实时荧光定量PCR技术与应用

nullnull北京元业伯乐科技发展有限公司实时荧光定量PCR技术与应用nullnull提纲PCR概念PCR概念什么是PCR？ Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定DNA片段的方法。nullPCR 循环第一步 加热变性、双链打开第二步 退火、引物与单链结合第三步 - 引物延伸变为两个双链DNAnullnull常规PCR常规PCR技术： 理论上PCR产物的积累是按照2n指数扩增 PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析DNA Enginenull常规PCR常规PCR结合电泳分析方法的局限性 只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量 对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差＞1000%）存在扩增产物的污染问题。 必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事而且EB有毒 无法对扩增反应实时检测null提纲null定量PCR定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线实现对起始模板的定量分析IQ5 Real-time PCR仪定量PCR 定量PCR 实时荧光定量PCR三个关键词： 实时，荧光，定量 如何实时检测？？？ 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化nullPCR反应混合物荧光曲线荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图定量原理定量原理 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值null定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)定量原理定量原理Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数阈值线定量原理模板起始浓度越高，Ct值越小定量原理CT值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？null为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 Ct值的重现性null终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性 Ct值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图阈值选择阈值选择阈值的选择荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上 缺省设置一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑 定量原理定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率null在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct =N (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N. 方程式(1)两边同时取对数得: logN=logX0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: logX0= -log(1+Ex)*Ct+log N (3) Ct= -1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex) (4) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达 到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理null初始模板的对数值与循环数（CT值)呈线性关系 初始模板量越多, 扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度定量原理nullAbsolute（绝对定量） Determines input quantity of a nucleic acid target Requires a standard curve Relative（相对定量） Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samples Performed with or without a standard curve Typically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene定量方法 null 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。 绝对定量荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线.未知10410310610510210null首先确定未知样品的 C(t)值 借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量 得到未知样品初始量绝对值Unknown contains 3108 copies绝对定量nullLivak Comparative Ct Method (2-DDCt) for Relative Quantification1. Normalize C(t): C(t) = C(t)target - C(t)hskg2. Calculate C(t)Average: C(t)Ave = Average C(t) of replicates 3. Normalize to calibrator: C(t) = C(t)Sample Ave - C(t)Calibrator Ave (For calibrator, C(t) = 0)4. Fold difference: F=2-C(t) = Normalized fold difference (For calibrator, 2-C(t) = 1)Note, this formula can be modified to account for reaction efficiencies (Dr. M. Pfaffl) and multiple reference genes (Dr. J. Vondosomple). 相对定量——非标准曲线法 nullQuantities interpolated from standard curves are used to measure fold differences in target nucleic acid At least 2 concurrent standard curves are used One for gene(s) of interest At least one for reference gene Standard curves account for reaction efficiencies 使用标准曲线法进行相对定量分析相对定量——标准曲线法 null与传统PCR的比较实现了初始模板的绝对定量 检测灵敏度高 可以检测到低拷贝的目的基因 可以区分微小的拷贝数差异 可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量 省时省力 检测设计灵活null提纲null SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan荧光化学nullSYBR Green ISYBR Green 1nullSYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光nullSYBR Green I 工作原理ExtensionExtension Continued Apply Excitation WavelengthRepeatnullSYBR Green I 工作原理nullSYBR Green I 优点 使用方便 --- 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 --- 可以用于不同的模板 便宜 灵敏nullSYBR Green I 缺点与非特异性产物结合 无法实现多个目的基因的检测关于SYBR Green I关于SYBR Green I一种最基础的实验手段评价引物特异性： 使用熔点曲线分析（ Melt Curve Analysis） 评价引物对扩增效率： 将模板进行梯度稀释 研究最适反应条件： 使用梯度功能进一步优化实验条件nullMolecular BeaconsMolecular Beacons发夹型杂交探针nullMolecular Beacons原理：荧光偏振能量传递（FRET） 茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对null变性: 产生非特异性的荧光Molecular BeaconsnullTarget-loop interaction more stable than stem-stem退火时: 探针与靶序列结合 荧光素与淬灭剂分离 发出荧光（靶序列特异的）Molecular Beacons null延伸: 没有荧光Molecular Beacons SNPnullMolecular Beacons 实验结果nullMolecular Beacons 优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 可以实现多通道检测 荧光背景低nullMolecular Beacons缺点 设计困难 只能用于一个特定的目标 价格较高 nullTaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针nullTaqMan 目标特异性探针 5’为荧光素， 3’为淬灭剂与目标序列互补 nulld.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimersAdd Master Mix and SampleDenaturationAnnealingReaction TubeTaqMan工作原理nullExtension Step1. Strand Displacement2. Cleavage3. Polymerization Complete4. DetectionlTaqMan工作原理nullTaqMan实验结果nullTaqMan优点 对目标序列有很高的特异性 ---特别适合于SNP检测 可以实现多通道检测 与 Molecular Beacons 相比设计 相对简单nullTaqMan缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析 背景高null兼容化学试剂 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf null提纲null多重PCR在一个PCR管中进行多个不同的PCR反应： 同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 目标基因 内参照基因（看家基因） 不同荧光标记的探针识别不同的靶基因null内参照基因 解决模板提取过程中造成的差别 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别内参照基因null多通道技术多通道技术：使用多种荧光染料 在不同的检测通道内同时测定多种不同 荧光染料发出的荧光 null 1、引物及探针问题---引物及探针的相互干扰 2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行 2、模板量差别---共用资源的相互竞争多重PCR技术问题一个PCR管内进行多重PCR扩增要解决的问题：nullFR多重PCR技术问题1、引物及探针相互干扰问题null2、共用资源的相互竞争多重PCR技术问题null单双通道同时进行，相互验证多重PCR技术问题null提纲null 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达差异 基因表达差异分析（替代Northern Blot)： responses to a particular stimulus tissue differentiation stages of development cell proliferation disease state progression研究方面部分应用nullTwo-color-real-time qPCR assay for Cancer marker expression using TaqMan® probes应用实例nullCancer marker expression TaqMan chemistry Multiplexing Expression differences of ERBB2 in neoplastic breast tissue samplesnullCancer marker expressionERBB2 oncogene Transmembrane tyrosine kinase overexpressed in ~25 % of breast cancer cases Increased transcript levels associated with a poor prognosis and lower response to standard treatments GAPDH housekeeping gene for normalization材料和方法材料和方法 从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA RNA + no reverse transcriptase实验材料材料和方法材料和方法材料和方法材料和方法50ºC,30min 95ºC,15min 94ºC,15sec 60ºC,1min plate read go to step 3,39 more times 10ºC,forever EndnullColor 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 – FAM detection for ERBB2实验结果null实验结果实验结果实验结果ERBB2单双通道相互验证的实验结果nullHealthy RNATumor RNAGAPDHERBB21095 10522130 249295500 85730136000 1308002.16 X1.45 XCopies ng/ µl Total RNA实验结果null实验结果null00.20.40.60.811.21.41.61.82Healthy TissueCarc. TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异实验结果讨论讨论利用RT-qPCR在Opticon2上成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量提高到正常水平的1.8倍null提纲null Graph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescence recorded - Due to increasing temperature - Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curveSYBR Green I 融解曲线分析null荧光强度值随温度变化速率对温度作图(-dI/dT)SYBR Green I 融解曲线分析SYBR Green I 融解曲线分析SYBR Green I 融解曲线分析null扩增曲线1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. 63oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. Plate Read 6. 84oC for 1 sec 7. Plate Read 8. Go to line 2 39 more times 9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.SYBR Green I 融解曲线分析null1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. 63oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. Plate Read 6. 84oC for 1 sec 7. Plate Read 8. Go to line 2 39 more times 9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.SYBR Green I 融解曲线分析null 进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度Real-time PCR体系优化null利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化Real-time PCR体系优化null溶解曲线扩增曲线1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. 83oC for 1 sec 6. Plate Read 7. Go to line 2 39 more times 8. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.Real-time PCR体系优化null提纲null用TaqMan探针进行基因型分析SNP检测-基因型分析nullQ多色双通道技术应用-基因型分析null从病人血液样品中提取 DNA 基因型分类： A/A (Allele 1) G/G (Allele 2) G/A (Heterozygote)多色双通道技术应用-基因型分析nullAllele 1 control多色双通道技术应用-基因型分析nullAllele 2 controlVICFAM多色双通道技术应用-基因型分析nullHeterozygote controlFAMVIC多色双通道技术应用-基因型分析nullSYBR Green I进行SNP分析 Mismatches are extended at ~1,000 fold lower efficiency, resulting in ~10-cycle delay in product accumulation Both matches and mismatches can amplify with similar final quantity of product nullSYBR Green I进行SNP分析nullSYBR Green I进行基因分型nullSYBR Green I进行基因分型null实时荧光定量PCR应用定量： DNA定量 RNA定量 定性： SNP分析 基因型分析 RNA变异分析 融解曲线分析 null感谢各位光临！