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蛋白质含量测定法.doc

蛋白质含量测定法

chenwu12
2012-02-23 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白质含量测定法doc》,可适用于自然科学领域

http:wwwmaynet附录蛋白质测定法第一法凯氏定氮法钨酸沉淀法本法系通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液中的非蛋白氮含量计算出蛋白质的含量。供试品溶液的制备()总氮测定溶液的制备精密量取供试品ml用生理氯化钠溶液准确稀释至每ml含氮量约mg。()非蛋白氮测定溶液的制备精密量取供试品ml加水ml、钨酸钠溶液ml、硫酸溶液(→)ml,摇匀静置分钟过滤取滤液测定。测定法精密量取总氮测定溶液ml置凯氏定氮瓶中照氮测定法(附录ⅥA)测定供试品中总氮含量。同时做空白对照。精密量取非蛋白氮测定溶液ml置凯氏定氮瓶中照氮测定法(附录ⅥA)测定供试品中非蛋白氮含量。按下式计算CTN(mgml)=(VXV)×c××n×VCNPN(mgml)=(VXV)×c××n×VCPN(mgml)=CTNCNPN供试品蛋白质含量(,gml)=CPN××式中CTN为供试品溶液总氮含量mgmlCNPN为供试品溶液非蛋白氮含量mgmlVX为供试品总氮测定溶液消耗酸滴定液的体积,mlVX为供试品非蛋白氮测定溶液消耗酸滴定液的体积mlV为空白试验消耗酸滴定液的体积mlc为硫酸滴定液的浓度molLCPN为供试品蛋白氮含量mgmln为供试品的稀释倍数V为供试品总氮测定溶液的体积mlV为供试品非氮测定溶液的体积ml为氮的相对原子质量为常数(g氮相当于g蛋白质)。【附注】()供试品蛋白质含量如超过(gml)除蛋白质时应适当加大供试品稀释倍数钨酸钠溶液及硫酸溶液用量相应地按比例增加使溶液中的钨酸浓度仍保持。()总氮测定和非蛋白氮测定可用同一空白对照。三氯醋酸沉淀法(新增)本法系将供试品经三氯醋酸沉淀通过测定该沉淀中的蛋白氮含量计算出蛋白质的含量。测定法精确量取适宜体积的供试品(每ml含蛋白质为mg)于适宜的尖底离心管中加等体积的三氯醋酸(→)混匀静置分钟后离心(转分钟)弃上清用约ml水分数次将沉淀洗入凯氏定氮瓶中照氮测定法(附录VIA)测定供试品中总氮含量同时做空白对照。按下式计算:(VXV)×C××供试品蛋白质含量(mgml)=×V式中VX为供试品消耗酸滴定液的体积mlV为空白试验消耗酸滴定液的体积mlC为硫酸滴定液的浓度molLV为供试品的体积ml。第二法Lowry法本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜蛋白质复合物,此复合物加入酚试剂后,产生蓝色化合物,该蓝色化合物在nm处的吸光度与蛋白质含量成正比根据供试品的吸光度计算供试品的蛋白质含量。试剂()酚试剂取钨酸钠(NaWO·HO)g、钼酸钠(NaMoO·HO)g置ml蒸馏瓶中加入ml水、磷酸ml、盐酸ml上连回流管(使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞)微沸回流小时。取下回流管加入硫酸锂g、水ml、溴液几滴煮沸约分钟驱除过量的溴。冷却加水至ml过滤为酚试剂贮备液。酚试剂贮备液用氢氧化钠滴定液(molL)测定酸浓度然后加水稀释至相当于molL盐酸浓度。()碱性铜溶液取molL酒石酸钾溶液与molL硫酸铜溶液各ml碳酸钠溶液与氢氧化钠溶液各ml摇匀即得。本液应临用配制。()氢氧化钠滴定液(molL)的配制及标定取氢氧化钠适量加水搅拌使溶解成饱和溶液冷却后置聚乙烯塑料瓶中静止数日澄清后取澄清的氢氧化钠饱和溶液ml加新煮沸后冷却的水使成ml摇匀。取在℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约g精密称定加新沸过的冷水ml振摇使其尽量溶解加酚酞指示剂滴用本液滴定在接近终点时应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解滴定至溶液显粉红色。每ml氢氧化钠滴定液相当于mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量算出本液的浓度。标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支用水定量稀释至每ml含mg作为贮备液。精密量取贮备液ml置ml量瓶中用水稀释至刻度摇匀即为每ml含μg的标准蛋白质溶液。测定法精密量取一定体积供试品(含蛋白质μg左右)置试管内加水至ml加碱性铜溶液ml,摇匀室温放置分钟,快速加入酚试剂ml摇匀室温放置分钟显色后照紫外见分光光度法(附录ⅡA)在波长nm处测定吸光度(呈色后如发现浑浊经每分钟转离心分钟后取上清液测定)。精密量取标准蛋白质溶液ml、ml、ml、ml、ml分别置于试管中自“加水至ml”起同法操作。准确量取水ml自“加碱性铜溶液ml”起同法操作作空白对照。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度求直线回归方程将测得供试品的吸光度代入直线回归方程即得供试品的蛋白质含量。第三法双缩脲法本法系依据蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu形成紫红色络合物其颜色深浅与蛋白质含量成正比利用标准蛋白质溶液作对照采用紫外可见分光光度法测定供试品蛋白质含量。试剂双缩脲试剂。取硫酸铜(CuSO·HO)g、酒石酸钾钠(KNaCHO·HO)g、碘化钾g、氢氧化钠g加水溶解并稀释至ml摇匀即得。标准蛋白质溶液的制备精密量取人血白蛋白标准品适量用水定量稀释成每ml含mg的溶液。供试品溶液的制备精密量取适量的供试品加水制成每ml约含mg的溶液。测定法分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各ml置玻璃试管中分别加双缩脲试剂ml混匀置℃水浴中分钟照紫外可见分光光度法(附录ⅡA)在波长nm处测定吸光度。另精密量取水ml自“加双缩脲试剂ml”起同法操作作为空白对照。按下式计算蛋白质含量(mgml)=A×c×nA式中A为供试品溶液的吸光度A为标准蛋白质溶液的吸光度c为标准蛋白质溶液的浓度mgmln为供试品稀释倍数。【附注】本法的测定范围为~mg。

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