第11章 生物芯片技术hu

null第十一章 生物芯片技术 第十一章 生物芯片技术 第十一章 生物芯片技术第十一章 生物芯片技术第一节 生物芯片的制备 第二节 样品与探针制备 第三节 杂交反应及过程控制技术 第四节 杂交图谱的信号检测技术 第五节 数据分析 第六节 生物芯片的种类 第七节 生物芯片的应用null常见的芯片可分为两大类：一类是原位合成；另一类是直接点样。 原位合成适用于寡核苷酸； 直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。 直接点样法比原位合成法简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。null原位合成有两种途径。一是光蚀刻法；一是喷印法。 光蚀刻法可以合成30nt左右，喷印法可以合成40-50nt； 光蚀刻法每步缩合率较低，一般为95%左右，合成30nt产率仅20%； 喷印法可达99%以上，合成30nt产率可达74%，从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。此外，喷印法不需特殊的合成试剂。第一节 生物芯片的制备第一节 生物芯片的制备1.1 原位光蚀刻合成 1.2 原位喷印合成 1.3 点样法 1.4 微电子芯片 1.5 三维芯片 1.6 流过式芯片（flow-thru chip）null1.1 原位光蚀刻合成 Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。 原理如下页图所示 null首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。 并且合成碱基单体的5‘羟基末端连上一个光敏保护基。 每次选取适当的蔽光膜(mask)使需要聚合的部位透光，其它部位不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基脱保护而活化。null每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 使用多种蔽光膜能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。 某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如：一段8个碱基的寡核苷酸有65，536种排列的可能，通过32个化学步骤，8个小时就能合成65，536个探针。nullnull优点： 用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。 合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。 缺点： 每步合成反应产率比较低，不到95%。探针的长度受到了限制。nullAffymetrix将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到98%。 该方法同时解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。 利用波长更短的物质波如电子射线去脱保护可使点阵密度达到1010/cm2null1.2 原位喷印合成 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。 喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。 化学原理与传统的DNA固相合成一致，不需要特殊制备的化学试剂。null1.3 点样法 点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。 一些研究者采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。由于方法费时费力，不适于大规模DNA芯片制作。null有的研究者用多聚赖氨酸包被固相支持物（玻片），经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。大规模cDNA芯片多采用这种方法。 与其寡核苷酸微芯片相比：DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和性和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产物。null有的研究者将玻片上覆盖20μm厚薄层聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用机械刻写或光刻的方法在其表面划上网格。 然后用激光照射蒸发掉单元间隙的多余凝胶，以实现DNA芯片分区，单元大小为 40×40μm或 100×100μm，间隔分别为50μm和100μm。 将化学方法合成的寡核苷酸探针自动化点样于各个单元内而制成DNA芯片，点样速度可达2000单元/秒。null点样装置采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印针的打印/喷印头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。 根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。 打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯片保持一定距离。 打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。 喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常1平方厘米只有400点。null打印/喷印点样示意图Telechem公司的SpotBot Personal MicroarrayerCartesian Technology公司的PixSys 5500 PA Workstationnull1.4 微电子芯片 微电子芯片是由美国Nanogen公司开发的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。 微电子芯片是多位点电控阵列、并含独立可寻址检测区域的微电子基因芯片。 基质全部以硅、锗与基础的半导体材料，制成1mm×1mm的阵列，在其上构建25-400个微铂电极位点，各位点可由计算机独立或组合控制。 芯片制造或成品芯片检测，通过相似微电极的电场变化来使核酸结合，引入“电子严谨度”参数。null探针序列特征要求使用者来控制杂交过程中的严格性。这种微电子基因芯片具有以下优点： 1．电场定位过程能选择性地转运带电荷DNA分子，通过每个微电极位点的电场正负、强弱变化，能准确有效地随意调控芯片表面的核酸，既可将核酸结合在微电极位点上，也可以使核酸转运出来。null2．通过电场变化能加快DNA杂交速率，通过导入正电场后，可以大大加快待测核酸同已知探针的结合速率，减少了杂交反应时间，同普通的"被动"杂交反应的几小时相比，这种"主动"杂交反应仅仅几秒钟就可完成。另外电场变化又可有效地去除未结合游离分子，减少未结合荧光信号干扰。null3．通过电子严谨度可有效地控制杂交过程中的错配度，杂交错配的程度，对不同的要求给以不同的电场就可以符合不同的电子严谨度，这对核酸杂交严格度可以非常灵活地控制，这可以非常准确地进行SNP检测。 该种芯片的缺点是制备复杂、成本高。null1.5 三维芯片 三维芯片是由美国的Packard、摩托罗拉、Argonne国家实验室三家机构与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。 三维生物芯片实质上是一块显微镜载玻片，其上有10,000个微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用于靶DNA，RNA和蛋白质的分析。 先把已知化合物加在凝胶条上，再用3cm长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。 每个毛细管能把小到0.2nL的体积打到凝胶上。null该生物芯片系统得特有优点： 一、凝胶的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。 二、可以在芯片上同时进行扩增与检则。 一般情况下，必须在微量多孔板上先进行PCR扩增，再把样品加到芯片上，因此需要进行许多额外操作。 本芯片所用凝胶体积很小。使PCR扩增体系的体积减小1,000倍（总体积约纳升级），从而节约了每个反应所用的PCR酶（约减少100倍）。 三、以三维构象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然状态在凝胶条上分析，可以进行免疫测定，受体-配体研究和蛋白组分析。null1.6 流过式芯片（flow-thru chip） Cene Logic正在开发一种在芯片片基上制成格栅状微通道，Cene Logic设计及合成特定的寡核苷酸探针，结合于微通道内芯片的特定区域。 从待测样品中分离DNA或RNA并对其进行荧光标记，然后，该样品流过芯片，固定的寡核苷酸探针捕获与之相互补的核酸，采用Cene Logic‘s信号检测系统分析结果。null流通式芯片用于高通量分析已知基因的变化： ⑴敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化； ⑵速度快：微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需时间； ⑶价格降低：由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸附于微通道内，使每一种流过芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。第二节 样品与探针制备第二节 样品与探针制备2.1 样品制备 2.1.1 核酸样品 2.1.2 蛋白及其它生物样品 2.2 探针制备null2.1 样品制备 样品制备是芯片发展的瓶颈所在。 对于较大规模制作芯片的用户，由于点样样品数目太多，即使采用高通量试剂盒还是不够方便。null2.1.1 核酸样品 RNA样品通常需要首先逆转录成cDNA并进行标记后才可进行检测。 由于检测灵敏度所限，尚难以普通探针对极少量的核酸分子进行杂交和检测，所以需要对样品或后续测试信号进行适当的放大。 多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增。目前DNA样品的扩增一般是通过液相反应来完成，溶液中通过PCR反应获得线性扩增很困难；不同靶DNA对引物的竞争，意味着序列的扩增不一定均一。null解决问题方法： 固相PCR系统，该系统是将2种引物排列在丙烯酰胺膜上，与DNA样品、PCR试剂混合，如样品含有靶序列，则开始扩增反应；通过这种固相PCR体系，可避免对引物的竞争，同时也降低了遗留污染。null绕过样品扩增的方法： Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，将多对引物固定于支持物上（其位置和序列信息预定），以类似于原位PCR的方式一次性对样品多个片段进行扩增和放大，而且不会由于引物种类过多而出现相互间的竞争和抑制（这种情况曾出现于多重PCR中）。null引物具有较强的特异性，扩增反应也不存在交叉污染，因而省略了处理常规多重和多个PCR反应的繁琐工作。 如Lynx Therapeutics 公司，引入的大规模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一个样品中同时对数以万计的 DNA 片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。null2.1.2 蛋白及其它生物样品 基于生物大分子相互作用原理的生物芯片在检测时生物样品的处理遵循相似的方式，即信号的放大和样品的标记。 例如，蛋白芯片在进行检测和分析时，可以将待分析的蛋白样品用荧光素或其它物质进行标记，然后与生物芯片上的生物大分子进行相互作用，最后依据标记物质的不同采取相应的检测方式采集和分析样品和芯片上生物大分子相互作用的结果。null对与非核酸类的生物大分子，存在的问题是有时不便于对其进行扩增和放大，因为其它生物大分子的结构相对比较复杂不能进行简便的克隆或扩增。 检测的灵敏度提出了更高的要求。其它生物大分子的检测和分析类似与蛋白分子。 如：核酸与蛋白的相互作用，配体间的相互作用，糖与蛋白的相互作用等。null2.2 探针制备 探针的功能是识别靶序列和携带报告分子（如同位素、荧光、地高辛等）。 目前探针的标记主要是荧光标记。 荧光标记基本分为2种，一种是使用荧光标记的引物，一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。 目前常使用的荧光物质有：荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。null根据扩增产物分离的方法不同，标记方法有： 进行单引物标记的，其扩增产物通常由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离； 对一个引物用生物素标记，另一个引物用荧光素标记的，一般用亲合素偶联的磁珠捕捉其扩增产物，通过变性处理使荧光标记的产物解链。 生物素残基标记引物，将生物素标记的扩增产物与芯片杂交，洗涤后加入亲合素连接的荧光物，通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号，然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测。null提高监测灵敏度包括两个方面：信号放大和模板扩增。提高灵敏度处理探针的方法有三种： 分支探针：设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针，分支末端以酶标记。分支核苷酸与酶的双重放大作用而将杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。 分子信标：一种设计巧妙的荧光标记的核酸探针，未杂交状态下为发夹结构，在发夹的两端分别连接荧光素分子和猝灭分子。 肽核酸：以中性酰胺键为骨架，不带电荷，为DNA类似物。与DNA的亲和性高、酶解稳定性好，因此多用来做诊断和检测用探针。第三节 杂交反应及过程控制技术第三节 杂交反应及过程控制技术芯片杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步。杂交时选择的条件要使成千上万对的杂交反应中的最大多数处于最佳状态中，也就是说要使得尽可能多的正确配对物都不遗漏（假阴性尽可能少），有错配的杂交降低至最低（假阳性尽量少），这是非常难以达到的境界。null杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。 这些影响因素包括： （1）寡核苷酸探针密度的影响。 低覆盖率使杂交信号减弱； 过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。 （2）支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。 当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强。 选择合适长度间隔序列，杂交信号可增强150倍。null（3）杂交序列长度的影响。 在杂交反应中经常发生碱基错配现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，杂交序列长度是影响稳定性的重要因素。 短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复合物的稳定性要差一些； 长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配能力要差一些。 研究表明，12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好。null（4）GC含量的影响。 GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。 （5）探针浓度的影响。 以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度。null（6）核酸二级结构的影响。 在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越长，也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度。第四节 杂交图谱的信号检测技术第四节 杂交图谱的信号检测技术4.1 荧光标记杂交信号的检测方法 4.1.1 激光扫描荧光显微镜 4.1.2 激光扫描共焦显微镜 4.1.3 采用了CCD相机的荧光显微镜 4.1.4 光纤传感器 4.2 生物素标记方法中的杂交信号探测null杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。以往的研究中已形成许多种探测分子杂交的方法，如荧光显微镜、隐逝波传感器、光散射表面共振、电化传感器、化学发光、荧光各向异性等等，但并非每种方法都适用于DNA芯片。 由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。null大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。 杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。 由于所使用的标记物不同，因而相应的探测方法也各具特色。大多数研究者使用荧光标记物，也有一些研究者使用生物素标记，联合抗生物素结合物检测DNA化学发光。通过检测标记信号来确定DNA芯片杂交谱型。null4.1 荧光标记杂交信号的检测方法 使用荧光标记物的研究者最多，因而相应的探测方法也就最多、最成熟。 荧光显微镜可以选择性地激发和探测样品中的混合荧光标记物，并具有很好的空间分辨率和热分辨率，特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描时，分辨能力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定的空间分辨率，而在传统的显微镜是很难做到的，这便为DNA芯片进一步微型化提供了重要的检测方法的基础。null大多数方法都是在入射照明式荧光显微镜（epifluoescence microscope）基础上发展起来的，包括激光扫描荧光显微镜、激光共焦扫描显微镜、使用了CCD相机的改进的荧光显微镜以及将DNA芯片直接制作在光纤维束切面上并结合荧光显微镜的光纤传感器微阵列。这些方法基本上都是将待杂交对象以荧光物质标记，如荧光素或丽丝胶（lissamine）等，杂交后经过SSC和SDS的混合溶液或SSPE等缓冲液清洗。null4.1.1 激光扫描荧光显微镜 探测装置比较典型。 将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5~10μm。 同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。null通过计算机控制传动平台X－Y方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。 这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。null4.1.2 激光扫描共焦显微镜 激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。 在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。 Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人设计的DNA芯片即利用此方法。其方法是将靶 DNA分子溶液放在样品地中，芯片上合成寡核苷酸阵列的一面向下，与样品池溶液直接接触，并与DNA样品杂交。 当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时，既有芯片上杂交的DNA样品所发出的荧光，也有样品地中DNA所发出的荧光，如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。null共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率，可以在接受芯片表面荧光信号的同时，避开样品池中荧光信号的影响。 一般采用氩离子激光器（488nm）作为激发光源，经物镜聚焦，从芯片背面入射，聚集于芯片与靶分子溶液接触面。 杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集，并经滤波片滤波，被冷却的光电倍增管在光子计数的模式下接收。经模数转换反转换为数字信号送微机处理，成像分析。null在光电信增管前放置一共焦小孔，用于阻挡大部分激发光焦平面以外的来自样品池的未杂交分子荧光信号，避免其对探测结果的影响。 激光器前也放置一个小孔光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径，使之能够只照射在单个探针上。 通过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。 特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约 12万美元。null4.1.3 采用了CCD相机的荧光显微镜 这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。 不是逐点激发探测，激发光照射光场为整个芯片区域，CCD相机获得整个DNA芯片的杂交谱型。 这种方法一般不采用激光器作为激发光源，由于激光束光强的高斯分布，会使得光场光强度分布不均，而荧光信号的强度与激发光的强度密切相关，因而不利于信号采集的线性响应。null为保证激发光匀场照射，有的学者使用高压汞灯经滤波片滤波，通过传统的光学物镜将激发光投射到芯片上，照明面积可通过更换物镜来调整； 也有的研究者使用大功率弧形探照灯作为光源，使用光纤维束与透镜结合传输激发光，并与芯片表面呈50°角入射。 采用了CCD相机，大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。 特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用。null4.1.4 光纤传感器 将 DNA芯片直接做在光纤维束的切面上（远端），光纤维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。 光纤维束由7根单模光纤组成。每根光纤的直径为200μm，两端均经化学方法抛光清洁。 化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。 将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（490nm），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜，由CCD相机接收。null每根光纤单独作用互不干扰，而溶液中的荧光信号基本不会传播到光纤中，杂交到光纤远端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE缓冲液中浸泡10秒钟去除，进而反复使用。 这种方法快速、便捷，可实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度。 光纤维束所含光纤数目有限，不便于制备大规模DNA芯片，有一定的应用局限性。null4.2 生物素标记方法中的杂交信号探测 以生物素（biotin）标记样品的方法由来已久，通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号； 由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多，因而检测方法也更趋多样化。null如果采用尼龙膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂交将受到很大的限制，因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。 使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。null虽然荧光检测在芯片技术中得到了广泛的应用，但是荧光标记的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号，而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是由正常配对产生的，还是单个或2个碱基的错配产生的，或者兼而有之，甚或是由非特异性吸附产生的，因而目前的荧光检测系统还有待于进一步完善与发展。null有研究者正试图绕过荧光标记，建立新的检测系统，以提高杂交信号检测的灵敏度。比较成熟的是采用激光系统扫描仪进行的荧光检测，噪音水平、信噪比、分辨率是衡量扫描仪工作质量的几个重要指标。 由于荧光标记法的灵敏度相对较低，因此质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等正作为新的芯片标记和检测方法处于研究和试验阶段，其中最有前途的当推质谱法。第五节 数据分析第五节 数据分析5.1 芯片的数据归一化 5.2 芯片数据的视图分析 5.3 芯片数据的统计学分析 5.4 芯片的生物学分析nullDNA芯片能够同时分析大量的信息，包括单核苷酸变异多态性（Singe Nuleotide Polymorphisms,SNP）已表达序列标志（Experessed Sequence Tage，EST）和基因克隆等。 用基因芯片测定细胞生长不同时期的基因表达、测定正常组织与肿瘤组织的DNA变化，测定用药前后DNA发生的变化、测定基因突变等，就可能发现新药、进行疾病的基因诊断、疾病的预报、弄清人类生物学的奥秘。因此芯片的数据分析显得尤为重要。null芯片杂交图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成。一个完整的生物芯片配套软件应包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片的图像处理团建、数据提取（mining）或统计分析软件，芯片表达基因的国际互联网上检索和表达基因数据库分析和积累。 从国际上生物芯片专利的按领域分布来看，62%的专利集中在数据分析领域，可见如何对生物芯片带来的海量数据进行解读、分析是生物芯片研究领域的焦点和重点。null芯片数据分析主要是通过芯片各点数据的分析比较和芯片间的数据比较来实现的。 目前常用的芯片数据分析手段有：数据归一化分析、直观视图分析、统计学分析和生物学分析。null5.1 芯片的数据归一化 在芯片实验中，各个芯片的绝对光密度值是不一样的，直接比较多个芯片表达的结果显然会导致错误的结论，因此在比较多个芯片实验时，必须减少或消除各个实验之间的差异。最常用的方法便是芯片数据的归一化处理。 归一化的方法可以用特定的对照基因或者叫做“看家基因（Housekeeping Genes）”法，或将各点光密度值或比值除以所有点的平均值法，或附带一些参数如平均值等以作为该芯片的内部对照。但至今为止仍无真正意义的理想的归一化方法，特别时对于不同实验室间的芯片数据的比较。null“看家基因”法时比较常用的方法，该法是选择一个通用基因或DNA片断作为对照基因固定在芯片上，杂交时将一定量的与之互补的荧光标记探针混合到杂交液中。这样可以将对照点信号与各样点信号比较，其比值便可消除各实验室的差异，从而达到归一化的目的。 理想的对照基因应能在所有的实验中均能得到可靠的信号，且重视性好，稳定性好，易于得到推广。然而，目前还尚未找到这样的理想对照基因。 除了上述归一化方法外，为比较多个芯片表达的数据，还应严格控制每次实验的条件，如：目标DNA标记的程度、荧光激发和发射的效率、测定的条件等。使实验在相同的环境和条件下进行。null5.2 芯片数据的视图分析 视图分析使最简单、最直接、最直观的分析方法。 通常用散点图（二维和三维）、直方图和饼图直观地显示芯片表达的结果，对于结果较为明显的数据，可以直接作出判断。null5.3 芯片数据的统计学分析 从芯片测定结果的大量数据中获取有用的生物学信息，统计学的处理分析是必不可少的。 统计学分析已广泛用于大规模基因表达的分析。 统计分析可以帮助生物学家发现新的基因、DNA序列、基因的突变位点等。 目前应用于基因芯片表达数据统计分析的主要方法是聚类分析（Cluster Analysis）。 聚类分析是研究事物分类的一种方法，是在事物分类面貌尚不清楚的情况下研究事物的分类。其方法是直接比较样本中各指标之间的性质，将性质相近的归为一类，性质差别较大的归在另一类。null聚类分析根据其聚类指标或计算方法分成许多种。 在基因芯片表达数据分析中，应用最为广泛的是系统聚类分析（hierarchical clustering），此外还有Bayesian聚类分析，逐步聚类分析（k-means clustering）,自组图分析（self-organizing maps,SOMs），二向聚类分析（two－way clustering），神经网络聚类分析（neural network clustering）,组成分分析（principal component analysis），标度分析（multidimensional scaling analysis），affinity grouping,market basket analysis,link analysis,decision trees, rule induction,genetic algorithms等统计分析手段。null系统聚类分析法是将芯片表达的数据点分配进入有严格等级的层层嵌套的子集。 最相接近的数据点分成一组，并用一个新点来替换，该新点的值为此两点的平均值，其他点同样处理，然后用同样的方法进行下级处理，直至最终成为一个点； 这样数据点就形成一个家谱的树状结构，树枝的长度表示两组数据的相似程度。null系统聚类分析适合于具有真正等级下传的数据结构，不适合于基因表达谱可能相似的复杂数据集。 聚类分析将基因与最相关的表达谱放在一起，分析的基础是总基因组的线性相关。 生物系统的有序性质可以保证聚类分析方法会揭示出生物行为的有趣特征。 Bayesian聚类分析是高度结构化的方法，适合于事先能够分配的数据集。null逐步聚类分析法是完全没有结构化的方法，完全在局部范围内处理数据，产生一个无组织的簇（Cluser），比较难以理解。 自组图分析允许将部分结构强加于簇中，结果直观易于理解，适合于复杂的数据。 二向聚类分析适合于高度组织化的基因表达数据。 标度分析可以显示两维欧氏（Euclidean）距离，即实验样品间的大概相关程度。 主成分分析可以去定数据变化较大的点和变化的范围。null理想情况下每个簇对应于一个基因，但由于大量或低丰度的基因，可以存在一些非重叠的簇，簇的数量可能超过序列已经导出的独立基因的数量。 加上软件中图象重叠对齐的误差，可能产生伪簇。 对于没有明显重叠的数据，各种聚类分析产生相同的簇，但如果数据分散及相互交叉，不同的聚类分析可能产生不同结果，此时应根据生物学分析来作出推断。null生物芯片表达数据分析的软件的开发已越来越受到科学家和开发商的重视，不断有新统计方法软件推出。BioDiscovery公司开发的基因芯片表达数据分析软件GeneSightTM中和了数据库管理、系统聚类分析。神经网络聚类分析、主成分分析和时间系列分析（Time Series Analysis）等分析手段，还有直观的视图分析方法。这类软件还有Imaging Research Inc.的Array VisionTM基因芯片表达分析软件。Stanford大学还在Internet网上提供自由下载的芯片数据聚类分析软件Cluster。适合于多种芯片表达的数据分析。null5.4 芯片的生物学分析 生物学分析是根据视图分析的结果，结合生物学知识作出相关判断。时间过程分析（time－course analysis）是用较多的一种方法，可以用于分析细胞生长不同时期的基因表达、正常组织与肿瘤组织的DNA变化、测定用药前后DNA发生的变化、基因突变等。 生物芯片的数据处理目前仍在发展之中，并不断有新的技术或方法被应用，随着生物芯片的广泛应用，芯片的数据处理将日臻完善。第六节 生物芯片的种类第六节 生物芯片的种类6.1 基因芯片 6.2 蛋白质芯片 6.3 细胞芯片和组织芯片 6.4 芯片上的实验室 6.5 小分子芯片null6.1 基因芯片 基因芯片和我们日常所说的计算机芯片非常相似，只不过高度集成的不是半导体管，而是成千上万的网格状密集排列的基因探针，通过已知碱基顺序的DNA片段，来结合碱基互补序列的单链DNA，从而确定相应的序列，通过这种方式来识别异常基因或其产物等。null基因芯片技术主要包括四个基本技术环节： 芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及分析。 基因芯片包括三个典型类型：DNA芯片、cDNA芯片和Oligo芯片。nullnull6.1.1 DNA芯片 DNA芯片使用了DNA双螺旋链中A-T和G-C这样的Watson-Crick对的的典型的性质以及对互补序列识别的性质。 换句话说，DNA芯片上的单链被当作诱饵，而当 加入DNA试样时候，只有其互补链与之成键。 DNA芯片能包含数千到数十万种DNA诱饵，这样就可以筛选任意数量的DNA样品。因此审查的速度是令人惊异的。null芯片上的DNA诱饵的序列都已知，重要的是找出要筛选的DNA与哪一位置结合。 为检测诱饵-样品DNA成键的数量，通常样品DNA被涂以萤光染料然后扫描机读取芯片上的荧光强度。 强荧光度意味着样品中有许多互补DNA链与诱饵DNA链成键。 现在正在发展高灵敏度的电子筛选法，但是还没有制造出来。 null6.1.2 cDNA芯片 cDNA芯片是指对各种生物随机克隆和随机测序所得的cDNA片段进行归类，并把每一类cDNA片段的代表克隆（代表一个独立基因 ）经过体外扩增，得到大小和序列不同的片段分别经过纯化后，利用机械手高速将它们高密度有序地点样固定在玻片硅晶片或尼龙膜上，从而制备成cDNA微阵列，以此对各基因的表达情况进行同步分析。nullcDNA芯片可以检测待测样品中是否有与之互补的序列。 将待测样品中的mRNA被提取后，通过反转录反应过程获得标记荧光的cDNA，与包含上千个基因的cDNA微阵列进行杂交反应16小时后，将玻片上未互补结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定微阵列上各点的荧光强度，推算出待测样品中各种基因的表达水平。null与传统的检测RNA表达水平的技术相比较，cDNA芯片具备高通量的优势，它越来越被研究人员应用于基因表达检测，通过定量监测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面。null6.1.3 寡核苷酸芯片 寡核苷酸芯片的主要原理与cDNA芯片类似，主要通过碱基互补配对原则进行杂交，来检测对应片段是否存在、存在量的多少。 与cDNA芯片的本质差别在于寡聚核苷酸芯片固定的探针为特定的DNA寡聚核苷酸片段（探针），而后者为cDNA。 基因表达芯片的两个重要参数是检测的灵敏度和特异性。 cDNA芯片由于基因长短不同以至Tm值各异，众多的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难同一，使得传统的cDNA芯片的分辨能力受到限制。null寡聚核苷酸芯片序列选择经过优化，利用合成的一定长度（如２０，３０，70-mer等）的寡核苷酸单链探针代替全长cDNA点样，制成芯片。 优点：无需扩增，防止扩增失败影响实验；减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；杂交温度均一，提高杂交效率；减少二级结构。 寡核苷酸芯片还可以通过原位合成法制备，而cDNA芯片只能通过点样制备。 上述特点使得寡核苷酸芯片的应用日益广泛。但是当寡核苷酸序列较短时，单一的序列不足以代表整个基因，需要用多段序列。null高密度的寡核苷酸芯片广泛用于分析基因组数据，与传统的凝胶分析方法比较起来，具有成本低、高通量、高度自动化的优点，已广泛用于用遗传变异扫描、分子条编码、基因表达检测及测序。寡核苷酸芯片主要用途包括： 1）临床诊断方面。 用于研究人类多基因相关性疾病（如癌症、心血管疾病等），发现相关的基因及其相互作用机理，寻找早期发现，早期诊断的方法；同时还可制成外源性病原体相关基因芯片，如病毒性肝炎芯片等；null2）基因功能研究。 应用基因芯片可以开展DNA测序、基因表达检测、基因突变性、基因功能研究、寻找新基因、单核苷酸多态性（SNP）测定等研究； 3）药物筛选和新药开发。 采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药学（pharmacogenomics）领域带动新药的研究和开发；并可指导实现合理用药。 null４）环境监测和指导高科技农业等。 监测流行病和传染病扩散； 监测有害微生物的发生和传播；农、林、牧、渔等产业的品种改良和病虫防治。 ５）其它。 如DNA身份认定等。null6.2 蛋白质芯片 由于利用了DNA与互补的DNA或RNA结合的典型性质，DNA 芯片在短时间内就取得了成功。 mRNA 和蛋白质之间数量关系上有争论，而且实际上在细胞中参与各种不同反应的都是蛋白质。 如果能制造出蛋白质芯片而不是DNA芯片，而且如果蛋白质表达强度和键合物能被发现，就有可能把研究拓展到DNA芯片鞭长莫及的领域。null蛋白芯片与基因芯片的原理相似。不同之处有，一是芯片上固定的分子是蛋白质如抗原或抗体等。其二，检测的原理是依据蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其它分子的相互作用。 蛋白芯片技术出现得较晚，尚处于发展时期，最近也取得了重大进展。nullScience杂志报道的酵母蛋白质组芯片（proteomechip），是第一个包含一种生物全部蛋白质分子的蛋白质芯片。 然而，要制造一个蛋白质芯片，每个蛋白质都需要提纯，还有，将蛋白质以某种形式固定到芯片上的技术还不完善。也许植入较常规蛋白质易于控制的抗体是个替代 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。nullnullnull尽管被指出了许多问题，2000年秋天，Schreiber小组展示了他们可以制造高密度蛋白质芯片并且保持蛋白质成键能力的技术(Science, 2000, 289, 1760-1763)。 以醛基活化光滑的表面， 蛋白质通过共价键与之相连。他们用了几种不同的蛋白质做芯片能保持活性的例证，但是不同蛋白质在芯片上能否互不干扰仍是个问题。null2001年，耶鲁大学的Snyder小组完成(Science, 2001, 293, 2101-2105)覆盖了芽孢酵母大部份基因产物的大约6,000种蛋白质，被表达并在N-末端以GST- HisX6(glutoahione S-转移酶-聚组氨酸)标记，然后植入芯片。 光滑的玻璃表面上醛基或Ni离子包裹(与HisX6成键)使蛋白质平滑地附到芯片之上。平均分配的点入的蛋白质通过萤光标记的GST抗体确认。 对钙调素(calmodulin)和磷酸肌醇酯(phosphoinositol lipid)，两个代表性的蛋白质成键方式。进行萤光标记然后在芯片上筛选。以此证明蛋白质间的相互成键能力并用其识别新的成键的蛋白质。null蛋白质芯片公司Ciphergen在芯片表面包裹了各种材料，利用这些不同的表面区别不同的蛋白质。 设计的表面材料有疏水型的， 亲水型的，阳离子和阴离子交换型的，金属离子和潜活性分子等等。 仅用这些有限数量的表面来识别数以千计的不同蛋白质比较困难。与芯片成键的蛋白质采用MALDI-TOF质谱进行分析。null6.3 细胞芯片和组织芯片 不只有DNA或蛋白质，还有细胞或器官也能布置在玻璃表面上从而制得细胞芯片或组织芯片。 举例来说，如果你想要找与细胞膜受体成键的配体，你需要布置整个细胞而不是提纯受体并用其点板。如果矩阵由不同的细胞组成，将会容易地辨认出与细胞特异性成键配体。 这种方法应用将会很广。例如。如果配体与一个特定的癌细胞成键。对照试剂或者毒素取代物将会连到配体上。然后对每个做图像分析和处理。null相反，小分子或基因排列将会在一个芯片上被制备，而且细胞应用在它上面。 当细胞连接到芯片上的每个遗传材料时，每个基因将会缓慢地释放而且吸收到细胞内，正如病媒动物的行为一样。 如果病媒动物表达细胞表面的受体，受体序列将会在细胞表面上被构造，为将来的化验做筛选。null6.4 芯片上的实验室 大部分芯片实验要求多步样品制备过程，例如DNA、RNA 或蛋白质萃取倍增等，在重复时可能产生不可预知的人为误差和变化。 RNA样品易于被少量的RNase分解。而RNase可能由实验者的皮肤或有黏液的组织产生。蛋白质也因环境因素不同程度的改变本性。null为了要减少这些种人为的误差，芯片上的整个制备步骤的自动化引发人们极大的兴趣，这种方法称作芯片实验室。 芯片实验室的成功结果将会得带一个测试芯片去任何地点测试生物学的样品，例如血液，并进一步实时实地得到想要的数据成为可能。null芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应以及检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。 现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。null6.5 小分子芯片 如果是小分子芯片而不是蛋白质芯片，那将会是一个非常诱人的方法，如果药物候选分子可与蛋白质成键，那就可以将其置于高密度芯片之上。 尤其筛选大量来自文库的化合物的时候没，我们现在的筛选需要耗费太多时间和精力。 Schreiber的小组发明了一项技术，可以合成小分子并且使用分子的酸性基团将它们点到底部活化的芯片上。但是，仍然缺少实证层面上的论文。尽管基础技术的发明层出不穷，一个具有实际价值的芯片仍然等待人们去开发。nullnull2001年，Schultz小组通过联合使用PNA(肽核酸)标记的小分子和DNA地址芯片技术而发展了新的小分子芯片(Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 2001, 40, 3152-3155)。 PNA是编码标记，带有标记的文库化合物直接与芯片上对应的DNA序列相关联。 结果：PNA和DNA形成双螺旋，小分子文库化合物露在双链的顶端。通过对芯片上特定地址解码来识别化合物。 实验使用的例子是 cyctein蛋白酶抑制剂，证明了PNA标记不干扰抑制剂的活性。然而，这些以PNA标记的分子将不能穿透细胞膜，这对于以细胞为基础的筛选可能不太合适。null许多公司宣称他们具有小分子芯片技术， 但是他们大部份是为高通量筛选准备的小圆片或薄膜排列。 一家德国的新诞生的公司，Graffinity，是真的用共价键将小分子附到芯片表面，并以蛋白质键筛选。他们合成含硫末端的小分子然后利用S与Au间的强键将这些分子连到金的表面。利用Biacore Inc.的SPR(表面等离子体共振)技术测量蛋白质成键。 当他们不需要用萤光探头标记蛋白质时由于硫易反应的内在本质，分子不适合作功能化验。第七节 生物芯片的应用第七节 生物芯片的应用7.1 基因表达分析 7.2 基因型、基因突变和多态性分析 7.3 疾病的诊断与治疗 7.4 药物研究中的应用 7.5 基因芯片中医学领域中的应用 7.6 其它应用7.1 基因表达分析7.1 基因表达分析7.1.1 分析基因表达时空特征 7.1.2 基因差异表达检测 7.1.3 发现新基因 7.1.4 大规模DNA测序null7.1 基因表达分析 基因芯片具有高度的敏感性和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同，基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中，包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针，这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。这种成对的探针可以将非特异性杂交和背景讯号减小到最低的水平，由此我们就可以确定那些低强度的mRNA。null7.1.1 分析基因表达时空特征 美国Stanford大学的V.R.Iyer等人，对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。首先，他们用成纤维细胞中的8600个基因片断制成基因芯片的探针阵列，通过与mRNA反转录形成的cDNA的杂交反应，可以判断出该基因的活性。 在试验中，成纤维细胞被置于无营养的环境中，使绝大部分基因的活性关闭，两天后，加入10%的血清，24小时内，分6个不同的时间点，观察基因的活化情况。null试验结果表明，在所有被监测的基因中，约有500个基因最为活跃，而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些转录调控基因。在活化的基因中，有28个基因共同作用，控制细胞的增殖；8个与免疫反应的激活有关；19个与血管重建有关；另有许多基因，与血管新生密切相关。 通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱，有助于人类认识生命活动过程和特征。null7.1.2 基因差异表达检测 对差异表达的研究，可以推断基因与基因的相互关系，细胞分化中基因“开启”或“关闭”的机制；揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。 目前差异研究方法主要有表达序列标签（ESTs）测序、差减克隆（subtractive cloning ）、差异显示（differential display）、基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。 cDNA微阵列杂交可监测大量mRNA的转录，快速地检测出极其微量的mRNA，同时监测成千上万的基因，是研究基因功能的重要手段之一。null美国Stanford大学的David Botstein利用cDNA微阵列芯片，对乳腺癌细胞的基因表达进行了分析，发现其基因表达水平明显低于正常细胞。 利用基因芯片对表达进行分析，在一次试验中可以获取相当于在60余万次传统的Northern杂交中所获得的关于基因表达的信息。 通过这种实验方法，可以建立一种全新的肿瘤分类学方法，即依据每个肿瘤细胞中的基因表达情况对肿瘤细胞进行分类。null7.1.3 发现新基因 定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。 如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎（RA）和炎症性肠病（IBD）的基因表达研究中，由RA或IBD组织制备探针，用Cy3和Cy5荧光素标记，然后与靶cDNA微阵列杂交，可检测出炎症疾病诱导的基因如TNF-α、IL或粒细胞集落刺激因子，同时发现一些以前未发现的基因如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子。null在缺乏任何序列信息的条件下，微阵列可用于基因发现和基因表达检测。 目前，大量人类ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源，数据库中400,000个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。null7.1.4 大规模DNA测序 芯片技术中杂交测序（sequencing by hybridization, SBH）技术及邻堆杂交（contiguous stacking hybridization, CSH）技术即是一种新的高效快速测序方法。 用含65 536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术，可测定200 bp长DNA序列， 采用67 108 864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。nullnullSBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。 CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端，CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行较长的DNA测序。 计算机模拟论证了8聚寡核苷酸微阵列与5聚寡核苷酸邻堆杂交，相当于13聚寡核苷酸微阵列的作用，可测定数千个核苷酸长的DNA序列。7.2 基因型、基因突变和多态性分析7.2 基因型、基因突变和多态性分析在同一物种不同种群和个体之间，有着多种不同的基因型，而这种不同，往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。 通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系。但是，由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的，因此分析起来就十分困难，然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题，利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性，我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。null随着人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 的逐步发展，研究人员分析出了越来越多的基因序列。下一步，就是要分析这些基因的多态性与生物功能和疾病的关系，而这需要对大量个体进行分析。通过基因芯片SNP（单核苷酸多态性）定位试验，可以确定基因多态性和疾病的关系，同时也可确定致病的机制和病人对治疗的反应等。同样，对于许多与人类疾病密切相关的致病微生物，也可对其进行基因型和多态性分析。7.3 疾病的诊断与治疗7.3 疾病的诊断与治疗7.3.1 遗传病相关基因的定位 7.3.2 肿瘤诊断 7.3.3 感染性疾病的诊断 7.3.4 耐药菌株和药敏检测null7.3 疾病的诊断与治疗 人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，因此它在疾病的分子诊断中的优势是不言而喻的，就临床一种新的、强有力的分子工具。 基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。null7.3.1 遗传病相关基因的定位 我国有4 000万育龄妇女，每年有2 000万新生儿，准确检测遗传病基因是优生优育的技术保障。 DNA芯片技术已成为基因定位研究的高效工具。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，变异与多态性分析将越来越重要。 HGP使许多遗传疾病基因得以定位，配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次筛查多种遗传病，既经济快速又敏感可靠。null7.3.2 肿瘤诊断 已用基因芯片检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原癌基因和抑癌基因的发现