响应面分析法优化枸杞多糖提取工艺条件

收稿日期 : 2007206225; 　修订日期 : 2007211220 作者简介 :刘军海 (19632) ,男 (汉族 ) ,山东莘县人 ,现任聊城大学化学化 工学院教授 ,博士学位 ,主要从事植物活性成分分离纯化技术工作. 响应面分析法优化枸杞多糖提取工艺条件 刘军海 1 , 任惠兰 1 , 李风风 2 , 李广录 1 (1. 聊城大学化学化工学院 ,山东 聊城 　252059; 　2. 浙江大学理学院 ,浙江 杭州 　310027) 摘要 :目的 利用响应面分析法 (Response Surface Methodology)对枸杞多糖的提取工艺进行优化。方法 在单因素实验基 础上选取实验因素与水平 ,根据中心组合 (Box - Benhnken)实验设计原理采用 3因素水平的响应面分析法 ,依据回归分 析确定各工艺条件的影响因子 ,以多糖提取率为响应值作响应面和等高线。结果 在分析各个因素的显著性和交互作用 后 ,得出枸杞多糖水浸提的最佳工艺条件为 :料液比 1∶32;浸提温度 84℃;浸提时间 2. 3h;浸提 1次。结论 在最佳工艺 条件下 ,枸杞多糖的实际提取率可达 11. 10%。 关键词 :枸杞 ; 　枸杞多糖 ; 　提取 ; 　响应面分析 中图分类号 : R284. 2　　文献标识码 : A　　文章编号 : 100820805 (2008) 0420935202 O ptim iza tion of the Extraction Technology of L yc ium ba rba rum Polysacchar ide by Re2 spon se Surface M ethodology L IU J un2hai1 , REN H ui2lan1 ,L I Feng2feng2 , L I Guang2lu1 ( 1. College of Chem istry and Chem ica l Eng ineering, L iaocheng U niversity, L iaocheng 252059, Ch ina; 2. D epart2 m en t of Chem istry of College of S cience, Zhejiang U n iversity, 310027, Zhejiang, China) Abstract:O bjective To op tim ize the extraction technology of L ycium barbarum polysaccharides by response surface method2 oloy. M ethods Experiment factors and levels were firstly selected by one factor tests. On the basis of the p revious results and ac2 cording to the central composite experimental design p rincip les, the method of Response Surface Method with 3 factors and 3 levels was adop ted. Then the factors influencing the technological parameters were determ ined by means of regression analysis. Response surface and contour were finally graphed with the extraction rate as the response value. Results The op timum conditions of Lycium barbarum polysaccharides extraction were as follows: the ratio of material to solvent of 1∶32, extraction temperature of 84℃ and extraction time of 2. 3 h, one time extraction. Conclusion The yield of Lycium barbarum polysaccharides is 11. 10% under the op2 timum conditions. Key words:Lycium barbarum ; 　Lycium barbarum polysaccharides ; 　Extraction; 　Response surface methodology 　　枸杞是多年生灌木 ,花紫、果红、枝繁叶茂 ,具有滋补肝肾、益 精明目的功效 [ 1 ]。枸杞子是我国传统中药 ,具有很高的药食两 用价值。近年来 ,枸杞作为一种新兴的保健型食用植物在我国宁 夏、新疆等地区进行了大面积种植 ,种植面积逐年增加。众多的 研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 ,枸杞多糖具有保肝、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗衰老等 多种生理功效 [ 2～7 ]。因此 ,提取枸杞多糖对开发和利用枸杞资源 具有重要意义。 响应面分析 (Response Surface Methodology)法系采用多元二 次回归方法作为函数估计的工具 ,将多因子实验中因素与指标的 相互关系用多项式近似拟合 ,依此可对函数的响应面和等高线进 行分析 ,研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系。 它与过去广为使用的“正交实验设计法 ”不同 ,具有实验周期短 , 求得的回归方程精度高 ,能研究几种因素间交互作用等优点 [ 8 ]。 笔者在单因素实验的基础上 ,利用响应面分析法对枸杞多糖提取 工艺条件进行了优化。 1　器材与方法 1. 1　材料 枸杞子 (宁夏产 ,购于聊城 )、优质工业酒精、苯酚 (AR)、浓硫酸 (AR)、蔗糖 (AR)。 1. 2　仪器 AR - 1104电子天平 (奥克斯国际贸易上海有限公 司 ) ; DKB - 501A型超级恒温槽 (上海精宏试验设备有限公司 ) ; SHB - 11循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司 ) ; TU - 1810紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司 )。 1. 3　方法 1. 3. 1　提取方法 精确称取枸杞 5. 0 g,置于 250 m l圆底烧瓶中 , 加入 90%乙醇 80 m l加热回流 1 h,残渣用 10 m l 90%乙醇洗涤两 次 ,然后改用蒸馏水回流一定时间 ,残渣用 10 m l蒸馏水洗涤两 次 ,滤液于 250 m l容量瓶中定容 ,测得多糖含量。 1. 3. 2 　枸杞多糖含量及提取率测定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的绘制 :精密称取 l05℃下干燥至恒重的葡萄糖 34. 0m g,置 100 m l容量瓶中 ,加水溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,配 得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6 m l ,分别置于 10 m l容量瓶中 ,分别加入蒸馏水 2. 0 m l,然后分别再加人 1. 0 m l 5%苯酚溶液 ,摇匀 ,迅速加入浓硫酸 5. 0 m l,摇匀后置 40℃水浴中加热 15 m in,取出置冷水中冷却 10 m in,同时用 2. 0 m l蒸馏水做空白 ,用分光光度计在波长 480 nm 处测定吸光度 ,得标准曲线方程 : C = 16. 077 2A + 1. 075 6,相关 系数 r = 0. 999 5。 多糖含量与提取率的测定 :采用苯酚 - 硫酸法 [ 9, 10 ] ,精密吸 取样品溶液 1 m l置于 25 m l容量瓶中 ,并加水稀释定容。然后精 密量取 1 m l,置于 10 m l容量瓶中 ,加水 2 m l, 然后再加入 1. 0m l 5%的苯酚溶液 ,摇匀 ,迅速加入浓硫酸 5. 0 m l,摇匀后置 40℃水 浴中加热 15 m in,取出置冷水中冷却 10 m in,同时用 2. 0 m l蒸馏 水做空白 ,用分光光度计在波长 480 nm处测定吸光度。多糖提 取率用下式计算 : 多糖提取率 ( % ) = 比色液浓度 (μg/m l) ×比色液体积 (m l) ×定容体积 (250 m l) 供试样品体积 (0. 5 m l) ×实验样品质量 ( g) ×106 ×100% 2　结果 2. 1　单因素实验 枸杞中含有多种糖分 ,如单糖、低聚糖、多糖 等。由于多糖溶于水而不溶于高浓度乙醇 ,根据此原理先用 90%的乙醇回流 1 h,来除去单糖、低聚糖等对多糖提取率有影响 的物质 ,然后用蒸馏水提取多糖 ,选定 3个因素即温度、时间、料 ·539· L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2008 VOL. 19 NO. 4 时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期 液比 3个影响因素研究其对多糖提取率的影响。 2. 1. 1　浸提温度对枸杞多糖提取率的影响 固定 80 m l 90%浓 度乙醇在 80℃下回流 1 h,提取 1次 ,固定料液比为 1∶20,水浸 提时间 1 h,分别在 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100℃提取。结果见 图 1。 由图 1可知 ,随着提取温度的升高 ,多糖提取率不断增大 ,在 70℃前增加较为显著 ,以后增加不太明显 ,温度在 70, 80, 90℃的 提取率曲线较为平缓 ,同时从提取的多糖溶液可以看出 ,随着温 度的升高 ,多糖颜色加深。由此可得出 ,高温可能对多糖的结构 与活性有一定的影响 ,超过 100℃多糖容易分解产生单糖而溶解 在浓乙醇中进而影响多糖的提取率 ,所以选择 70～90℃作为提 取的较适宜温度。 2. 1. 2　料液比对枸杞多糖提取率的影响 固定 80 m l 90%浓度 乙醇在 80℃回流 1 h,提取 1次 ,固定水浸提温度为 80℃,料液比 分别采取 1∶10, 1∶15, 1∶20, 1∶25, 1∶30, 1∶35, 1∶40,水浸 提时间 1 h。结果见图 2。 图 1　浸提温度对多糖　　　　图 2　料液比对多糖 　　　提取率的影响　　　　　　　提取率的影响 由图 2可知 ,随着加水量的逐渐增大 ,多糖提取率几乎呈直 线上升。由于提取水量的增加 ,则提取的多糖溶解在水中的量就 越多 ,从而损失的多糖量就越少 ,相应多糖提取率就高 ,但增大到 一定程度后 ,多糖提取率几乎不变 ,再增加水量多糖的提取率反 而降低 ,所以料液比在 1∶30左右提取率较高。 2. 1. 3　浸提时间对多糖提取率的影响 固定 80 m l 90%的浓度 乙醇在 80℃回流 1 h,提取 1次 ,固定水浸提温度为 80℃,料液比 1∶20,分别选择 0. 5, 1, 2, 3, 4, 5 h提取。结果见图 3。 图 3　浸提时间对多糖提取率的影响 由图 3可知 ,随着加热时间的增加 ,多糖提取率在 2 h前增 加显著 ,以后增加较为平缓 ,增大到一定时间以后多糖提取率几 乎保持不变。可能由于加热时间过长 ,促进多糖的溶解使得提取 率增大 ,但是加热时间过长提取率无明显变化 ,考虑到经济效益 , 提取时间选择 1～3 h为宜。 2. 2　响应面分析法优化枸杞多糖提取工艺的研究 2. 2. 1　响应面实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 与实验结果 根据 Box. Benhnken的中心 组合实验设计原理 ,以及综合单因素影响多糖提取率的实验结果 分析可选取对多糖提取率有较显著影响的 3个因素即温度、时间 和料液比 ,在单因素实验的基础上设计 3因素 3水平的响应面分 析实验的方案。响应面分析因素与水平见表 1。响应面分析方 案及实验结果分析见表 2。 表 1　响应面分析因素与水平 水平 温度 X1 /℃ 时间 X2 / h 料液比 X3 / g·m l - 1 - 1 70 1 1∶25 0 80 2 1∶30 1 90 3 1∶35 表 2　响应面分析方案及实验结果分析 序号 X1 X2 X3 得率 ( % ) 1 - 1 - 1 0 9. 63 2 - 1 1 0 10. 09 3 1 - 1 0 10. 03 4 1 1 0 10. 34 5 0 - 1 - 1 9. 77 6 0 - 1 1 9. 95 7 0 1 - 1 10. 19 8 0 1 1 10. 30 9 - 1 0 - 1 9. 87 10 1 0 - 1 10. 21 11 - 1 0 1 10. 14 12 1 0 1 10. 45 13 0 0 0 10. 51 14 0 0 0 10. 55 15 0 0 0 10. 46 表 3　枸杞多糖浸提回归分析结果 方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P ( F > Fα) 显著性 X1 1 0. 211 3 0. 211 3 104. 41 0. 000 154 * * X2 1 0. 296 5 0. 296 5 146. 52 0. 000 1 * * X3 1 0. 08 0. 08 39. 54 0. 001 495 * * X1 X1 1 0. 125 8 0. 125 8 62. 17 0. 000 527 * * X1 X2 1 0. 005 6 0. 005 6 2. 78 0. 156 319 X1 X3 1 0. 000 2 0. 000 2 0. 11 0. 752 309 X2 X2 1 0. 331 4 0. 331 4 163. 78 0. 000 1 * * X1 X3 1 0. 001 2 0. 001 2 0. 61 0. 471 708 X3 X3 1 0. 088 2 0. 088 2 43. 61 0. 001 197 * * 回归 9 1. 076 8 0. 119 6 59. 13 0. 000 152 * * 误差 5 0. 010 1 0. 002 0 总和 14 1. 0870 　　* 为显著 ( P < 0. 05) , * * 为高度显著 ( P < 0. 01) 对提取温度 ,料液比 ,提取时间作如下变换 X1 = ( T - 80) / 10, X2 = ( t - 2) /1, X3 = (2 - 30) /5 ,以 3次实验所得多糖提取率 的平均值为响应值 ( Y) ,实验设计与实验结果见表 2。其中 1～ 12是析因实验 , 13～15是中心实验 ,用来估计实验误差。响应面 分析结果见图 4～6。 图 4　浸提温度与时间对多糖提取率影响的响应面与等值线 图 5　浸提温度与料液比对多糖提取率影响的响应面与等值线 图 6　浸提时间与料液比对提取率的响应面与等值线 ·639· 时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期 L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2008 VOL. 19 NO. 4　 采用 SAS RSREG程序对响应值与各因素进行回归拟合后 , 得到回归方程 : Y = 10. 506 7 + 0. 162 5X1 + 0. 192 5X2 + 0. 100 0X3 - 0. 184 6X1 X2 - 0. 037 5X2 X1 - 0. 007 5X1 X3 - 0. 299 6X2 X2 - 0. 017 5X3 X2 - 0. 154 6X3 X3 ,回归方程中各变量对指标 (响应值 ) 影响的显著性 ,由 F检验来判定 ,概率 P ( F > Fα) 的值越小 ,则 相应变量的显著程度越高。由表 3可以看出 ,各因素中一次项 , 二次项都是高度显著的 ,因此各具体实验因子对响应值的影响不 是简单的线性关系。回归方程也是高度显著的 ,相关系数 r = 1. 076 8 /1. 087 0 = 99. 1% , 说明响应值 (提取率 ) 的变化有 99. 1%来源于所选变量 ,即提取温度、提取时间和料液比。因此 , 回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系 ,可以 利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。对回归方程取一阶偏 导数等于零 ,整理可得如下三式 : 0. 162 5 - 0. 369 6X1 - 0. 003 75X2 - 0. 007 5X3 = 0 (1) 0. 192 5 + 0. 037 5X1 - 0. 599 6X2 - 0. 017 5X3 = 0 (2) 0. 100 0 - 0. 007 5X1 - 0. 017 5X2 - 0. 309 2X3 = 0 (3) 式 (1)、式 (2)、式 ( 3)联立方程组 ,解得 X1 = 0. 3994, X2 = 0. 337 4, Z = 1∶31. 69,代入前述的变换公式得到提取温度 T = 83. 99℃ ,水料比 Z = 31. 69 ,提取时间 t = 2. 29 h,即枸杞多糖提 取工艺最佳工艺条件为采用水为溶剂 ,提取最佳工艺条件为温度 83. 99℃,时间 2. 29 h,料液比 1∶31. 69。但考虑到实际情况将最 佳提取工艺条件修正为温度 84℃,时间 2. 3 h,料液比 1∶32。在 此修正条件下 ,实际测得提取率为 11. 10% ,回归模型预测提取 率理论值可达 11. 14%。实际测定值比理论预测值低 0. 3%。 3　结论 通过单因素实验和响应面分析法优化提取枸杞多糖的最佳 工艺条件为温度 84℃,时间 2. 3 h,料液比 1∶32。提取率可达 11. 10%。 参考文献 : [ 1 ]　苏宇静 ,贺海明 ,孙兆平. 中国枸杞资源及在食品工业中的应用现 状和开发前景 [ J ]. 食品科学 , 2002, 23 (8) : 292. [ 2 ]　迟国兴 ,田　刚. 枸杞多糖保肝作用的研究 [ J ]. 吉林中医药 , 1996, 2: 34. [ 3 ]　陈群力 ,孙江涛 ,马灵筱 ,等. 有关益气养阴活血复方及枸杞多糖对 糖的影响 [ J ]. 中华实用中西医杂志 , 2004, 4 (17) : 32. [ 4 ]　朱彩平 ,张声华. 枸杞多糖对高脂血症的影响 [ J ]. 营养学报 , 2005, 27 (1) : 79. [ 5 ]　董进文 ,高天顺. 中药 LBP抗癌的研究 [ J ]. 中国中医基础医学杂 志 , 1997, 3 (6) : 32. [ 6 ]　李　丽 ,王乃平. 植物多糖的药理作用研究 [ J ]. 中医药学刊 , 2004, 22 (10) : 19. [ 7 ]　倪　慧 ,卿德刚 ,凯撒·苏来曼 ,等. 枸杞基础研究进展 [ J ]. 新疆中 医药 , 2005, 23 (5) : 72. [ 8 ]　李亚娜 ,林永成 ,余志刚. 响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工 艺 [ J ]. 华南理工大学学报 (自然科学版 ) , 2004, 32 (11) : 28. [ 9 ]　邬卫东 ,张晓文. 硫酸 - 苯酚法测定枸杞多糖含量 [ J ]. 中草药 , 2003, 3: 38. [ 10 ]　郝晓宏 ,韩　琼. 水溶性多糖 3种测定方法的探讨 [ J ]. 山西职工 医学院学报 , 2003, 13 (1) : 24. 收稿日期 : 2007205221; 　修订日期 : 2007210224 作者简介 :薛　明 (19742) ,男 (汉族 ) ,江苏南京人 ,现任南京中医药大学 副主任药师 ,博士学位 ,主要从事植物多糖化学和生物活性以及中药新剂 型研究工作. 青蒿多糖的抗肿瘤作用实验研究 薛 　明 1, 2 , 田丽娟 2 (1. 南京中医药大学 ,江苏 南京 　210029; 　2. 金陵药业股份有限公司 ,江苏 南京 　210009) 摘要 :目的 研究青蒿多糖 (HQG)的抗肿瘤作用。方法 考察 HQG的急性毒性实验 ,考察 HQG对移植性肿瘤 Eac, Hep s, S180的抑制作用。结果 HQG的急性毒性为 347. 769 8, HQG100 mg/kg剂量组对小鼠移植瘤 Eac, Hep s和 S180的抑瘤率分 别可达到 51. 19% , 56. 75% , 46. 41%。结论 HQG的急性毒性小 , HQG可显著抑制小鼠移植瘤 Eac, Hep s和 S180的生长 , 具有明显的抗肿瘤作用。 关键词 :青蒿 ; 　多糖 ; 　抗肿瘤 中图分类号 : R285. 5　　文献标识码 : A　　文章编号 : 100820805 (2008) 0420937202 Exper im en ta l Study on the An ti - tum or Effect of Polysacchar ides from A rtem is ia annua L . XUE M ing1, 2 , TIAN L i2juan2 (1. N an jing U niversity of TCM , N an jing 210029, Ch ina; 2. J in ling Pharm aceu tica l Co. , L TD , N anjing 210009, Ch ina) Abstract:O bjective To study the effect of anti - tumor of polysaccharides from A rtem isia annua L. (HQG). M ethods Experi2 ments of acute toxicity and inhibitory effect of HQG on Eac, Hep s and S180 tumor cellswere observed. Results The acute toxicity of HQG was 347. 7698mg/kg. The inhibitory rate of 100 mg/kg HQG was 51. 19% of Eac, 56. 75% for Hep s and 46. 41% for S180. Conclusion HQG has low acute toxicity and can significantly inhibit the growing of Eac, Hep s and S180 tumor cells. Key words:A rtem isia annua L. ; 　Polysaccharides; 　Anti - tumor 　　青蒿为菊科植物黄花蒿 A rtem isia annua L. 的干燥地上部分。 是一味常用中药 ,清热解暑 ,具有除蒸、截疟的功能 [ 1 ]。目前对 青蒿的研究主要集中在青蒿素等萜类成分及其挥发油 [ 2～4 ] ,对其 所含多糖类成分少有研究报道。本文研究了青蒿多糖的抗肿瘤 活性。 1　材料 青蒿多糖 (自制 ,以下简称 HQG) ;环磷酰胺 (CTX) (上海华 联制药有限公司 ) ; 实验动物 : ICR种小鼠 , 18～22 g,雌雄各半 ;合格证号 : SCXK (苏 ) 2002 - 0011; 肉瘤 S180细胞 , Eac瘤株细胞 , Hep s瘤株细胞。 ·739· L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2008 VOL. 19 NO. 4 时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期