9c衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

2009年 19(5) 生 物 技 术 果最好，其杀菌率最高为90％。这在细菌学方面有重要意义。 同时表明，烟碱 3％杀菌作用随着作用时间延长杀菌率逐渐增 加，当处理 90min时，对病原菌杀菌率最高为82．9％。 参考文献： [1]鲁蕾，傅敏，郭宝星．烟梗成分提取及其应用研究 [J]．四川化工， 2004，7(1)：9—12． [2]王捷．烟碱在中枢神经系统中的保护作用研究进展[J]．国外医学药 学分册，2OOO，27(4)：224—227． [3]胡江涌，梁勇，谢亚，等．烟草各部位中茄尼醇含量分布研究[J]．分 析实验室，2007，26(12)：106—108． [4]刘国生．微生物学实验技术[M]．北京：科学出版社，2007：120—260． 75 【5]Palic Radoaav，s anovic，et a1．Chemical eompofifion and antimicrobial 8c． tivity ofthe easential 0i1 and CO2 extracts ofthe oriental tobacco，州lep[J]． Flavour and agr釉ceJournal，2002，17(5)：323—326． L6 JBerride Georgina，Gramer Rainer，Galione Antony。et a1．Metabolism of the novel Ca2 mobilifing messenger nicotinic acid—ademlne dinucleotide ph∞ 一 phate via a 2 prime —specific Ca2 一dependent phosphatase[J]．Biochemical Journal，2002，365(1)：295—301． [7]李国德，王晓民．乳化液膜分离富集烟碱的研究进展[J]．沈阳师范 大学学报 ，2007，25(3)：361—363． [8]晏卫红，黄思良，朱桂宁，等．广西仓储烟叶霉变微生物的分类鉴定 [J]．烟草科技，2008，(2)：50—56． 地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究 莫静燕，陈献忠，王正祥 (工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心，江苏无锡 214122) 摘要：目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率，为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地 衣芽孢杆菌工业生产菌株 Bacillus licheniformis 303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、 处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体，以 SMMP作渗透压稳定剂 ，溶菌酶浓度为 lOOmg／mL，37℃下酶解 30min，原生质体生成量可达 8×109个／mL；再生培养基选用含 lmol／ L琥珀酸钠的 DM3时，再生率最高可达 17％。在此条件下，采用 PEG法将游离型质粒 pHY—P43一s。co转化宿主菌 B．1ichenifor— mis 303，转化率可达 1O一15 CFU／／xg DNA。 关键词：地衣芽孢杆菌；原生质体；制备；再生；转化 中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1004—31lX(2OO9)05—0075—03 Preparation，Regeneration and Genetic Transformation of Bacillus lichenfformis Protoplasts Mo Jing—yah．CHEN Xian—zhong．WANG Zheng—xian~ (The Key bbo叫0ry of Industrial Biotechnolo~，Ministry of Educational，The Research Center of Bioresource and Bioenergy， School of Biotec}mology，Jiangnan University，Wuxi 214222 China) Abstract：Objective：Raising the output and the regeneration rate of protoplast of Bacillus licheniformls which lays the fotmdation for further im— proving the transformation effieiencies．Method：The protoplast preparation and regeneration with lysozyme for B．1icheniformis were investigated． Some parameters involved in preparation and regeneration including the growth phase，lysozyme concentration，cell treatment，osmotic stabilizer and mL~tlnl composition was optimized．Result：The optimal yield of B．1icheniformis protoplast with 8 x 109／mL was obtained when the late log— arithinic—phase cultures were digested with 100 mg(mL lysozyme for 30 min at 37℃ and SMMP was used as osmotic pressure stabilizer．F0r the regeneration of the protoplast，the DM3 nlediunl containing 1 mol／L sodium succinate was more efficient，the pealc of regeneration frequency is 17％．Under these conditions，PEG mediated protoplast transformation was carried out for introducing free plasmid pHY～P43一secQ into B．1i— che,~ rmis 303 and 10—15 positivetransformats permicrogramDNAwas obtained． Key words：Bacillus Z 白 括；protoplast；preparation；regeneration；transform ation 地衣芽孢杆菌(Bacillus眈 )是芽孢杆菌中最具应 用潜力的菌种之一，被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加 工、环境污染治理等各个行业⋯。为了更好地发挥地衣芽孢 杆菌菌种的优良性能，通常需要对地衣芽孢杆菌进行遗传改 造，但其自身存在的特殊生理、遗传性状，如：无感受态形成系 统，原生质体再生困难，特殊的限制修饰系统，给菌种分子改 良带来较大的难度 J。因此，建立一种高效的地衣芽孢杆菌 遗传转化方法是对该菌株进行分子水平改良的基础，特别对 于一些应用于工业生产的菌株而言，尤为重要。目前地衣芽 孢杆菌的转化方法主要有：电转化法 和原生质体转化法。 与电转化法相比，原生质体转化法条件温和，不需相应的转化 设备，获得阳性转化子的几率较大，并且一些研究者已经利用 PEG介导一原生质体转化技术应用于地衣芽孢杆菌染色体 DNA片段的删除和修复 J。然而，这些方法均是参考枯草芽 孢杆菌的原生质体转化技术的 J。在我们所知范围，还少见 收稿日期：2009—04一o8；修回日期；2009—05—04 基金项目：国家高技术发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 (2006AA020204)和江苏省高校“青蓝 工程”科技创新团队计划项目资助 作者简介：莫静燕(1985一)，女，硕士研究生，专业方向：微生物遗传 学，Email：yji,~ o@126．corn；*通讯作者：王正祥(1964一)，男，博士， 教授，博士生导师，研究方向：工业微生物资源与育种，Tel：86—510— 85918121，Email：xzwang@jiangnan．edu．en。 有针对野生型地衣芽孢杆菌进行原生质体遗传转化研究的报 道。同时，我们的前期研究发现枯草芽孢杆菌的原生质体转 化并不适用于地衣芽孢杆菌。 因此，本文以高产淀粉酶的地衣芽孢杆菌工业生产菌株 B．f ，帕肌 303为研究对象，对其原生质体的制备及再生 条件进行了优化，并利用 PEG介导方法将游离质粒 pHY—P43 一 secQ转入 B．z 咖 303中，获得了较为稳定的遗传转 化效率，为今后的基因工程改良奠定了技术基础。 l 材料与方法 1．1 材料 t．1．1 菌株和质粒 地衣芽孢杆菌(Bacillus ticheniformis 303)为淀粉酶工业生 产菌株，由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心(ht— tp：／／cieim—an．jiangnan．edu．on／)提供；用于遗传转化研究的质 粒 pHY—P43一secQ由本研究室前期构建。 1．1．2 试剂 溶菌酶(Lys ，IIle)购于 Sigma公司；PEG6o0o购于上海生 工生物工程技术服务有限公司。 2×SMM：0．05mol／L山梨醇，0．02mol／L顺丁烯二酸， 0．02mol／LMgCl2，pH 6．5。 Penassy培养基：0．15％牛肉膏，0．15％酵母膏，0．5％胰蛋 76 生 物 技 术 白胨，0．1％葡萄糖 ，0．35％ NaC1，0．2944％磷 酸氢 二钠、 0．1056％磷酸二氢钠。 SblMP：由等体积的4×Penassy培养基与 2×SNlVl混合而 成。 1．1．3 培养基 416 培养基：2％蛋白胨、1％酵母膏、1％ NaC1、0．2 mol／L 山梨醇。 再生培养基 D／W_3、RD、NBSG—x：参见文献配制 。 1．2 方法 1．2．1 原生质体制备与再生 参考文献[8]的方法，并对 B．1icheniformis 303原生质体的 制备和再生条件进行了优化。从新鲜平板上挑一单菌落，接 种于25mL416 培养基中，37℃、200r／min培养过夜后以3％接 种量转接到新鲜的25mL 416 培养基中，振荡培养8h。离心收 集菌体，用 10mL SNMP重悬，加 l~ ~mL的溶菌酶至终浓度 为 l0o mL，37℃、100r／min培养至 85％的细胞变为原生质体。 将原生质体离心去掉酶液，悬于SMMP中，经稀释后，涂布于 DM3再生培养基上，培养 2～3d后，计算原生质体的形成率及 再生率。计算方法为：形成率 =(A—B)／A×100％；再生率 = (C—B)／(A—B)×100％，其中A、B分别为溶菌酶处理前后在 完全培养基上的菌落数；C为溶菌酶处理后在高渗培养基上的 菌落数。 1．2．2 原生质体的转化 根据文献[6]方法，优化 B．1icheniformis 303原生质体转 化。取制备好的原生质体悬液，加入 1—5 l-'-g的质粒 pHY— P43一se 及等体积的 2×SMM缓冲液，再加入 1．5 mL 40％ PEG6000，轻轻颠倒混匀后，加 5mL SMNP混匀；4~C、3500r／min 离心 10min，弃上清，再加入 50o止 的 SMMP，30℃、100r／min培 养 130rain，涂布含有 1／．,g／mL四环素的再生培养基，培养 4～5d 后，计算其转化率(转化子数／ g DNA)。 2 结果与分析 2．1 原生质体的形成 2．1．1 菌体培养时间对原生质体形成的影响 分别取对数前、中、后、稳定期的菌体制备原生质体，其中 渗透压稳定剂采用 lmol／L琥珀酸钠，溶菌酶终浓度为 100t~ mL。结果如图 1所示，对数后期即转接培养 8h的菌体酶解 40min获得原生质体数最高，达到8×lO9个／mL；对数早期的菌 体酶解40min原生质体数仅2×lo'个／mL；而到稳定期时，细 胞生长达到动态平衡 ，细胞原生质体化时间较长，原生质体的 得率也有所下降。由此表明，不同生长时期的菌体对溶菌酶 的敏感程度有很大的差异，处于对数生长后期细胞的细胞壁 更易被酶降解而释放出原生质体，但不是菌体的菌龄越小，原 生质体得率越高，原因可能是在菌的不同生长阶段，菌体细胞 壁的结构组成有所不同导致 J。 Incubation time(11) 图 I 菌体培养时间对原生质体形成的影响 Fig．1 Effect 0f cellinLRIbstiontime Oft preparation ofprotoplasm 2009年 19(5) 2．1．2 不同溶菌酶浓度对原生质体形成的影响 收集培养至对数后期 8h的菌体制备原生质体，分别以 50mg／mL、100mg／mL、150m~mL、20olr InL、ZS0mg／mL五个溶菌 酶梯度在37~C、100r／rain下酶解40mln原生质体生成量如表 1 所示，当溶菌酶的浓度为50mg／mL时，原生质体生成量仅为 4．0×1 个／mL；当溶菌酶的浓度为 l0olng，IllL时，原生质体的 生成量较高，达到8．0×lO0个／mL；但浓度也不宜过高，否则细 胞脱壁太彻底，导致原生质体活力下降。 表 1 酶浓度对原生质体形成的影响 Tab．1 Eff ectof lys伽 ne concentration on preparation ofprotoplasm 溶菌酶浓度(m~CmL) 原生质体数(个／mL) 5O 4×lo8 lOO 8×lO9 150 4×1o9 200 8×108 250 5×108 2．1．3 溶菌酶作用不同时间对原生质体形成的影响 选用培养至对数后期的菌体制备原生质体，酶解 lh，定时 取样，稀释涂布，结果表明(见图 2)，随着酶解时间的延长，原 生质体形成率逐渐增加，当酶解约40rain时，原生质体形成率 达到最高；继续延长酶解时间，原生质体形成率未继续增加， 主要原因可能是酶继续作用于膜系统使膜破裂所致【l0J。 Enzyme time(h) 图2 酶作用时间对原生质体形成的影响 Fig．2 Eff ect ofdifferent enzymatic time on fonnalion of pl 0pl8sts 2．2 原 生质体的再生 2．2．1 溶菌酶作用时间对原生质体再生的影响 溶菌酶对质膜系统会有一定程度的破坏，因此酶解时间 的长短会严重影响原生质体的再生。将菌体分别酶解2o、25、 30、35、40min后稀释涂布再生培养基，结果见图 3。结果表明， 酶解 30 min左右时原生质体的再生率达到最高 17％，处理时 间过短或过长，原生质体的再生率均有大幅度下降。 Enzyme time0a) 图3 酶作用时间对原生质体再生的影响 Fig．3 Eff ect 0f en ma c hydrolysis time 0rI regenemtien of protoplmm 2．2．2 不同的再生培养基对再生率的影响 再生培养基的组成对原生质体的再生影响显著，特别是 培养基中碳源会影响微生物原生质体的再生率。在菌体生长 。^盘 nb JJ tIo一笥霉10．!I 2009年 19(5) 生 物 技 术 培养基中添加适量的某些营养因子可有效提高再生率，常用 的有酵母膏、蛋白质、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸钠等。这些 物质可作为细胞壁合成的前体物质，也可通过生理代谢或转 化成细胞壁的前体物质或促进代谢、加速细胞壁合成 。选 用培养至对数后期的菌体制备原生质体，经稀释后涂布不 同 的再生培养基，37~C培养 2—3d后计数，考察原生质体在各培 养基上的再生情况(见图 4)。实验结果表明，原生质体在 DM3 上的再生率最高，NBSG—X次之，而在 RD上的再生率最差。 Regeneration medium 围4 不同的再生培养基对原生质体再生率的影响 Fig．4 Effect of different regeneration nlt~ Unl on regeneration of protoplasts 2．2．3 高渗透压培养基中稳定剂对原生质体再生的影响 渗透压稳定剂的种类和浓度是影响原生质体再生的一个 重要因素，它可以维持再生培养基中的渗透压平衡 ，以琥珀 酸钠、蔗糖 、山梨醇、甘露醇为渗透压稳定剂 ，分别加入到 DM3 再生培养基中，终浓度除琥珀酸钠为 hnol／L外，其余三种均为 0．5mol／L。原生质体再生率如图5所示，在以 lmol／L琥珀酸钠 为渗透压稳定剂的再生培养基上，原生质体的再生率最高，其 次是 0．5mo]／L甘露醇，而在 0．5mol／L蔗糖和 0．5mol／L山梨醇 为渗透压稳定剂的再生培养基上，原生质体的再生率较差。 图5 高渗培养基中不同渗透压稳定剂对原生质体再生的影响 Fig．5 Effect of various osmotic stabilizers on regeneration of protoplasts 2．3 原生质体转化 用带有四环素抗性的质粒 pHY—P43一secQ转化 曰．矗． che,,ifo．,~303，转化率为 lO一15 CFU／ttg DNA。随机挑取几株 转化子，提取质粒进行酶切验证，经 EcoR I酶切释放出6．0kb 左右大小的目的条带，与预期大小一致 ，结果表明得到的转化 子均为阳性转化子(见图 6)。 3 讨论 在用PEG介导的原生质体转化方法时，保证原生质体的 得率及再生率是转化的前提，不同地衣芽孢杆菌菌株原生质 体制备和再生条件有所差异。用酶法破壁制备原生质体，酶 浓度、酶解时间、渗透压稳定剂等因素是影响原生质体得率及 再生率的重要 因素。酶的浓度过高 ，易造成原生质体不稳定 而变形；浓度太低，破壁困难，则原生质体产量不足。酶解时 间短，原生质体释放量低；酶解时间过长，原生质体数量下降。 渗透压稳定剂作为溶菌酶的作用环境和原生质体的存在环 77 境，对原生质体的释放与再生也有重要的影响。 本文对 B．1icheniformis 303原生质体的研究主要集中在制 备和再生方面，但原生质体最终 目的是用于 DNA转化。曰． 1icheniformis 303原生质体的转化过程复杂，影响转化的未知因 素多。在保证原生质体感受状态的条件下，DNA与原生质体 是否充分接触对原生质体转化效率有至关重要的影响。除此 以外，原生质体的转化效率还与选择标记、质粒构型等有关。 本实验得到的转化率要低于电转化处理地衣芽孢杆菌所得到 的转化率，转化率的提高有待进一步研究，但得到阳性转化子 的几率要远高于电击转化方法，很好地满足了进一步实验的 需要。 kb 6．O 图6 地衣芽孢杆菌转化子验证分析结果 Fig．6 Restriction identification of the plasmid in the B．1icheniformis trans- fo~rnant． M， DNA／PstImarker；lane 1，plasmid in E．co／i digested with RI； lalfle 2～7，plasmidinthetransformant~gostedwith RI． 参考文献： l1jYoon K，JeongYC，JuHK，eta1．Identification and antimierebial activity of phenylacetie acidproduced by Bac／／／us licheniformis isolated from fermented s~ybcan[J]．Microbiology，2004，48(1)：312—317． 【2]Erwin HD，IMoekW，LudolfGB，eta1．NovelmethodsforgenetictrailS— formationof natural Bac／／／us subtilis isolates usedto咖 dytheregulation oftIle mycosubtilin and SUl'factin synthetases[J]．Ap Environ Mierobiol，2OO7， 73：3490—3496． [3]Xue G P，Jennifer S J，Brian PD．Highosmolarityimprovesthe electro— transformation efficiency of the grain—positive bacteria Bac／／lus subtilis and Bacillus licheniformis[J]．J Microbiol Meflmds，1999，34：183—191． [4]Waldeck J，Rammes H M，Wieland S，et a1．Targeted deletion of genes encoding extracellular~[1ZytlleS in 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