HPLC测定贵州产黄芪中黄芪甲苷的含量

第31卷第3期 2007年 5月 江西师范大学学报(自然科学版) JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE) Vo1．31 No．3 Mag 20O7 文章编号：10(0)-5862(2007}03。0278—04 HPLC测定贵州产黄芪中黄芪甲苷的含量 彭全材 一， 胡继伟 ， 杨占南2， 黄先飞 ， 连国奇 (1．贵州师范大学 贵州省tht~~境重点实验室，贵州 贵阳 550001；2．贵州师范大学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 测试中心 ，贵州 贵阳 550001； 3．贵州师范大学 生物技术与工程学院，贵州 贵阳 550001) 摘要：对贵州黄芪药材黄芪甲苷的含量进行了测定，采用甲醇超声提取样品，HPLC梯度洗脱．黄芪甲苷 的理论塔板数为5 588，分离度为 1．42，拖尾因子为 1．01．回归方程 Y：1．4048 X+16．682，R：0．999 0， 在 4．400 440．0tc,／mL之间的线性关系 良好．13内和13间精密度的 RSD均小于 1．5％，重复性试验的 RSD为0．7％(n：5)，最低检测限为0．440t~／mL，加样回收率为98．9％、96．7％、99．8％，RSD(n：5)分 别为 2．8％、3．5％、2．5％．黄芪样品中黄芪甲苷的含量均符合《中华人民共和国药典》(20o5版)标准．该方 法缩减了黄芪药材的前处理 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 ，节约了实验时间，适用于黄芪药材中黄芪甲苷含量测定；同时也证明黄 芪的质量较好 ． 关键词：HPLC—ELSD；黄芪；黄芪甲苷；黄芪药材 中图分类号：O 657 文献标识码：A 黄芪系豆科蝶形花亚科多年生草本植物，黄芪是豆科植物中的一个大属，约2 000多种，其中黄芪亚属 在我国有 61种、1个亚种、13个变种，药用黄芪属植物主要集中在黄芪亚属．人们大多取其根入药，其主根 长，圆柱形，稍带木质．传统用于提高人体免疫力等功效_l J，同时也被用来补气——比如疲劳，缺乏精力等症 状[ ．黄芪的有效成分为黄芪甲苷，化学机理也已经被证实_3 j，动物实验中黄芪显示出具有帮助小耗子治 疗和抵抗流感病毒的功能[8-10]．现在一般认为黄芪的功效有增强免疫功能、增强病毒诱生干扰素的能力、促 进机体代谢、改善心功能、降压作用、保肝作用、调节血糖、抗菌及抑制病毒作用r ，还有类似激素样作用，可 延长小鼠的动情期，另外有人认为黄芪能显著降低家兔血液流变学指标_l ．我们还运用 ChemDraw软件构建 了其分子结构(图 1)，同时使用 Chem3D软件模拟了其 3D构象(图 2)，这样就有便于我们直观地了解其最低 能量时的分子构象． glc 图 1 分子结构 图 2 Molecular mechanics MM2能量优化 3D图 《中华人民共和国药典))2005版第 2部HPLC．ELSD等梯度洗脱测定黄芪甲苷，样品前处理要经过浸甲 醇泡过夜一索式萃取一蒸干一正丁醇萃取一氨水处理一蒸干一定容等过程，方法复杂，回收率低，而且重现 收稿 日期：20O7．03．16 作者简介：彭全材(1983一)，男。江西人 ，理学硕士研究生，主要从事药用植物的研究 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 彭全材，等 ：I-LPLC测定贵州产黄芪中黄芪甲苷的含量 279 性较差等．本文采用 HLPC—ELSD梯度洗脱测定黄芪甲苷含量，简化了前处理步骤，具有回收率和重现性高、 精密度好等优点． 1 仪器、样品与试剂 1．1 仪器 岛津高效液相色谱仪：HPLC一20AT；20 L进样阀；Model 300 ELSD；HW．2000色谱工作站；药材粉 碎机；瑞士 BUCHI旋转蒸发仪；Simplicity 185 personal超纯水器(美国Milli2 pore公司)；色谱条件：迪马C18色 谱柱(4．6 inin×250 inin，5 m)；美国ELMA T660／H超声波清洗器(功率 360 W，频率 35 kHz)． 1．2 试药 黄琵甲苷对照品购于中国药品生物研究所；黄芪药材产于贵州各地(当地农民送样)．高效液相 色谱流动相组成为色谱纯乙腈及超纯净水． 2 对照品溶液和样品溶液制备 2．1 对照品溶液的配制 精密称取对照品 8．80 mg置于 10-nIJ量瓶中加甲醇到刻度，摇匀即得 0．88 mg,／mL 的溶液．分别取 2．50，0．50，0．25，0．05 mL置于 10 InIJ量瓶中加甲醇到刻度，即得 0．220 0，0．O44 0，0．022 0， 0．004 4 mg／mL的对照品溶液． 2．2 样品溶液的配制 精密称取黄芪药材粗粉约 4．0 g(过 4o目筛，4o℃干燥至恒重)于具塞锥形瓶中，加 入甲醇 25 mIJ，超声处理 15 min，重复 3次，合并甲醇溶液滤过蒸干．残渣用适量甲醇溶解，转移至 5-nIJ容量 瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0．20 m滤膜过滤．取续滤液，上机备用 ． 3 色谱条件 3．1 色谱条件 流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱．B相随时间变化：60％(0～7min)，60％～0(7～10 min线性)，0(10～17 min)，17 min(停止)．流速 1．5 mI_／min；柱温 4o℃，进样 20 ． 3．2 蒸发光散射检测器条件 漂移管温度：60℃，载气(空气)压力：35 psi，放大系数为 9．根据对照品的保 留时间定性、峰面积比计算黄芪甲苷的含量． 4 方法与结果 4．1 色谱柱的选择 分别用 Symmetry C18色谱柱(3．9 inin×150 inin，5胛 )、shim—pack C18色谱柱(4．6 inin× 250 inin，5 m)、迪马 C18色谱柱(4．6 inin×300 inin，5 )进行对照品和样品的测定，结果表明，上述 3种柱子 峰型都很好，但从分离效果和效率综合考虑，我们选择了 shim—pack C18色谱柱(4．6 inin×250 inin，5 )．样 品与对照品的分析图谱见图 3． 1 2 3 4 5 6 7 8 0 图 3 液气相色谱图 4．2 前处理方法及检测器的选择 曾采用甲醇对同一黄芪样品进行超声提取和索式萃取处理，结果表明： 甲醇作为提取溶剂超声提取，提取率偏高，甲醇索式萃取提取液杂质少分离效果较好．但考虑到超声提取也 可以将黄芪甲苷较好地分离且回收率高，操作简便，故选择甲醇作为提取溶剂超声提取 ． 黄芪甲什测定常用的检测器有紫外检测器和示差折光检测器．紫外检测器适用于带紫外吸收特征基团 维普资讯 http://www.cqvip.com 江西师范大学学报(自然科学版) 2007焦 的物质，如果没有紫外吸收，则需经衍生化技术转化成有紫外特征吸收的物质，但这种操作复杂，且准确度 受衍生物的稳定性的影响大．示差折光检测器是一种通用型检测器，要求恒温、恒流速，且无法采用梯度洗 脱，其检测灵敏度也不够高，所以对黄芪的分离效果自然就差了．蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种新型通 用型检测器，弥补了 HPLC传统检测器的不足，特别是对无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物的检 测，具有极大的优越性 ． 4．3 线性关系考察 将不同浓度的对照品溶液依次进样，分别重复 3次，以对照品溶液浓度的自然对数为 横坐标( )，峰面积的自然对数为纵坐标(y)绘制标准曲线，计算回归方程：Y=1．404 8 X+16．682，R= 0．999 0，在 4．400 440．0t,．g／mL之间的线性关系良好． 4．4 精密度试验与稳定性试验 以4．40，44．00，440．00 t,e,／mL的黄芪甲苷对照品溶液，在 1 d之内连续进 样5次，以及连续5 d分别进样，根据所得峰面积分别计算日内精密度和日间精密度．黄芪甲苷对照品溶液 低、中、高3个浓度的日内精密度和日间精密度的RSD分别为 1．2％、0．9％、0．6％和1．6％、0．5％、0．7％ ，结 果表明方法的精密度良好 ． 取第二批次黄芪药材的备用液，按色谱条件进行测定，分别在0，3，6，12，18，24，36和48 h测定黄芪甲苷 的峰面积，考察稳定性 ．RSD为 0．7％． 4．5 回收率试验 精密称取样品二的粗粉 5份 ，各约 4 g，分别加入黄芪甲苷 1．0，0．5，0．1 nag，甲醇定容到5 mL，20 进样测定，分别按 2．2条件制成样品溶液，每份测定 3次，计算加样回收率 ．黄芪药材中黄芪甲苷 3 个水平的加样回收的结果分别为 98．9％、96．7％、99．8％，RSD(n=5)分别为2．8％、3．5％、2．5％． 4．6 检测限考察 将黄芪甲苷对照品溶液进行稀释，以信噪比为 3：1时，确定其最低检测限，其最低检测 限为0．440 t,e／mL． 4．7 测定结果 测定结果见表 1．从表 1可见，贵州产黄芪中黄芪甲苷的含量差异性较小． 表 1 贵州黄芪中黄芪甲苷的含■测定结果 5 讨论 本实验所建立的HPLC．ELSD方法与目前常用的黄芪甲苷含量测定方法相比，操作简便，不需过层析柱， 减少样品的前处理所带来的误差，提高了分析的精确度． 从实验结果可以看出，贵州产黄芪中黄芪甲苷含量的差别比较小．按照《中华人民共和国药典》(2005 版)规定黄芪中黄芪甲苷的含量不得低于0．040％的标准，10批次的贵州黄芪药材的质量均符合要求．表明 对贵州黄芪原料如果严格的控制质量，从药材的采集、贮藏到原料的提取，都制定严格统一的标准，贵州黄 芪也将有很大发展． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 彭全材，等：HPLC测定贵州产黄芪中黄芪甲苷的含量 281 参考文献： [1]龚昭，刘彦，朱忠超，等．黄芪对腹腔镜气腹所致红细胞免疫功能损伤的保护作用[J]．中华实验外科杂志，20O6，26(3)：371． [2]陈雅，余汶华．黄芪及其制剂的药理作用和临床应用进展[J]．中国药业，2006，(3)：68．69． [3]汪德清，田亚平，向兰．黄芪总黄酮生物学活性作用的化学成分基础研究[J]．军医进修学院学报，2006，27(1)：13·15． [4]童红莉，田亚平 ，汪德清，等 ．黄芪多糖对高脂血症大鼠血脂的调节[J]．中国临床康复，2006，10(11)：68—70． [5]殷平善．浅谈黄芪的临床应用[J]．四川中医，20Gl6，24(5)：38．39． [6]Xiao Hong-bin，Hang Xin—miao，Lu Pei—chang．Total analytical method for Radix astragali extract using two-binary multi—segment gradient e‘ lution liquid chromatography[J]．Journal of Separation Science．2001，24(3)：186—196． [7]Xiao H B，Krucker M，Putzbach K，et a1．Capillary liquid chromatography—microcoil H一1 nuclear magnetic resonance spectroscopy and liq· uid chromatography—ion trap mass spectrometry for on—line structure elucidation of isotlavones in Radix astragalil JJ．Journ~of Chromatogra— phy，2OO2(1)：135—143． 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factor 1．113．The calibration cllrve was linear in the range of4．4O0～44O．0 mL，Y=1．404 8 +16．682，R=0．999 0．The Intra—day and inter-day precision(RSD) were all less than 1．5％，the recurrence(RSD)Was 0．67％ (n=5)．The limit of detection Was 0．44O t,e,／mL，the recovery 98．9％，96．7％，99．8％ ，and RSD 2．8％、3．5％、2．5％ (n=5)respectively for astragaloside Iv．Our developed method can shorten the time used for Radix astragali pretreatment，and is a simple and reliable method to de— termine the content of astragaloside IV in Radix astragali．The results also prove that the quality of Radix astragali in Guizhou Province is relatively good． Key words：high·-performance liqu id chromatography with evaporative light·-scattering detection；radix astragali；astragalo·- side IV；medicinal plants (责任编辑：刘显亮) 维普资讯 http://www.cqvip.com