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ELISA Ready Set Go 标准实验
方案
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注意：
1. 试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体，不建议不同试剂盒产品调换，因为可能影响结
果准确性。
2. 标准曲线孔建议做 2-3 个复孔。
3. 稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠，因为其可以灭活辣根过氧化物酶。
标准品稀释（如下图）
1. 按照 C of A 说明使用检测稀释液配制浓度为 500pg/ml 的标准品溶液。
2. 在高亲和 ELISA 板子中从 B1 和 B2 开始到 H1 和 H2 每孔分别加入 100ul 检测稀释液。
3. 取 200ul 的浓度为 500pg/ml 的标准品加入到 A1 和 A2 两个孔中。
4. 用排枪从 A1 和 A2 两个孔中吸取 100ul 加入到对应的 B1 和 B2 中，吹吸混合均匀，那么
B1 和 B2 标准品浓度为 250pg/ml。
5. 从 B1 和 B2 中吸取 100ul 加入到 C1 和 C2 孔中，混匀，那么 C1 和 C2 孔标准品浓度为
125pg/ml。
6. 按照步骤 4和 5的方法倍比稀释到H1和H2两孔。H1和H2孔中标准品的浓度是 4pg/ml，
体积为 200ul，取 100ul 弃掉。届时每个孔标准品的体积均为 100ul。
注意：4 到 6 步骤稀释速度要快，避免时间过长，建议使用多通道排枪进行。
7. 设置 A3 和 A4 为空白对照（只加 100ul 稀释液），为了避免胡克效应的影响，我们建议
可以采用 A1 和 A12 作为空白对照孔，而不设置样品或标准品。
结果计算：（需要从标准品 OD 值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量）。
1. 计算标准品，空白和样品孔平均 OD 值。
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2. 样品 OD 值减去空白孔平均 OD 值。
3. 利用软件拟合出 4 参数的对数标准曲线，也可以使用描点的方法在坐标中描绘出 X
轴为标准品浓度，Y 轴为平均 OD 值的各个点，然后大致拟合出相应的曲线。最佳的
方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。
4. 利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。
5. 如果在实验前样品经过稀释，则结果需要乘于稀释倍数。
储存和稳定性说明
1. EB 的 ELISA 试剂盒若按照说明书储存保质期为 6 个月。
2. 试剂盒提供冻结的标准品 20ul/瓶，收到后请立即冻存与-80 度冰箱，可保存 6 个月；使
用时融化离心 1 分钟，可避免标准品损失。请避免将标准品分装和反复冻融。每瓶标准
品只能用一次，剩余失效。稀释标准品步骤请参照说明书第一部分。
3. ELISA 板子请室温储存，其他试剂 4 度储存即可。
实验材料：
功能纯化级别的捕获抗体。
结合生物素的检测抗体。
标准品。
10×ELISA 包被缓冲液。
5×检测稀释液。
抗生物素的辣根过氧化物酶。
TMB 底物。
高亲和力 96 孔板（NUNC Maxisorp flat-bottom or Corning Costar 9018）。
1×PBS+0.05%吐温 20（或者 ELISA 洗液 Cat.No. 00-0400）
终止液：1M H3PO4 或者 2N H2SO4
仪器
吸管和单通或多通移液器
冰箱
排枪水槽
分光光度计
洗板机
实验流程：
1. 使用无菌水将包被液稀释为 1×（注意：预先将包被液平衡至室温）。
2. 用 1×包被液稀释功能级别的包被抗体，包被 ELISA板子，每孔 100ul，盖板，
四度孵育过夜。
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3. 第二天稀释检测稀释液（双蒸水稀释），吸出板子的捕获抗体溶液，用 300ul
洗液洗板 3-5次，每次浸泡时间不小于 1min,吸水纸上排干。
4. 200ul 检测稀释液封闭板子，盖板，室温孵育 1小时。
5. 吸去检测稀释液，用 300ul 洗液洗板 3-4 次，每次浸泡时间不小于 1min,吸
水纸上排干。
6. 按照上述说明使用 1×检测稀释液稀释标准品（严格按照说明书进行）。
7. 加 100ul 样品和标准品到对应的孔中，封板，室温孵育 2 个小时或 4 度过夜
（高灵敏度）。
8. 孵育期间，按照说明书准备检测抗体。
9. 吸去样品，用 300ul 洗液洗板 5 次，每次浸泡时间不小于 1min,吸水纸上排
干。
10. 每孔加 100ul检测抗体，封板，室温孵育 1个小时。
11. 孵育期间，按照说明书准备抗生物素的 HRP 溶液。
12. 每孔加 100ul抗生物素的 HRP 溶液，封板，室温孵育 0.5 个小时（避免溶液
中有叠氮钠，因为会影响 HRP 活性）。
13. 吸去溶液，用 300ul 洗液洗板 3-4 次，每次浸泡时间不小于 1min,吸水纸上
排干。
14. 每孔加 100ulTMB 溶液，封板，室温孵育 15min（注意：TMB 要预先平衡至室
温）。
15. 加 50ul 终止液终止。
16. 加终止液后 30min 内检测，450nm 读板。
附录：缓冲液配制方法
1X PBS:
80.0 g NaCl
2HPO3
2PO4
以 1 L DI H2O 定容 并调节 pH 值为 7.0
ELISA Wash Buffer:
的 1X PBS
-20
此外, 也可以购买 ELISA 洗液干粉 (eBio cat. # 00-0400) ，用 1 L DI H2O 重悬。
浙公网安备 33021202002483