_Manual.pdfLiquid phaseVapor phase液氮罐null 1. 保证生长状态良好：对数生长期细胞；收集前24h，换液一次；细胞数量要充分（哺乳动物细胞 106-107 /ml) 2. 加保护剂：10％DMSO或甘油的培养液。 3. 分装：无菌冻存管(flam-sealed glass ampoules 或screw-up plastic vial)中，严密封口，标记细胞株信息和冻存日期。 4. 缓慢冻存：通常1-2°C/min 方法：自动降温仪器或-70--90°C冰箱过夜，然后放入液氮 罐的储存盒中。 5. 填写记录本或记录 表格 关于规范使用各类表格的通知入职表格免费下载关于主播时间做一个表格详细英语字母大小写表格下载简历表格模板下载 http://www.atcc.org/Portals/1/Pdf/tb03.pdfnull冻存信息表5.细胞复苏(Thawing, Reconstitution)5.细胞复苏(Thawing, Reconstitution)将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37～40℃水浴 1min内融化，去除冻存保护液，更换正常培养基 “慢冻速融” 胞外结晶很快融化，减少水分渗入细胞5.细胞运输5.细胞运输冷冻法：液氮或干冰 充液法： 1.选生长状态良好的细胞，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，保留微量空气。避免运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。一般在4-5天内到达目的地，对细胞活力无多大影响。 2.短时间可到达的（几小时内），可倒掉培养液，依靠表面 残存细胞液，避免运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。污染的种类 6.细胞污染的防治微生物（常见）：细菌、真菌、 化学物质：DMSO、EDTA等 细胞交叉污染污染的种类 支原体微生物污染的途径 微生物污染的途径 空气 器材 操作 血清 组织样本null 微生物污染对细胞的影响 致死、增殖减慢、基因转录改变、功能改变 微生物污染的检测 培养基颜色、性状；细胞形态、功能；支原体的检测 微生物污染的防治 抗生素、加温等 以预防为主，一旦感染较难救治三. 常见问题三. 常见问题1. 支原体污染 2. 细胞认证（authentication) 3. 遗传背景（genetic)null1.支原体感染细胞救治null Reputable cell suppliers： 1. American Tissue Type Collection (ATCC) 2. German Collection of Microorganisms and Cell Culture (DSMZ) 3. 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 （中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）http://www.cellbank.org.cnhttp://www.dsmz.dehttp://www.atcc.org2.细胞株来源：认证细胞的获得null成功的细胞培养： 1.Well-established,properly equiped cell culture facility; 2.Practice of sterile techniques; 3.Appropriate,quality controlled reagents and supplies; 4.The knowledge and practice of the fundamental techniques involved in the growth of the cell type of interest.总结nullHigh standards in cell culture三、 细胞培养的应用举例（略）三、 细胞培养的应用举例（略）1、研究正常细胞生命活动 2、研究肿瘤发生、发展、治疗策略 3、药物开发 4、细胞疗法 5、细胞工程 6、干细胞工程 null1.研究细胞生命活动Drp1、线粒体膜折叠与细胞凋亡Cell, 2010,142:889nullTough-as-nails attitudeThe increased excitability of these neurons led to elevated levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in a region of the forebrain that mediates fear, aggression, and pleasure (nucleus accumbens). BDNF triggers dopamine release in these neural circuits, and deleting the BDNF gene in neurons in the ventral tegmental area significantly increased the percentage of tough, resilient mice in the laboratory strain.神经元的BDNFSerbia’s Nemanja Vidic epitomizes the gritty resilience of top soccer players. Image by M. Peters, Manchester United via Getty Images.Cell, 2010, 141:913-15null2. 肿瘤细胞基础与治疗应用探讨 正常细胞凋亡细胞培养的胃癌细胞*null -02:40 -00:20 00:00 12:00 24:20 24:40 25:00 46:00-00:20 00:00 00:20 00:40 16:40 17:20 17:40 18:40Cdc20 siRNACdc20 siRNA +mCdc20Cell mitosis and cell death Phase-contrast time-lapse analysis of progression through mitosis and death. HeLa cells Cancer Cell 16：347–358, 2009null-01:20 00:00 00:40 01:00 01:20 01:40 02:00 02:20 02:40Spindle Damage over Time HeLa-GFP-b-tubulin cells that were transfected with Cdc20 Cancer Cell 16：347–358, 2009Phase Tubulin -03:00 03:20 03:40 04:00 08:40 12:00 15:40 23:00 23:20 23:40null3.细胞疗法 * 体细胞移植 胰岛细胞移植（糖尿病）、视网膜上皮细胞（帕金森病） * 基因修饰的细胞移植 酪氨酸羟化酶修饰的永生化成纤维细胞、转基因成肌细胞(帕金森病） * 干细胞移植 骨髓造血干细胞移植、成肌细胞移植4.干细胞工程4.干细胞工程 细胞疗法 治疗性克隆 组织工程学 基因治疗null"for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells"http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2007/index.html“如果能在生物医学研究领域取得重大技术革新，得奖只是迟早的事”nullFigure 1. The idea of iPS cell-based regenerative therapy. There remain significant hurdles to overcome in each step. SF, skin fibroblasts; Kera, keratinocytes; CD34+, CD34+ cells from peripheral blood; ASC, adipose stem cell; CB, cord blood cell; Endo, endoderm; Meso, mesoderm; Ecto, ectoderm.Cell Cycle, 2010,9:884 null细胞培养 和 离心技术null细胞结构成分分离的离心技术离心技术原理 离心设备 离心方法 细胞结构成分的分离Subcellular fractionation and isolation of organellsnull离心力 匀速圆周运动的物体，在合外力消失或不足以维持向心力时，产生的背向旋转轴的运动力。null一.离心技术原理 （Centrifuge)利用溶液中颗粒密度、大小等特性，用旋转产生的离心力使颗粒从溶液中沉降从而分离、浓缩、提纯和鉴定。 * 分离细胞或其他的悬浮颗粒，从混有多种细胞的悬液中分离某 一细胞； * 从组织或细胞匀浆中分离细胞器，包括细胞核、线粒体、高尔 基体、溶酶体、过氧化物酶体、质膜、内质网等； * 分离病毒和大分子，包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。null3个因素： 沉降系数 相对离心力 离心时间离心设备：离心机、离心介质效果考评：纯度、得率细胞结构成分溶液：颗粒溶液、大小、密度特性null1.沉降系数（S）：重要指标 颗粒在单位离心力的作用下的移动速度 dx/dt w2x dx: 颗粒与转轴中心的距离 dt：颗粒沉降所需时间 W: 角速度 X: 转子半径 s(秒）=2r2(p-  m)=9r: 颗粒直径 p : 颗粒密度 m : 溶液介质密度  ： 溶液介质粘度1S=1×10-13snull决定沉降速度的因素： 与颗粒大小有关； 与颗粒密度有关； 与溶液介质密度和粘度有关。null颗粒密度与沉降系数沉降系数密度null离心分离时，作用在悬浮颗粒上的力常用RCF数值表示，即同一颗粒在离心时同地球重力相比较后得到的值。 RCF(g)=离心力/重力＝mw2x/mg=w2x/g =1.12r(RPM/1000)2 r: 旋转中心轴至转头内离心管某一部位的半径 RPM（rounds per minute): 转速，转头每分钟旋转的次数 2.相对离心力（RCF）：重要指标RCF与转速及旋转半径正相关null3.离心时间 颗粒经过溶液形成沉淀所需要的时间 t=K/S K: 表示转头离心效力的指标，与转速平方成反比。 离心机公司提供最高转速时的K值。 K值越小越好，效力越高。 S：沉降系数离心时间由离心效力和沉降系数决定nullnullRCF1×t1= RCF2×t2沉降离心中的两个因素RCF,t例：沉降某颗粒需10000g.min 10000g 1min 2000g 5min null细胞结构成分分离的离心技术离心技术原理 离心设备 离心方法 细胞结构成分的分离null二.离心设备4.温度控制（冷却设备）1. 转头（马达）3.离心腔 （真空设备）2.控制系统null离心设备分类： 制备型、 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 型； 常温、低温； 台式、立式； 低速、高速、超速null低速：6800g(细胞级） 分离 >10000S的细胞及细胞器 如：Beckman公司的J6，GS-6 高速：17,700－50,400g（亚细胞级） 分离 >100S的颗粒，包括部分细胞器及病毒 如：Beckman公司的J2 超速：90,400－694,000g（分子级） 分离<100S的颗粒 如：Beckman公司的L,XLnullOptimaTM L-XP（Beckman Coulter) 制备型超速离心机null性能指标： (1) 离心力：能达到的RCF； (2) 离心效力：K因子：k值越小，离心时间越 短，转头的效力越高。 1.离心机转头:离心技术的核心null转头类别：转头与轴的角度垂直转头 vertical rotor近垂直转头<10°水平转头 swing-out rotor90°0° 固定角转头 fixed-angle rotor24°沉淀的位置和 沉淀形成的时间 不同， 决定得率和纯度nullnull短 垂直转头 近垂直转头 固定角转头 水平转头分离纯度分离时间低高长null Beckman 公司转头的标记 SW: 水平转头,如SW50.1； V： 垂直转头,如V Ti80； NVT: 近垂直转头； Type: 固定角转头,如Type80Ti JA: 使用在J系列的固定角转头，如JA.2 JS: 使用在J系列的水平转头，如JS.13.1 数字：最高安全转速（×1000）； Ti: 钛合金，未标记为铝合金 null 金属疲劳 转子内部的应力改变导致裂纹 注意：安全系数>2；钛合金；转头寿命 超速 测速盘（超速花盘） 化学腐蚀 离心管破裂、样品渗漏 转头不平衡 离心管平衡误差0.01g；离心管放置不对称；水平转 头吊桶盖安装不当；转头不加盖；“O“形密封圈失效 离心管帽、垫圈、接合器使用不当转头损坏及原因null2.离心管注意抗压力程度、介质耐受程度null细胞结构成分分离的离心技术离心技术原理 离心设备 离心方法 细胞结构成分的分离null三.离心方法根据颗粒大小：1、2 根据颗粒密度：3根据离心介质有无梯度：离心介质有密度梯度null1.差速离心法 （Differential centrifugation)原理： 通过一系列递增速度的离心，依次将大小不同的颗粒逐级分离。大小颗粒混合物最大颗粒较大颗粒中等颗粒小颗粒上清上清上清上清null用途： 分离大小相差悬殊的细胞和细胞结构成分。 null• 沉降顺序： 核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—微粒（内质网与高尔基体微粒） • 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行纯化。null特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心； 操作简单； 分离纯度不高。null2.移动区带离心法 （moving-zone centrifugation)原理： 用梯度蔗糖或甘油作为介质，将要分离的样品放在介质表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。介质密度逐渐增高null用途： 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 分离效果只与颗粒大小有关，与密度无关。特点： 介质为密度梯度溶液，且密度较低，介质 的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小 密度( p>  m )。 必须注意离心时间(t)，不能使所有颗粒都 沉到管底。null3.等密度梯度离心法 （isodensity centrifugation)原理： 离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成一系列区带，然后从管底收集。null用途： 分离密度不等的颗粒,适用于病毒、DNA、RNA、蛋白质等，效果只与颗粒密度有关，与大小无关。特点： 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应 大于被分离组分的最大密度( p< m ) 。 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍， 往往需要高速或超速离心。null1938 Behrens nuclei and cytoplasm from liver cells (differential centrifugation) 1951 Brakke plant virus (density-gradient centrifugation ) De Duve lysosomes, peroxisomes Meselson, Stahl, Vinograd separating nucleic acid (equilibrium density gradient centrifugation in cesium chloride solutions ) 1984 Rothman reconstitute Golgi vesicle trafficking in vitro离心技术发展和细胞器分离nullFrom “Current protocols in cell biology” null细胞结构成分分离的离心技术离心技术原理 离心设备 离心方法 细胞结构成分的分离null四.细胞结构成分的分离细胞沉淀 细胞破碎 细胞结构成分的分离－离心技术 4.分离细胞器的鉴定和评价 5.举例：线粒体分离、细胞核分离null1. 介质密度为1g/ml; 2. 一般细菌和动物细胞密度为1.08-1.12g/ml, 病毒密度为1.18-1.31 g/ml。 3. 相对离心力 (g)和离心时间（min)决定沉降1.细胞沉淀（cell pellet)null2.细胞破碎* 渗透压冲击 * 超声波振荡 * 机械力研磨或剪切 * 反复冻融原则：只需破碎细胞膜，保留完整细胞器null渗透压冲击低渗介质：<0.15M NaCl 2.甘油处理，再低渗或等渗处理。超声波振荡用一定功率的超声波处理组织或细胞悬液，细胞急剧震荡破裂。机械研磨1.Potter-Elvehjem玻璃/Teflon匀浆器 2.Dounce 匀浆器反复冻融将细胞在-20C以下冰冻，室温融解，反复几次。null3.细胞结构成分的分步分离一系列的差速离心＋密度梯度离心 差速离心：分离细胞器 梯度离心：纯化细胞器null沉淀 RCF×时间 内容物 P1 1000g*10min 细胞核、重线粒体、大片细胞膜 P2 3000g*10min 重线粒体、细胞膜碎片 P3 6000g*10min 线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、完整高尔基体 P4 10，000g*10min 线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜 P5 20，000g*10min 溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜、大的高密度小泡 P6 100，000g*10min 细胞膜、高尔基体、核内体等 差速离心形成的沉淀（肝脏）差速离心nullnull差速离心需要的设备 离心机：低速、高速、超高速 转头： 固定角、垂直或水平 介质： 蔗糖 null密度梯度离心null 形成的溶液密度范围大 粘度低 对细胞成分损伤小 离心分离后容易去除 浓度容易测定 便宜理想的溶液介质null4.离心方法的选择匀浆物中各类细胞器大小不同： 差速离心 上清中各类细胞器大小有差别： 速率区带离心 上清中各类细胞器密度有差别： 等密度离心根据分离细胞器的性质：null例如：1. 线粒体、溶酶体和过氧化物酶体的分离 特征：密度接近、大小差别 选择：密度梯度离心null例如：2. 细胞核分离纯化 特征：密度、大小差别 选择：高密度蔗糖的差速离心null根据研究目的：分析分离：差速离心 （时间短；介质浓度低，对细胞结构成分损伤小）制备分离：密度梯度离心 （时间长，纯度高）4.离心方法的选择null5.分离细胞器的鉴定和评价（1）形态鉴定：光镜或电镜（2）生化分析：细胞器特异的标志酶null（1）形态鉴定：光镜或电镜MitochondrionGolgi apparatusRibosomeLysosomeEndoplasmic reticulum,null(2)生化分析：细胞器特异的标志酶null6.分离细胞器的用途（1）研究细胞器的化学组成、酶活性和代谢特点（2）研究细胞器的功能 无细胞系统，Cell Free System 蛋白质加工、分选； 内质网、高尔基体、线粒体的功能； 染色质的包装等。 null1997, François Ichas, Mitochondria Are Excitable Organelles Capable of Generating and Conveying Electrical and Calcium Signals .Cell, 89:1145 2001, Manuel Muñiz, Protein Sorting upon Exit from the Endoplasmic Reticulum. Cell,104:313 (membrane) 2006, Andrei Korostelev, Crystal Structure of a 70S Ribosome-tRNA Complex. Cell ,126:10651984, Allen, Scott Brady, and Ray Lasek, microtubule motor and movement; 1986, Rothman, Golgi cisternae from a cell-free system in which COPI-coated vesicles bud in the test tube. Cell 46:171 1988,cell cycle; 1988, King MP, Injection of mitochondrion into human cells lead to replacement of the endogenous mitochondrion DNA. Cell, 52:811 1995, R. A. Ruchubinski and S. Subramani, Cell 83:525; 1996, J. A. McNew Trends Biochem. Sci. 21:54; 1997, M. Albertini Cell 89:83 .Synthesis of catalase and its incorporation into peroxisomes null Cell. 2006 Sep 22;126(6):1065-77. Epub 2006 Sep 7 Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Our understanding of the mechanism of protein synthesis has undergone rapid progress in recent years as a result of low-resolution X-ray and cryo-EM structures of ribosome functional complexes and high-resolution structures of ribosomal subunits and vacant ribosomes. Here, we present the crystal structure of the Thermus thermophilus 70S ribosome containing a model mRNA and two tRNAs at 3.7 A resolution. Many structural details of the interactions between the ribosome, tRNA, and mRNA in the P and E sites and the ways in which tRNA structure is distorted by its interactions with the ribosome are seen. Differences between the conformations of vacant and tRNA-bound 70S ribosomes suggest an induced fit of the ribosome structure in response to tRNA binding, including significant changes in the peptidyl-transferase catalytic site. nullFrom “Current protocol of cell biology”null7.举例:细胞核分离原理： 细胞核特征：体积大，沉降系数大； 密度高，可通过浓蔗糖，分离容易。分离 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ： 细胞破碎（机械匀浆，渗透溶胀，表面活性剂）， 释放细胞核，光镜鉴定释放效果。 离心，光镜鉴定分离效果null从组织中制备细胞核 细胞破碎：裂解缓冲液：0.25M蔗糖， 10mM Tris-HCl pH7.4, 10mM NaCl （低渗）, 3mM MgCl2, 1mM DTT, 0.5mM PMSF。 组织研磨器； 肝脏组织切成1cm3小块，装入缓冲液中，倒入研磨器 离心： 浓蔗糖溶液：2M蔗糖 组织匀浆产物和浓蔗糖溶液等体积混合 23 000g， 30min， 4°C(白色沉淀)，水平转头(SW)null7.举例:线粒体分离原理： 线粒体特征：体积较大，沉降系数较大； 类似大小的细胞器较多，但密度有差别。分离设计： 细胞破碎（机械匀浆） 差速离心，必要时密度梯度离心nullnull（1）从大鼠肝脏组织中制备线粒体 细胞破碎：匀浆缓冲液（MS缓冲液，等渗） ：0.21M甘露糖 5mM Tris-HCl pH7.5, 70mM 蔗糖, 1mM EDTA Potter-Elvehjem或Dounce匀浆器/松型槌； 肝脏组织切成1cm3小块，装入缓冲液中，倒入研磨器 离心： 第一步：1300g， 10min， 4°C×3次， 沉淀未破碎细胞、细胞核、大片细胞膜和结缔组织纤维； 第二步：17 000g，15min, 4°C×2次， 沉淀线粒体。null（2）从培养细胞中制备线粒体 细胞破碎：匀浆缓冲液（低渗） ：10mM NaCl 10mM Tris-HCl pH7.5, 2.5mM MgCl2，细胞膨胀； Dounce匀浆器/紧型槌：数次 立刻加入MS等渗缓冲液，保持细胞器渗透压 离心： 第一步：1300g， 5min， 4°C×3次， 沉淀未破碎细胞、细胞核、大片细胞膜和结缔组织纤维； 第二步：17 000g，15min, 4°C×3次， 沉淀线粒体。null（3）密度梯度离心纯化线粒体 介质： Ficoll,Percoll,碘化介质（OptiPrep,Nycodenz,metrizamide),蔗糖 最常用的介质：非连续蔗糖梯度 1.5M蔗糖和1.0M蔗糖，10mMTris-HCl,pH7.5,1mM EDTA null（3）密度梯度离心纯化线粒体 离心： 第一步：60 000g，20min， 4°C，水平转头(SW) 线粒体在1M蔗糖和1.5M蔗糖界面处分层，轻柔吸出，重悬在 稀释的蔗糖溶液中 第二步：17 000g，15min, 4°C， 沉淀线粒体。null亚细胞结构成分的离心分离技术1.文献和成熟技术 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 的参照 2.介质和离心方法的选择 3.离心机的选择和正确使用