大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及表达

23 卷 6期 2007年 11月 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology V01．23 No．6 November 2007 大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 Construction and Expression of the Soybean Isoflavonoid Biosynthetic Pathway in Escherichia coli 郝 佳。，马会勤 ，代 茹 ，陈尚武 HAO Jia。，MA Hui—Qin ，DAI Ru and CHEN Shang—Wu。 1中国农业大学食品科学与营养 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院，北京 100083 2中国农业大学农学与生物技术学 院，北京 100094 1 College ofFo0d Sc nce＆Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083．China 2 Deportment ofPomology，College ofAgronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Be~iing 100094，Ch／na 摘 要 自然界异黄 酮合 成途径主要存 在于豆科植物 中。以微 生物 为宿 主研 究异 黄酮代谢 ，则需要将 整 个相关代谢 途径 的 多酶体 系组 装到 工程 菌种，从 而进行表达及代谢研 究，这就需要用到 多基 因的转化和共表 达技 术。综合 应 用了 多基 因单 载体 和 多基 因 多载体 方法，将 大豆异黄 酮代谢 途径 中的五个关键 酶基 因导入到 大肠杆 菌 中，对 异黄酮代谢 途径在 大肠杆 菌中的构 建和表达进行了研究和探索，获得了含有五个外源基因的重组大肠杆茵；重组菌经IPTG诱导，以L一酪氨酸为底物进行发酵，发 酵产物经过 HPLC测 定，结果表明和 空白对 照相 比有新 的代谢 产物生成，初步 断定为异 黄酮类化合物。 关键词 异黄酮代谢途径 ，多基 因导 引，重组 菌 中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 100o一3061(2007)06—1022—07 Abstract The natural isoflavones biosynthetic pathway is only limited in legumes plant．To study the isoflavone in bacteria by metabolic engineering requires transformation of multi—gene of the whole pathway into the host strain to resembling the expression and metabo lism of the genes．The multi—gene transform ation and expression strategy become necessary because of this．This article talks abo ut the multi—gene transform ation strategy using one or many vectors，taking the five genes of isoflavonoid biosynthetic pathway to E．coli．Th e recombinant bacteria carry five genes with two vectors，the whole Isoflavonoid biosynthetic Dathway was constructed into E ，coli．Ferm ented with L—tyrosine as substrate and IPTG as an inducer，the recombinant bacteria can produce a new isoflavone related metabolite showed on HPLC analysis profile． Key words isoflavonoid biosynthetic pathway，multi—gene transform ation strategy ，recombinant 自然界中，生物体某一代谢途径的中间或终端 产物 的形 成通 常需 要一个多酶体 系的参与才能完 成 。在代谢工程研究中，如何 向宿 主菌 中同时转化 和表达多个外源基因 ，是需要解决的具有重要应用 价值的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ⋯。多基因的组装与转化技术 目前 主要 分为两种 ，一种是多载体的共转化法 ，即将外源基 因构建在不同载体上 ，把多个重组载体导入受体细 胞；另一种是多基因单载体的一次性转化法，即由一 个载体携带多个基因到宿主细胞中。第二种方法又 分为单启动子融和基因表达载体构建和多启动子多 Received：March 6，2007；Accepted：April 30，2007． This w0rk was supported by the grant from the National Natural Science Foundation of China(No．30371005&39970469) * Corresponding author．Tel： +86-10-62731390；Fax： +86-10-62731390；E-mail：swchen@ cau．edu．cn 国家自然科学基金资助(No．30371005&39970469)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 郝 佳等：大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及表达 顺反子表达载体构建 。 苯丙烷类代谢途径(phenylpropanoid pathway)是 植物次生代谢途径中很重要的一条 ，产生木质素 、花 青素、芪类和黄酮类化合物等次生代谢物的共同代 谢物中间体，对于植物抗性 、植物品质以及人类的健 康有重要的作用 。大豆异黄酮代谢途径就是其中 重要的一支，其代谢物大豆异黄酮是近年来备受关 注的具有一系列保健功能的物质，其市场和未来的 应用前景十分可观 J。大豆 中的异黄酮的含量仅有 0．1％ ～0．3％ ，这一方面要求提取工艺的继续发 展和完善，另一方面要求研究者去探索新的方法，以 寻求异黄酮新的来源。现代基因工程的发展为此开 拓 了新的方法和思路 ，利用转基 因技术构建工程菌 发酵生产大豆异黄酮的研究具有重要意义。 异黄酮合成代谢途径由苯丙烷途径和异黄酮合 成途径共同组成 ，主要存在于豆科 植物 。主要包 括以下几个关键 酶 ：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂 酸羟化酶(C4H)；4．香豆酸．辅酶 A连接酶(4CL)、查 耳酮合成酶(CHS)、查耳酮异构酶(CHI)和异黄酮合 成酶(IFS)[s J。具体途经如图 1 。 Dhenyla~anine R=H ：Onnarnoyt—CoA 4-coumafic acid R=OH：4-co~maro'A-CoA CHI R=H ：pmocembrin chalcone R=OH ：nanngenin cha~cone ∞ 图 1 异黄酮代谢途径示意 图 Fig．1 lsoflavonoid biosynthetic pathway The dashed alTows represent the expected isoflavonoid biosynthetic pathway in E．coli；TAL：tyrosine ammonia-lyase． 在本研究 中，采用 多载体转化和单载体转化相 结合 的方法 ，将大豆异黄酮类代谢途径 中五个关键 酶基因(pal，4cl，chs，chi， )由两个载体携带 ，成功 的导 入 到大 肠 杆菌 中；对重 组 菌进 行 发 酵研 究 ， HPLC测定发酵 产物检测 到新 的代谢 产物，初步 断 定为异黄酮类物质。实验结果表明 ，本研究成功地 实现 了异黄 酮代谢 途径在大肠杆菌 中的构建 和表 达 ，重组菌可 以发酵 L．酪氨酸生成异黄酮类物质 ， 这为利用工程菌发酵生产大豆异黄酮打下了良好的 理论基础。 1 材 料与方法 1．1 材料 1．1．1 基因 ：已连接到 pMD．18T和 pGEM．T．Easy上 的pal，4cl，chs，chi， 基 因由本试验室从我国栽培 大豆基因组 DNA和叶片 cDNA文库中克隆 。 1．1．2 质粒和菌种 ：质粒 pGEM．T．Easy载体 试剂盒 (Promega公司)；pMD．18T载体试剂盒(TaKaRa公司， 大连 )；表达 载体 ：pET．31b(+)，pET．30a(Novagen， USA)；大肠杆菌 E．coli DH5a本实验室保存；大肠杆 菌 E．coli BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN，北京)。 1．1．3 工具酶及其他试剂 ：限制性内切酶 、T4 DNA Ligase 、Ex Taq DNA 聚 合 酶、dNTP、DL2000 DNA marker等(TaKaRa公 司，大连 )；琼脂糖凝胶 DNA 回 收试剂盒(Geneaid公司 ，台湾)；质粒 DNA小量提取 试剂盒(道普科技公 司，北京 )；染料木素 、大豆甙元 标品(慧科生物技术公司，西安)；X．Gal、IPTG、氨苄 青霉素等药品均为进 口或国产生物试剂。 1．2 方法 1．2．1 pET．31b(+)载体 改造 ：为了连 接 4cl基 因， 对 pET．31b(+)载体进行了一定的改造 。合成两 条互补的寡核苷酸(图 2)，命名为 DNC5，等摩尔退 火 ，形成具有 Nsi工和 Xho工酶切后 突出末端 的双 链 ；pET．31b(+)质粒用 Nsi工和 Xho工双酶切回收， 与上述含突 出末端 的退火双链连接 ，转化测序。改 造后的载体命名为 pET．31b(+)C载体(图3)。 5’一粕GcCATTJ6．cGGcC^ G^crTGGCC GGcCC一3 3-_^c四托CGGT^ T^GcCGG Ⅸ CGGcTCCGcCGG6I 疆一5 Nsi I HindIII Xho I 图 2 载体改造互补寡核苷酸链 Fig．2 The oligonucleotides for reconstructing the vector Xho I j ¨ 图 3 pET-31b(+)改造示意 图 Fig．3 The process of reconstructing pET-31b(+) lI ～^f I 一 、 洲＼ ～ 0 一 ～ 一 3 n 维普资讯 http://www.cqvip.com Chinese Journal ofBiotechnology 生物5~-程学报 2007，Vo1．23，No．6 1．2．2 单基因表达载体构建：对每个基因 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 带有 酶切位点的引物(表 1)，PCR扩增相应片段 ，与同样 双酶 切后 的表 达质 粒 连 接。pal与 pET-30a通 过 BarnH I和 Xho I酶 切 为 点 相 连 ；4cl基 因通 过 Hind m和 Nde I位点 与 pET．31b(+)C连接 ；chs、 和 均通过和 Xho I和 Nde I位点与 pET．31b (+)连接。 表 1 用于 E．coli单基 因表达引物 Table 1 PrilTlers for single genes expression in E ．coli 1．2．3 共表达载体 pET．31b．4GS的构建 ：设计共表 达引物 (表 2)，以 pET-31b(+)．CHS、pET．31b(+)． CHI和 pET．31b(+)．IFS为模版 ，PCR扩增连接有 17 启动子和相应核糖体结合位点(RBS)的各个基因， 将 c ，chi，ifs三 个 基 因 与 pET．3lb．4CL顺 序 连 接 ，” (图 4)。最后构建为两个基因表达质粒 ：pET- 30a．PAL，pET-31b．4GS。进行 PCR及酶切验证。 H 表 2 共表达 引物 !兰 !竺 竺竺 墨 ’m兰： Gene，prireef nanle Primer sequenee Enzyme site 1．2．4 pET-30a．PAL和 pET-31b．4GS共转化 E．coli BI21(DE3)及验证 ：将等摩尔的pET-30a．PAL和 pET． 31b．4GS共转化化 E．coli BI21(DE3)感 受态细胞 ， 在含有 100mg／L氨苄青霉素及 50mg／L卡那霉素的 双抗性 LB平板上筛选阳性共转化子。挑取单克隆 以 PALF／PALB和 IFScoF／IFScoB为引物做菌落 PCR， 验证 pal基因和 基因在单克隆中的共存；同时， 将单克隆接种到含有 100mg／L氨苄青霉素及 50mg／L 卡那霉素的双抗性液体 LB培养基中，过夜培养 ，提 取质粒，电泳验证。 1．2．5 CHS蛋 白的表达验证及 MALDI．TOF／TOF质 谱分析 ：对 CHS蛋 白进行 表达 验证 。将 pET．31b． CHS转化 到 E．coli BI21(DE3)中，在含 有 100mg／L 氨苄青霉素的 LB平板上筛选阳性转化子。挑取单 菌落进行验证后转入到含有 100mg／L氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37℃振荡培养 16h，当 0D =0．9 ～ 1．0时 ，以 1：200比例接种于新鲜的含抗生素的培 养基中，37℃振荡培养 3～5h进行扩增，取 1mL菌液 。 H 图 4 共表 达质粒 pET-31b一4GS构建示意 图 Fig．4 The map of plasmid pET-3 1 b一4GS for coexpression 维普资讯 http://www.cqvip.com 郝 佳等 ：大 豆异黄酮代谢途径在 大肠杆菌中的构建及表达 作为诱导 前对 照 ，然后 加 入终 浓度 为 1mmol／L的 IPTG，在 37℃振 荡培养 中诱导 工程 菌表达 7h。以 E．coli BI21(DE3)及经 pET．3lb空载体转化的 BI21 (DE3)菌株培养物为阴性 对照 ，作蛋 白质 表达水平 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)检查 。 切取 SDS．PAGE胶 上特异性表达 条带 ，胰 蛋 白 酶酶解后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (Matrix-ssisted Laser Desorption Ionization-Mass Sectrometry，MALDI．TOF／TOF)测 得 肽 质 量 指 纹 谱 (PMF)，以在数据库中查询识别的方式对表达的特 异性蛋白条带进行鉴定 。本实验采用仪器为德 国 Autoflex MALDI．TOF／TOF(Bruker Dahonics Inc)；反 射检测方式 ；飞行管长 3m；氮激光器 ：波长 337nm。 1．2．6 重组菌株的表达及发酵研究 ：将共转化菌株 及空白对照菌株在 LB培养基中预培养过夜 ，取其中 50／~L转接到 15mL含 50mg／L氨苄青霉素及25mg／L卡 那霉素的LB培养基中。26~C，120r／rain培养至 DD锄 = 0．7。在每支试管中加入 If，rG至终浓度 1mmol／L， 26℃，180r／rain振荡培养 7h。取 出诱 导菌，4500r／min 离心 8min收集菌体，用 M9培养基清洗2次。将所得 菌体转入 15mL的 M9培养基 中，加入 3mmol／L的L．酪 氨酸，1mmol／L的 IPTG，50mg／L氨苄青霉素及 25mg／L 卡那霉素 ，26％培养发酵 65h 。 取出发 酵后 菌液 ，用 6mol／L的 HCL调 pH至 3．0，室温放置 lh。在其中加入 l：l的乙酸乙酯进行 萃取，静置 2h后离心取上层有机相；在下层溶液里 面再加入 3：2的乙酸乙酯进行萃取，离心后取上清 与前一次的上清合并 ，共约 20mL。用旋转蒸发器将 有机相蒸干 ，加 750／~L甲醇溶解蒸干后的剩余物 ，保 存备测 。 采用高效液相色谱法测定发酵提取物 ’ ’ 。 以98％的染料木素和大豆甙元作为标品。高效液 相色谱的条件是：色谱柱，ODS CI8柱(150mm× 2．1mm×5m)；流速 ，lmL／min；柱温，25℃；检测波长 ， 254nm；流动相 ，0．1％乙酸溶液(A)和 乙腈(B)；梯度 洗脱 ：0～6min，100％A；6～10min，75％A，25％B；10 ～ 20rain，64．2％A，35．8％B；20min～25min，100％A。 2 结果与分析 2．1 pET-31b(+)载体改造结果及分析 连接了 DNC5片段 的 pET．3lb(+)，经 过转化 、 提取质粒 pET．3lb(+)C，用 Hind m可以切开；送样 测序结果如图 5。原 pET．31b(+)质粒不含 Hind m 位点 ，而改造后 pET．3lb(+)C可以用 H／ndm切开 ， 说明正确插入 了 DNC5片段 ；测序结果也进一步证 明 pET．31b(+)c载体构建是成功的。 Nsf l ndllI C1]cTAGAAATAA丌r唧 AACTTTAAGAAGGAGATATACAT盯Ge眦 CCA1．rACGGcc触Gc订lGGcCGAGGcGG Xho I AA GGACGCGcCC研 AGcGGCGcA-兀．AAGCGcq,q,CG。印鲫阳 I-GI册 A 图 5 pET-31b(+)c测序结果 Fig．5 The result of sequencing for pET-31b(+)c 2．2 单基因表达载体构建结果及分析 五个基因分别与表达载体连接后，转化 E．coli BI21(DE3)，培养后 提取质粒。分别用相 应内切酶 做双酶切 ，酶切结果如 图 6。酶切 得到了与各基 因 大小一致的目标片段，证明各表达载体构建是成功 的。 2．3 共表达载体构建结果及分析 将构建的 pET．3lb一4GS质粒转化到 E．coli BI21 (DE3)菌株 中，在含有 Amp抗性 的 LB平板上进行筛 选，挑取单克隆到有 Amp抗性的 LB液体培养基中， 过夜培养提取质粒。质粒用 Nde I和 Hind m双酶 切 ，酶切结果 如图 7。因为四个基 因前面均连接有 Hindm位点 ，所以应得到 4个相应大小的片段 ，结果 显示与预期一致 ：4cl，1．8kb；chs，1．3kb；chi，0．75kb； ， 1．7kb。结果 说 明，pET．3lb．4GS的构 建是 成功 的。 2．4 共转化结果 将共转化的 BL21菌株涂在含 Km和 Amp双抗 的LB平板上，过夜培养，挑取单克隆直接进行菌落 PCR：以 PALF／PALB为 引物 PCR验证 pET．30a．PAL 的导入；以 IFScoF／IFScoB为引物 PCR验证 pET．3lb． 4GS的导入。PCR结果如图 8，得到 2．1kb大小的片 段 ，与 pⅡz大小一致 ；得到 1．7kb大小的片段 ，与 IFS 大小一致 。同时 ，将 单克隆挑取到含 双抗 的 LB液 体培养基中，一株过夜培养 ，一株培养 50h，提取质 粒 。质粒电泳结果如图 9，显示所提取的为双质粒 ， 且 大小 与 pET．30a．PAL和 pET一3lb一4GS大 小一致 。 由此可 以说 明，pET．30a-PAL和 pET．3lb-4GS两个质 粒同时导 入 BL21菌株 是成功 的，且在 含有 Km和 Amp双抗的培养基 中可以较长时间保持这两种质粒 维普资讯 http://www.cqvip.com Chinese Journal ofBiotechnology 生物工程学报 2007．Vo1．23．N0．6 的共存 。 bD 5400--—— b p 2000 1000 550 200 图 6 各单 基因表达载体酶切结果 Fig．6 The results of restriction enzyme analysis of single genes expression M ：marker D12 000；1：pET·31b-PAL；2：pET一31b-CHS；3：pET一31b— CHI；4：pET-3Ib-IFS；5：pET一3Ib-4CL． 1 2 M bp 2000 l000 750 图 7 pET-30a一4GS酶切结果 Fig．7 The result of restriction enzyme analysi8s of pET-3 1 b-4GS M：maker DL2000；1，2：pET一31b-4GS． 1 2 M 3 4 bp — — 2Ooo — — 1ooO ·-- 一 750 图 8 共转 化菌落 PCR结 果 Fig．8 The resuhs of colony PCR for cotransformation E．coli maker D12 000；I，2：PCR amplification product with pfime~ PALF PALB；3，4：PCR amplification prod uct with primers． 2．5 CHS蛋白的 SDS．PAGE分析及质谱分析结果 以 E．coli BI21(DE3)和经 pET一31b(+)质粒转 ■t二 图 9 共转化质粒提取结果 Fig．9 The plasmids extracted from the cotransformation E ．coli I，2：plasmids extracted from the cotransformation strains(I，ovemight；2， 5Oh)3：pET一30a—PAL；4：pET一31b-4GS． 化的 BL21(DE3)为对照，与转化 了pET一3lb(+)一CHS 质粒的 E．coli BI21(DE3)工程菌 在同等条件下培 养 、诱导表达 、裂解后进行 SDS—PAGE分析 ，结果 如 图 l0。根据 GenBank中大豆 chs全基因可以翻译 出 390个氨基酸 ，分子 量为 l3．1kD。含 pET一3lb(+)一 CHS质粒的 E．coli BI21(DE3)工程菌经诱导后蛋 白质抽提物在分子量 45kD和 35kD间，出现一条明 显的特异蛋 白质表达条带 ，表达产物 的分子量约为 43kD，与理论值一致。 kD 94 66 45 35 图 10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳 Fig．10 SDS—PAGE analysis of the expressed products M ：protein molecular weight marker；I：E．col B12I control；2：E．col B12I／pET．3Ib(+)vector contml；3：E．coli B12I／pET一3Ib(+)一CHS culture without WTG induction；4．E．coli B12 I／pET 3lb(+ )一CHS culture after IPTG induction． 对特异性 条带进行蛋 白采用基质辅助激光解吸 电离 飞行 时 间 质 谱 (Matrix—ssisted Laser Desorption Ionization—Mass Sectrometry，MALDI—TOF—MS)测得肽质 量指纹谱(PMF)在数据库 中查询识别的方式鉴定蛋 白质 ，得出的肽段 匹配 图(图 llA)和定性分析得到 的蛋 白匹配分值图(图 llB)。从 图中可以看出测定 的目的蛋 白与 NCBI上大 豆查尔酮合成酶 (CHS)蛋 白的匹配分值为 84，大 于系统 的匹配分值 67(P< 0．05)，可以证明本实验表达的特异性蛋 白是大豆查 尔酮合成酶(CHS)蛋 白。另外 ，苯丙氨 酸解 氨酶基 因的表达产物也得到鉴定 。 2．6 发酵结果分析 对重组菌的发酵提取物进行高效液相色谱测 定，以没有转化质粒的 BI21空 白菌株阴性对照 ，以 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 1028 Chinese Journal ofBiotechnology 生物工程 学报 2007．Vo1．23．No．6 这一旁路来完成异黄酮的合成(图 1虚线所示)。从 基因工程细菌的表达代谢结果看，大豆 PAL也具有 酪氨酸解氨酶活性，可以使酪氨酸脱氨，参与后面反 应生成异黄酮类 物质。这也证 明，在大肠杆菌 中构 建的异黄酮代谢途径实现了由酪氨酸产生异黄酮的 代谢过程。 3．4 表达体系的验证 为了保证表达体系及基因序列的正确性，选择 性的对 5个基因的蛋白质表达进行 了验证。对 PAL 进行重组 表达 和活性鉴定 ，得 到 了酶 比活力 达到 3529~kat／kg的粗酶液 ；上述 的 CHS表达验证结果 表明，表达体系可以正确表达大豆查尔酮基因，表达 产生的 CHS酶也具有相应活性 。所以，所采用的 表达体系是正确的、高效的，这为共表达的成功奠定 了基础。 3．5 重组菌株的发酵表达 通过转基因技术使工程菌代谢产生黄酮类物质 是近年来 国外研究 的一个热点，所利用的工程菌主 要是大肠 杆菌 · ]、酵母 菌 ¨。 。已报道 的相关研 究所用的各基因都来源于不同物种，都没有 实现完 整大豆异黄酮代谢途径在工程菌中的构建。本研究 通过多基因转化技术，将整个异黄酮代谢途径中的 几个关键酶 同时导入到大肠杆菌 中，所有基因都来 源于大豆叶 片。构建 的工程菌具有发酵 L．酪 氨酸 生成新物质的能力 ，所得的新物质通过 HPLC鉴定 可以初步认为是大豆异黄酮类物质。利用质谱等技 术对代谢产物的进一步鉴定实验还在进行中。另 外，在高效发酵菌株的筛选以及发酵工艺和提取工 艺优化的研究方面 ，还需要大量的工作 。 REFERENCES(参考文献) [2] [3] [4] [5] [6] Cao HQ(曹慧青)，Ding JF(丁金凤)．The comtmcti~ strategy of coexpression vector with multi—gene．~urnal of Medical Molecular Biology(国外医学分子生物学 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 )，2002，24(1)：l一4． Effendi L，Yan YJ，Koffas M．Functional expression of a hydroxylase for the biosynthesis of a plant-specific hydroxylated flaonols in Escherichia coli．Metabolic Engineering，2006，8：172—181． Eui 11 H， Masafumi K， ~asuo O ， et a1． Production of plant— specific flavanones by Escherichia coli containing an artificial gene cluster．Applied and Environmental Microbioligy，2003，69(5)： 2699—2706． Brenda W S．Evidence for enzyme complexes in the phenylpropanoid and flavonoid pathways．Physiologia Plantantm ，1999，107：142— 149． Dixon RA， Ferreira D． Molecules in interest genistein． Phytochemistry．2002，60：205—211． So ng T， Barua K， 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