RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0

TaKaRa Code：DRR019A RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （100 量） 次 说明书 宝生物工程(大连)有限公司 目 录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●RNA PCR 原理 2 ●试剂盒特点 3 ●RNA 样品制备 4 ●使用注意 4 ●引物选择 5 ●实验操作 5 ●Q&A 9 ●参考文献 9 ●制品说明 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增 DNA 的简单而有效的方法。虽 然原理上 PCR 法是扩增 DNA，RNA 不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把 RNA 反转录成 cDNA 后，PCR 法便可应用于 RNA 的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于 RNA 的构造解析、cDNA 的克隆 及 RNA 水平上的表达解析等多种领域。 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0 是使用 AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将 RNA 合 成 cDNA，然后在同一反应管中使用 Hot Start PCR 用 TaKaRa Ex Taq HS DNA 聚合酶扩增此 cDNA 的 RT-PCR 试剂盒。本试剂盒含有从 RNA 到 cDNA，然后使用 PCR 法扩增此 cDNA 所需的全部试剂。 本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成 效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。 ●制品内容（100 次量） 1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 50 μl （Avian Myeloblastosis Virus 来源） 2. RNase Inhibitor（40 U/μl） 25 μl 3. Random 9 mers（50 pmol/μl） 50 μl 4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 50 μl 5. RNase Free dH2O 1 ml 6. TaKaRa Ex Taq® HS（5 U/μl） 40 μl 7. M13 Primer M4（20 pmol/μl） 50 μl 8. 10×RT Buffer 1 ml [100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl] 9. 5×PCR Buffer 1 ml 10. dNTP Mixture（各 10 mM） 150 μl 11. MgCl2（25 mM） 1 ml 12. Control R-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA 下游引物） 13. Control F-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA 上游引物） 14. Positive Control RNA（2×105 copies/μl） 25 μl （Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid） 【各种引物序列】 引物名称 各引物序列 Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ Oligo dT-Adaptor Primer 包含 dT 区域及 M13 Primer M4 序列。 Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ -1- 【Positive Control RNA】 本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3 质粒（质粒中的SP6 启动子下游插入长约 1.4 kbp的 pBR322 来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经体外 转录而得到的。Control RNA（约 1.4 kb）是带有 30 个A碱基的具有Poly(A)+ 尾的RNA。当把 Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。Control RNA简图见图 1。 图 1. Positive Control RNA：使用各种引物所能扩增的 DNA 片段 ●保 存： -20℃ ●RNA PCR 原理 本试剂盒使用 AMV 由来的反转录酶由 RNA 合成 cDNA，并可在同一反应管中使用 TaKaRa Ex Taq HS 扩增此 cDNA。Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer 或特异性下游引物等均可作为反转录引物 用于 cDNA 合成。Oligo dT-Adaptor Primer 同时适用于 3′-RACE 实验。 图 2. RNA PCR 原理 -2- mRNA 使用 AMV 反转录酶，配制反转录反应液合成 cDNA 的第一条链。 按以下条件进行反转录反应： （ 30℃ 10 min.）* 42℃～60℃ 15～30 min. 1 Cycle 95℃ 5 min. 5℃ 5 min. * 使用 Random 9 mers 进行反转录时，首先在 30℃下保温 10 min，使 Random 9 mers 延伸达到足够长度，以便在 42℃～55℃退火时与模板 RNA 充分结合。 在反转录反应管中加入TaKaRa Ex Taq® HS和其它PCR反应用试剂合成cDNA 的第二条链，并进一步进行 PCR 扩增。按以下条件进行 PCR 反应： 94℃ 0.5 min. 55℃～65℃ 0.5 min. 25～30 Cycles 72℃ 1 min/kbp PCR 扩增产物 通过琼脂糖凝胶电泳 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 PCR 扩增产物 ●试剂盒特点 RNA 模板 适用于所有 RNA 扩增片段大小 5 kbp 以下 反转录酶 AMV 由来的反转录酶（反转录反应温度在 42℃～60℃） DNA聚合酶 TaKaRa Ex Taq® HS RNase Inhibitor 必须使用（Kit 中含有） 合成 cDNA 第一条 Random 9 mers 链的引物 Oligo dT-Adaptor Primer 可供选择 特异性下游 PCR Primer 3′-RACE 法 RT 反应时使用 Oligo dT-Adaptor Primer，PCR 反应时下游引物 使用 M13 Primer M4 操作 在同一反应管中进行（反转录酶在进行 PCR 反应前须进行高温失活） -3- ●RNA 样品制备 本试剂盒是把 RNA 合成 cDNA，然后再对此 cDNA 进行扩增的试剂盒。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成 量，而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因 此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话 等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。 【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1） 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。 （2） 然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。 【试剂配制】 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60 min.）或用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后 的玻璃容器盛装（也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理 后进行高温高压灭菌。 RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 【制备方法】 使用简单的 RNA 纯化方法即可获得满足于 RT-PCR 反应的 RNA（只需少量的 RNA 便可进行 RT-PCR 反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用 GTC 法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度 RNA。 使用Catrimox-14® RNA Isolation Kit Ver.2.11（TaKaRa Code DWA005）可从血液中快速提取 高纯度的Total RNA。 使用本试剂盒进行 RT-PCR 反应时，每次反应所需的最适 Total RNA 量约为 500 ng。 ●使用注意 以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1） 当同时需要进行数次反转录反应或 PCR 反应时，应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix；其中包括 RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2 等），然后再分装到每个反应管中。这样，可 使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验 之间产生的误差。 2） 使用Reverse Transcriptase（AMV）、RNase Inhibitor、TaKaRa Ex Taq® HS酶等酶类时，应轻轻 混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有 50%的甘油，粘度 高，分取时应慢慢吸取。 3） 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。 4） 为了防止 Positive Control RNA 分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～-80℃。 5） 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。 6） 最佳的 PCR 条件，因 PCR 扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下 Control 反应，以确定最佳的 PCR 条件。 -4- ●引物选择 用于反转录的引物可视实验具体情况选择 Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer 或特异性下游引 物。对于不具有 Hairpin 构造的短链 mRNA，3 种引物中的任何一种都可以使用，但一般应按以下方法进 行选择。 Random 9 mers 适用于长的或具有 Hairpin 构造的 RNA。包括 rRNA、mRNA、tRNA 等在内的所有 RNA 的反转录反应都可使用本引物。 用 Random 9 mers 合成的 cDNA 进行 PCR 反应时，必须使用特异 性引物。 Oligo dT-Adaptor 适用于具有Poly(A)+ Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生 Primer 物的 rRNA 及 tRNA 以及某些种类的真核生物的 mRNA 不具有 Poly (A)+ Tail）。本Primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后，可用 M13 Primer M4 进行 3′-RACE实验。 特异性下游 PCR Primer 因其必须与模板序列互补，所以只适用于 Target 序列已知的情况。 （PCR 时的下游引物） ●实验操作 1.使用 Positive Control RNA 时的 RT-PCR 实验例 ① 合成 cDNA 的引物可结合实际情况从 Oligo dT-Adaptor Primer、Random 9 mers 或 Control R-1 Primer 中任选一种。 按下列组成配制反转录反应液。 MgCl2 2 μl 10×RT Buffer 1 μl RNase Free dH2O 3.75 μl dNTP Mixture（各 10 mM） 1 μl RNase Inhibitor 0.25 μl AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl Random 9 mers 或 Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μl 或 Control R-1 Primer Positive Control RNA 1 μl Total 10 μl/Sample ② 按以下条件进行反转录反应。 30℃ 10 min. 50℃ 30 min. 95℃ 5 min. 5℃ 5 min. 1 Cycle A．反转录反应 -5- B．PCR 反应 ① 按下列组成配制 PCR 反应液。 5×PCR Buffer 10 μl 灭菌蒸馏水 28.75 μl TaKaRa Ex Taq® HS 0.25 μl Control F-1 Primer 0.5 μl Control R-1 Primer 0.5 μl 或 M13 Primer M4（反转录使用 Oligo dT-Adaptor Primer 时） Total 40 μl/Sample ② 把 B-①的反应液加入到 A-②的反转录反应结束后的 PCR 反应管中，轻轻混匀。 ③ 按以下条件进行 PCR 反应。 94℃ 30 sec. 60℃ 30 sec. 30 Cycles 72℃ 1 min. ④ 反应结束后，取 PCR 反应液（5～10 μl）进行琼脂糖凝胶电泳，确认 PCR 反应产物。 使用 Control RNA 时扩增的 DNA 片段大小 反转录反应引物 PCR 引物 扩增片段 Oligo dT-Adaptor Primer F-1/M13 Primer M4 或 F-1/R-1 约 1.2 kbp 462 bp Random 9 mers F-1/R-1 462 bp R-1 Primer F-1/R-1 462 bp 2. 使用一般 RNA 样品时的 RT-PCR 实验例 ① 合成 cDNA 的引物可结合实际情况从 Oligo dT-Adaptor Primer，Random 9 mers 或特异性下 游引物中任选一种。 按下列组成配制反转录反应液。 MgCl2 2 μl 10×RT Buffer 1 μl RNase Free dH2O 3.75 μl dNTP Mixture（各 10 mM） 1 μl RNase Inhibitor 0.25 μl AMV Reverse Transcriptase*1 0.5 μl Random 9 mers 或 Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μl 或特异性下游引物 实验样品 RNA（≤500 ng total RNA） 1 μl Total 10 μl/Sample A．反转录反应 -6- ② 按以下条件进行反转录反应。 （30℃ 10 min.）*2 42℃～60℃*3 15～30 min. 1 Cycle 95℃ 5 min.*1 5℃ 5 min. *1 Reverse Transcriptase 能与 cDNA 结合，直接进行 PCR 反应有阻害作用。因此，PCR 反应前， 必须进行 95℃、5 分钟加热使 Reverse Transcriptase 失活。反应液中 Reverse Transcriptase 的浓度增加会使失活变得困难，在使用长链 RNA 进行反转录反应时，不要增加 Reverse Transcriptase 的量，可将延伸反应时间延长。 *2 使用 Random 9 mers 时，先进行 30℃保温 10 min.，使 Random 9 mers 达到足够长度，以便 在 42℃～60℃退火时与模板 RNA 充分结合。 *3 AMV 由来的 Reverse Transcriptase，即使在 60℃下也能进行反转录反应。但在反转录长链 RNA(＞2 kb)时，建议在 42℃左右进行。 ① 按下列组成配制 PCR 反应液。 5×PCR Buffer 10 μl 灭菌蒸馏水 28.75 μl TaKaRa Ex Taq® HS 0.25 μl 上游特异性 PCR 引物 0.5 μl 下游特异性 PCR 引物*4 0.5 μl 或 M13 Primer M4（反转录使用 Oligo dT-Adaptor Primer 时） Total 40 μl/Sample *4 反转录反应时如使用了特异性下游 PCR 引物，可用 0.5 μl dH2O 代替下游 PCR 引物。 ② 把 B-①的反应液加入到 A-②的反转录反应结束后的 PCR 反应管中，轻轻混匀。 ③ 按以下条件进行 PCR 反应*5。 94℃ 30 sec. 55℃～65℃ 30 sec. 25～35 Cycles 72℃ 1 min/kbp B．PCR 反应 *5 PCR条件设定 ■退火温度 可根据实际样品情况调整退火温度，通常可以在 55℃～65℃范围内进行反应条件研讨。有时可以 在更广范围内（45℃～65℃）进行条件研讨。 ■延伸时间 延伸时间因目的序列长度的不同而不同，通常TaKaRa Ex Taq® HS按 72℃ 1 kbp/min设定延伸 时间。 ■循环次数 cDNA 量较少时，循环次数可增加为 40～50 次。 ④ 反应结束后，取 PCR 反应液（5～10 μl）进行琼脂糖凝胶电泳，确认 PCR 反应产物。如果此 PCR 产物需用于以后实验，须将 PCR 产物冷冻保存。 -7- 3.3′-RACE 法实验例 ▲ Sample RNA： Human HL60 Total RNA ▲ Target cDNA： Transferrin receptor（TFR） ▲ 扩增 DNA 片段大小： 522 bp 图 3. 对 HL60 全 RNA 使用 3′-RACE 法进行 RT-PCR 反应图解 ① 按下列组成配制反转录反应液。 A．反转录反应 MgCl2 2 μl 10×RT Buffer 1 μl RNase Free dH2O 3.75 μl dNTP Mixture（各 10 mM） 1 μl RNase Inhibitor 0.25 μl Reverse Transcriptase 0.5 μl Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μl HL60 Total RNA（500 ng/μl） 1 μl T tal 10 o μl/Sample ② 按以下条件进行反转录反应。 30℃ 10 min. 50℃ 30 min. 1 Cycle 95℃ 5 min. 5℃ 5 min. ① 按以下组成配制 PCR 反应液。 5×PCR Buffer 10 μl B．PCR 反应 灭菌蒸馏水 28.75 μl TaKaRa Ex Taq® HS 0.25 μl M13 Primer M4 0.5 μl TFR-1 Primer 0.5 μl Total 40 μl/Sample -8- ② 将 B-①配制的 40 μl PCR 反应液加入至 A-②的反转录反应管中。 ③ 按以下条件进行 PCR 反应。 94℃ 30 sec. 55℃ 30 sec. 30 Cycles 72℃ 30 sec. ④ 反应结束后，取 5 μl 的 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认 PCR 反应产物。目的片段的大小为 522 bp。 ●Q&A Q1. RT-PCR 反应后，无 PCR 产物，怎么办？ A1. 首先应严格按说明书要求，进行 Control 反应。如 Control 反应情况正常，那说明实验操作方面没 有问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。应从您提取的 RNA 样品的纯度和添加量、引物的设计情况、参考文献的可信度以及 RT-PCR 条件的设定等方面加以考虑；如 Control 反应不正常，应从实验操作的准确性、实验器具处理、PCR 仪的条件设定等方面加以考虑。 ●参考文献 1） Kawasaki, E. S. and Wang, A. M. (1989) PCR Technology (Erlich, H. A. ed.), Stochton Press, 89-97. 2） Lynas, C., Cook, S. D., Laycoch, K. A., Bradfield, J. W. B. and Maitland, N. J. (1989) J. Pathology, 157, 285-289. 3） Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002. -9- 技术咨询热线： 0411-87641685，87641686 8008909508，4006518769 宝生物工程（大连）有限公司 TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. 辽宁省大连经济技术开发区东北二街 19 号（116600） No.19 Dongbei 2nd Street, Development Zone, Dalian, China 电 话： 0411-87641681 87641683 传 真： 0411-87619946 87621675 E.mail： service@takara.com.cn 网 址： http://www.takara.com.cn V2010.03 本制品仅供研究用。请勿用于人体及动物的医疗、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂 内 容 页 码 【使用器具】 Oligo dT-Adaptor Primer