黄芪注射液增强树突细胞的抗肺癌作用

第11卷第1期 2005年2月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01．11．No．1 Feb．，2005 黄芪注射液增强树突细胞的抗肺癌作用 董晓辉，董竞成 (复旦大学附属华山医院中西医结合肺和特应性疾病研究室，上海200040) 摘要：目的：研究黄芪注射液联合MHCI类限制性肿瘤抗原多肽Mutl致敏的树突细胞(DCs)对肺癌小鼠的治疗作用及其 免疫学原理。方法：制备小鼠骨髓来源的树突细胞，用转移性Lewis肺癌特异性多肽Mutl预激DCs并联合黄芪注射液治疗肺 癌小鼠，通过FACS分析其脾细胞内T淋巴细胞比例的变化，用Elisa法检测荷瘤小鼠血清内IL-2、IL4浓度的变化，间接提示 Thl／Th2比例的变化。同时免疫正常小鼠，观察宿主对随后肿瘤细胞攻击的保护作用。结果：肿瘤抗原多肽致敏的DCs与黄芪 注射液联合治疗后，比单用DCs更有效的治疗转移性肺癌，小鼠脾细胞内CD4+T和CD8+T细胞明显比例升高，联合治疗组的 IL-2／IL-4比例也明显升高。在观察时间内经黄芪注射液和DCs联合免疫的小鼠成瘤率低于对照组和单用DCs组。结论：以肿 瘤抗原多肽致敏的DCs与黄芪注射液联合治疗能更有效的促进荷瘤宿主的免疫应答，具有显著的体内抑制肺癌转移的效果。 对正常动物免疫保护作用更加明显。 关键词：树突细胞；肺癌；黄芪注射液 中图分类号：R285．5文献标识码：A 文章编号：1005．9903(2005)01．0025．04 EffectsofDendritic-cellsCombinedwithAstragalusonLewisLungCancer DONGXiao-hui，DONGJing-cheng (HuashanHospitalofFudanUniversity，Shanghai200040，China) Abstract：Objective：Toinvetigatetheantitumoreffectsandmechanismsoftumorantigenpeptide—pulseddendritic cellscombinedwithAstragalus．Methods：Hi【ghpurityDCswereobtainedfrom9-daycultureofmurinebonemarrowcells． MutlisaMHCclassI-restrictedtumorantigenpeptideofI．ewislungcancer．DCswereincubatedwithMutl．thenvaccines wereestablished．Lungcancerwereestablishedonthemice．Thetumor-bearingmiceweretreatedandthesurvivalperiod ofthemiceWasobserved．TreatmentgroupsweredividedintoPBS，DC．Mutl，DC．MutlwithAstragalus(DC．Mutl+AG)． ThephenotypesofsplenocytesofthesetreatedmiceweredetectedbyFACS．Interleukin．2andinterleukin．4intheserum weremeasuredbycytokine-specificELISA．Normalmicedevelopedapotentimmuneprotectionagainsttheattackfrom tumorcells．既etreatmentgroupsweresameasthepreviousgroups．Results：’IheDC-Mutl+AGgroupdemonstrated antitumoreffectswiththeregressionmajorityoftumors．’nleproportionoftheCD4+TandCD8+TcellsinDC—Mutl+AG groupincreasedcomparedwiththatofDC—Mutlgroup(P<0．05)．’IheIL_2levelofDC-Mutl+AGgroupWashigher thanthoseofDC—Mutlgroup．卟eIL·4levelofDC—Mutl+AGgroupWaslowerthanthatofthePBSgroup．Upon undergoingattackfromIjLCcells，DC-Mutl+AGgrouphadnoformationoftumors．Incontrast，4ofallthemice(6) treatedwithDC．Mutldevelopedtumors．Conclusion：DC—Mutl+AGcouldexeflantitumoreffectsinthemiceand significantlyinhibittumormetastasis，whichdemonstrateda specificimmuneprotection． Key word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 s：Dendriticcells；Lewislungcancer；Astragalus 树突细胞(dendriticcells，DCs)是目前已知的功 能最强的抗原提呈细胞，运用肿瘤抗原多肽致敏的 DCs治疗肿瘤是树突状细胞研究领域的热门课 题m“。有文献m1应用Mutl致敏的Dcs治疗转移 收稿13期：2004．03．23 通讯作者：董竞成，Tel：(021)62494664， E-mall：jcdon92004@126．COlll 性I_ewis肺癌取得了显著疗效，其机理在于有效诱导 了荷瘤小鼠产生了肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞 (CTL)。若能进一步增强DCs对CTL诱导作用将有 可能更有效的提高治疗效果，同时考虑到黄芪注射 液(Astragalus，AG)能有效的逆转Thl／Th2比例¨1，因 此我们设想，在应用肿瘤抗原多肽致敏的DCs治疗 肿瘤的同时，联合运用AG将有可能更有效的协同 ·25· 万方数据 第11卷第1期 2005年2月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalNedicalFormulae V01．11．No．1 Feb．，2005 诱导荷瘤宿主产生肿瘤抗原特异性的CTL，从而取 得更佳的治疗效果。 1材料与方法 1．1主要试剂H一2K6限制性的小鼠Lewis肺癌细 胞株的Mutl抗原8肽(FV,QNI"AQI,)，由西安美联公 司合成纯化，纯度>95％；重组GM—CSF和重组小鼠 I【厂4购自美国Peprotech公司；荧光标记的抗CD86抗 体、抗MHC．1类分子(H．2K“)、抗MHC—II类分子(I— A6)购自美国CALTAG公司；荧光标记的抗CD3+、抗 CD4+和抗CD8+购自美国CALTAG公司。小鼠IL． 2、IL．4ELISA试剂盒购自奥地利BenderMedSystems 公司。黄芪注射液：正大青春宝药业有限公司， 209／10raL，批号：0306012。 1．2动物和细胞株C57BL／6小鼠(H．2K6)，雌性，6 ～8周龄，购自中科院上海实验动物中心。Lewis肺 癌细胞株(LLC)：中科院上海细胞所提供。 1．3小鼠骨髓来源DCs的培养和肿瘤抗原多肽的 Mut．1致敏获取C57BL／6小鼠股骨骨髓细胞(2x 106／mL)，用含10％FCS、重组小鼠GM．CSF20ng／mL 和重组小鼠IL．45ng／mL的RPMI1640液培养基在 24孑L板中培养。培养至第3天，吸弃悬浮细胞，补足 新鲜培养基；培养至第7天，收集悬浮细胞，置于另 一培养板(1x106／mL)继续培养2～3天，收集悬浮 细胞即为DCs。将培养至第七天的DCs与GM—CSF、 IL_4与多肽抗原Mut．1(0．1mg／mL)于37℃共同孵育 24h，收集细胞并离心洗涤3次，用生理盐水调整至1 x106／mL(DC—lutl)。 1．4 自发性转移性肺癌模型的建立 将5～6周龄 的C57BL／6小鼠足垫注射Lewis肺癌细胞5x105 (50／zL)。1／只。当Lewis肺癌细胞接种后第13天，荷 瘤小鼠足垫部肿瘤直径长至8～lOmin时，于0．67％ 戊巴比妥钠67mg／kg麻醉下2％的碘酒消毒患肢，于 膝关节处进行截肢术。至截肢20天后称取小鼠肺 重量，观察、计数肺部表面转移结节数，以确定转移 模型成功与否。 1．5 Mutl致敏的DCs与AG联合治疗肺癌将自 发性肺癌小鼠随机分为下面各治疗小组，每组15 只。①PBS对照治疗组(PBS)，即截肢后第2天至第 15天皮下注射PBS100／IL。②DC—Mutl治疗组(Dc— Mutl)，即截肢后第2天肩部皮下注射DC．Mutl5× 105／lOOt_￡L，第8天、15天时再分别注射DC．Mutl5x 105／lOOtiL。③DC．1utl联合AG治疗组(DC．Mutl+ AG)。即截肢后第2天到第15天每天腹腔注射AG · 26· 509／kg，同时在截肢后第2、8、15天共三次肩部皮下 注射DC—lutl5x105／100／生L。在截肢后第20天时， 各组杀死小鼠5只，观察这些小鼠的肺重量和肺表 面结节数；另外观察各组剩余10只小鼠的生存期和 存活率。 1．6经治疗荷瘤小鼠脾细胞表型的分析上述荷 瘤小鼠截肢后，于免疫治疗的第20天取各组小鼠脾 脏，制备单细胞悬液，去除红细胞后，用大鼠抗小鼠 直接荧光标记的抗CD3+、CD4+和CD8+单克隆抗体 标记30rain后经FACS分析各组脾细胞内T淋巴细 胞的比例。 1．7诱导小鼠抗肿瘤免疫保护实验取18只雌性 6～8周龄C57BL／6i正常小鼠，随机分为3组，每组6 只，分组情况同治疗组。每组免疫途径和剂量同前， 只是免疫时间是原来的2倍即30天。第31天时小 鼠足垫注射Lewis肺癌细胞5×10s(50raL)。1／只，观 察瘤体的生长情况。 1．8小鼠血清内IL．2和IL．4浓度的测定采用 ELISA方法。以 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品的浓度为横坐标，以相应的 吸光度值为纵坐标，先做标准曲线。然后样本吸光 值由标准曲线查得相应浓度值(pg)。 1．9统计学处理采用单因素方差分析，Q检验行 两组间转移参数的比较。以时序检验比较截肢后3 个月各组间生存期及存活率的组间差异，P<0．05 具有统计学差异。 2结果 2．1 lutl致敏的DCs联合AG对荷瘤小鼠的治疗 效果截肢20d后处死各组小鼠，取肺称重，结果显 示，DC．Mutl+AG联合治疗组肺重量平均为284mg， 而与其它组之间存在显著性差异(P<0．01)。DC． Miltl组治疗效果强于PBS组(P<0．05)。这些结果 表明，中药黄芪对DC疫苗治疗肺癌的增强作用明 显。(详见表1) 表1治疗后荷瘸小鼠肺重量和肺表面转移结节数(；±s，n=5) 治疗组与PBS组相比1’P<0．05；治疗组与PBS组和DC—Mutl组 相比2’P 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 化疗治疗晚期卵巢上皮癌的临床研究[期刊论文]-中国医药导刊 2009(4) 3.陈国辉.黄文凤 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