和尚麦中抗条锈基因的SSR标记定位研究

第42卷第3期 河南农业大学学报 V01．42No．3 2008年 6月 JournalofHenanAgriculturalUniversity Jun． 2008 文章编号：1000—2340(2008)03—0341—04 和尚麦中抗条锈基因的SSR标记定位研究 代君丽。李洪连 (河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002) 摘要：利用SSR标记技术对小麦农家品种和尚麦中的抗条锈病基因进行了分子标记筛选．在290对微卫星引物 中，发现引物Xwmc216，Xgdml26，Xgwml53，Xbarcl88和Xbarc81在抗亲、感亲和抗池、感池之问有差异．群体 验证的结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，Xwmc216，Xgdml26，Xgwml53，XbarcJ88和Xbarc81与和尚麦中抗病基因连锁，基因和标记 之间的顺序为着丝点一Xwmc216一YrHe·五鲥m126一Xgwm153一Xbarel88一Xbarc81，遗传距离依次为25．7。14．7． 18．4，3．7和5．4cM．根据SSR标记在染色体上的分布，将和尚麦中所含有的抗病基因定位于1B染色体长臂上． 根据该基因在染色体上的位置与抗病谱分析，认为该基因可能是1个新的抗条锈基因．暂定名为yrHe． 关键词：和尚麦；SSR标记；抗条锈基因；基因定住 中图分类号：S512．1 文献标识码：A MolecularMappingofaStripeRustResistance GeneinHeshangmaiWheat DAIJun—li，LIHong-lian (CollegeofPlantProtection，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China) Abstract：AstriperustresistancegeneinnativewheatcuhivarHeshangmaiwastaggedusingRILsde· velopedfromwheatcultivarHeshangmaiandYumai18．Among290wheatmicrosa．telliteprimers，five markersXwmc216，Xgdml26，Xgwml53，Xbarcl88andXbarc81locatedonlBLwerefoundtobe linkedtotheresistancegeneinorderofcentromere·Xwmc216—·YrHe—，Xgdml26．．xgwml53．-Xbarcl88．． Xbarc81withintervalgeneticdistanceof25．7，14．7，18．4，3．7and5．4cMrespectively．Thestripe rustresistancegeneinHeshangmaiwheatwaslocatedonthelongalTnofchromosome1Baccordingto thedistributionofSSRmarkersonthechromosome．Accordingtoitspositiononchromosomeandre— sistancespectrumanalysis，webelievethatYrheisanewstriperustresistancegene． Keywords：Heshangmai；SSRmarker；striperust；genelocation 条锈病是中国小麦生产上最重要的病害之一． 自20世纪初以来，曾有几次大面积的爆发流行，给 小麦生产造成了巨大损失．培育抗病品种是防治小 麦条锈病流行最经济有效的措施．近年来，随着新 的毒性小种条中32号的出现及流行，导致一大批 小麦品种丧失抗病性，发掘新的抗源材料和新的抗 病基因并应用于生产实践已成为当务之急⋯．随 着分子标记技术的发展和应用，利用连锁的分子标 记来确定目的基因在染色体上的位置，已成为小麦 基因定位的重要手段．在多种有效的分子标记中， SSR标记具有多态性水平高，检测到的信息量大， 共显性，操作简单、方便等优点，且具有染色体专化 性。是进行基因定位的理想标记．目前覆盖整个小 麦基因组的微卫星图谱已经建立口。1．根据微卫星 收稿13期：2007—10—05 基金项目：国家粮食丰产科技工程资助项目(2006BAI)02A07一1)；河南农业大学博士基金项目(30400228) 作者简介：代君丽(1977一)，女．陕西西安人，讲师，博士，主要从事小麦病害研究；通讯作者：李洪连． 万方数据 342 河南农业大学学报 第42卷 标记图谱上的位置可以准确的将与其连锁的基因 定位．此外利用微卫星标记，一些以前通过单体分 析定位的小麦抗病基因被重新定位或鉴定．马渐新 等用SSR标记定位了一个来自圆锥小麦的抗条锈 病基因Yr26，找到了与其紧密连锁的SSR标记 Xgwm¨和Xgwml8，根据分子标记定位的结果将 Yr26重新定位在1B染色体的短臂上¨1．农家品 种是丰富小麦遗传变异的潜在基因资源，同时也含 有丰富的抗条锈基因资源．和尚麦是中国小麦地方 品种，通过对和尚麦进行苗期和成株期抗条锈性鉴 定发现，此品种对目前的条锈菌优势小种均表现免 疫至高抗．本研究采用SSR标记技术对小麦农家 品种和尚麦中的抗条锈基因进行了分子标记定位， 以期为小麦的抗病研究及抗病育种提供理论依据． 应程序为94℃5min预变性；94oC变性1min，50 ℃，55℃或60℃退火1min，72℃延伸1min，35 个循环；最后在72℃延伸20rain． 1．2．4PCR结果检测采用质量分数为5％变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定功率50w，银染显色参 照文献[12]．体积分数为10％醋酸固定30rain，蒸 馏水洗3次，每次5min，质量浓度为lg·L“硝酸 银(加体积分数为1．5％甲醛)染色30min，蒸馏水 漂洗15s，还原剂质量浓度为30g·L“碳酸钠 (加体积分数为1．5％甲醛和10g·L。1Na：S：O， 200IxL)显色． 1．2．5 遗传距离的计算 用Mapmaker3．0¨引计 算SSR标记和抗病基因之间的的重组频率．用Ko． sambi函数¨41将重组频率转换为遗传距离(cM)． 1 材料与方法 2 结果与分析 1．1 试验材料 1．1．1供试小麦品种 农家品种和尚麦、推广品 种豫麦18及对照品种铭贤169的种子由中国农科 院品种资源研究所提供．作者利用和尚麦和豫麦 18配制了杂交组合，对F：和F。代进行了抗条锈 性鉴定． 1．1．2 条锈菌小种 条锈菌小种CY27，CY29， CY30，CY31和CY32，由西北农林科技大学植物病 害研究所植物免疫室提供． 1．2试验方法 1．2．1接种鉴定方法于小麦一叶一心期采用涂 抹法接种条锈菌孢子悬浮液，接种后黑暗保湿24 h，然后放人温室，温室温度控制在15℃左右，湿度 控制在80％左右，光照14—15h·d～．对照品种 (铭贤169)充分发病时(接种后15d左右)记载病 害发生的侵染型，侵染型按“0—4”型6级标准记 载‘9‘． I．2．2基因组DNA的提取和抗感池的构建小 麦叶片组织基因组DNA的提取参照文献[10]的 方法．采用分离群体分组分析法(bulkedsegregant analysis，BSA)⋯1，从高代分离群体中选择10个抗 病株系的DNA等量混合构建抗病池，选择10个感 病株系的DNA等量混合构建感病池． 1．2．3PCR扩增及电泳分析PCR反应在PTC一 225PehierThermalCycle上进行．PCR反应总体积 为15恤L(10×PCRbuffer1．5IxL；25mmo]·L“ MgCl21．08斗L；2．5×104mol·L～dNTP0．12斗L； 5×10。U-L一1Taq酶0．12斗L；2ttmol·L一1弓l物 1．2“L；20mg·L“基冈组DNA1．5“L)．PCR反 2．1 和尚麦和豫麦18的抗病性鉴定及其组合高 代材料的抗条锈性遗传分析 2．1．1 和尚麦和豫麦18的抗条锈性鉴定用流 行的条锈菌生理小种CY27，CY29，CY30，CY31 和CY32对和尚麦和豫麦18进行了苗期抗病性鉴 定，结果见表1．从表1可以看出，在对照品种铭贤 169充分发病的情况下，和尚麦对供试的条锈菌小 种仍然表现出很高的抗性．因此，在目前抗条锈资 源缺乏的情况下，可以利用和尚麦作为供体亲本， 培育出抗病性较好的品种． 表1和尚麦和豫麦18对5个条锈菌流行小种 的苗期抗性鉴定结果 Table1 ReactiontypesofHeshangmaiandYumai 18to5racesofPucciniastriiiformisatseedlingstage 2．1．2和尚麦和豫麦18组合F：及Fq代的抗条 锈性遗传分析 表1结果表明，和尚麦对条中32 号小种的侵染型为0；，豫麦18对条中32号小种 的侵染型为4．所以，用条中32号对和尚麦和豫麦 18组合F，代进行了苗期抗病性鉴定(表2)．从表 2可以看出，在鉴定的91株F，代植株中(以反应 型0—2+为抗病，3一～4为感病)，抗病27株，感病 64株．从F，代的抗感分离情况可以看出，较好的 万方数据 第3期 代君丽等：和尚麦中抗条锈基因的SIR标记定位研究 343 符合1：3的抗感比．卡方测验的结果(X2=0．824， P>0．30)也符合1：3的理论比例．说明和尚麦对 条中32号小种的抗性是由l对隐性基因控制． 用条中32号对和尚麦和豫麦18组合F。代的 苗期抗病性鉴定结果表明(表2)，在90个株系中 有37个株系表现抗病，53个株系表现感病，抗和 感比值为1：1．43(理论比值为1：1)，X2=1．389< x：：。=1．642(P>0．20)．此结果也说明和尚麦对 条中32号的抗性是由l对基因 决定 郑伟家庭教育讲座全集个人独资股东决定成立安全领导小组关于成立临时党支部关于注销分公司决定 (表2)． 表2和尚麦x豫麦18组合F：代及F，代材料对蒹中32号的抗病性遗传分析 Table2 Segregationforreactiontoraceofstriperust-CY32inF2andRILsofHeshangmaiand Yumai18atseedlingshge 2．2 和尚麦中抗条锈基因SSR分子标记与染色 体定位 共筛选了290多对Xgwm，Xwmc，Xgdm，Xbarc 引物，其中引物Xgwm153，Xgdm126，Xbarc81， Xbarcl88，Xwmc216在抗亲、感亲和抗池、感池之 间都有差异．群体验证的结果表明，Xgwml53(图 1)，Xgdml26(图2)，Xbarc81(图3)，Xbarcl88， Pr：和尚麦．Ps：豫麦18，R：抗株系，s：感株系．M：标准分子量DNA PBR322／MSPImarker Pr：Heshangmai，Ps：Yumail8．R：Resistantplants，S：Susceptible plants．M：StandardmolecularwetghtDNAPBR322／MSPImarker 图1 引物Xgwml53在和尚麦和豫麦18组合高代群体 材料部分株系上的扩增结果 Fig．1AmplificationresultofHeshaogmai。 Yumai18andselectedindividualsofthe F9populationwithXgwm153 Xwmc216与抗病基因相连锁．引物Xgwm153的多 态片段大小为R：183bp，187bp，213bp／S：180 bp，190bp，238bp；引物Xgdml26的多态片段大 小为R：198bp／S：203bp；引物Barc81的多态片 段大小为R：195bp／S：190bp；引物日。厂d88的多 态片段大小为R：270bp，282bp，238bp／S：272bp， 277bp，217bp；引物Xwmc216的多态片段大小为 127bp． Pr：和尚麦．P5：豫麦18，R：抗株系，s：感株系，M：标准分子量DNA PBR322／MSPImarker Pr：Heshangmai．Ps：Yumai18。R：Resistantplants．S：Susceptible plants，M：StandardmolecularweightDNAPBR322／MSPImarker 图2引物Xgdml26在和尚麦和豫麦18组合商代群体 材料部分株系上的扩增结果 Fig．2AmplificationresultofHeshangmai．YumailS andselectedindividualsoftheF，populationwithXgdml26 Pf：和尚麦，P8：豫麦18，R：抗株系，s：感株系．M：标准分子量DNA PBR322／MSPImarker Pr：Heshangmai，Ps：Yumai18，R：Resistantplants，S：Susceptible plants，M：StandardmolecularweightDNAPBR322／MSPImarker 图3 引物Xbarc81在和尚麦和豫麦18组合高代 群体材料部分株系上的扩增结果 Fig．3AmplificationresultofHeshangmai．Yumai18 andselectedindividualsoftheF，populationwithXbarc81 万方数据 河南农业大学学报 第42卷 (还有1条大小为125bp的公共带)．这些多态性标 记位于1B染色体长臂上，根据Mapmaker作图的结 果表明，和尚麦中所含有的抗病基因位于标记Xwmc 216和Xgdml26之间，由此可以推知，和尚麦中所含 有的抗病基因位于1B染色体长臂上，暂定名为 YrHe．基因和标记在染色体上的顺序为着丝点一Xwmc 216--YrHe--Sgdm126--Xgwm153--Xbarc188··Xbarc81 (图4)． 1 8．4cM 3．7CM 5．4cM Xgdml26 】BL 围4在小麦1B染色体上抗条锈基因YrHe 及其连锁的微卫星标记遗传连锁图 Fig．4Geneticlinkagemapofstriperustresistancegene 17坩eandlinkedmicrosatellitemarkersOilchromosome1BL 3 讨论 1)和尚麦中所含有的抗条锈基因可能为新基 因．已知位于1BL上的抗条锈基因有2个基因，分 别为Yr21和Yr29．Yr29为成株抗条锈基因，而本研 究中所用的材料和尚麦在苗期对供试的小种表现 免疫一近免疫反应，由此可以推知和尚麦中所含的 抗病基因不同于Yr29．Yr21来自于国外的春小麦 Lemhi，属于显性抗病基因，而和尚麦是来自于中 国江苏省的地方品种，是隐性抗病基因，由此可推 知，和尚麦中所含的抗病基因不同于Yr21．目前还 没有Yr29和Yr21的作图数据，无法推知它们在图 谱上的关系．和尚麦中所含有的抗条锈基因是否是 Yr29和Yr21的等位基因，还必须通过等位性测验 来验证．马渐新¨纠找到了和尚麦连锁的SSR标记． XgwmJj和Xgwml8，但在本研究中发现，XgwmlJ 和Xgwml8在亲本之间存在多态性，但在抗感池之 间不存在多态性，说明本研究中所用的抗病材料和 尚麦和马渐新所用的材料不同，属于同名异质材 料． 目前在抗病育种中多利用的是显性主效抗病 基因，由于隐性抗病基因在早代多表现为感病，不 便于在早期选择，因此对隐性抗病基因的利用相对 较少．但是隐性性状不会在后代中发生分离，便于 抗病性状的固定．因此在当前的抗病育种中应该兼 顾显性基因和隐性基因的作用． 2)SSR标记分析．大多数情况下，SSR标记呈 共显性遗传，但在本研究中标记Xwmc216呈显性遗 传，检测到的是抗病性相关带，即在抗病亲本和抗 病株系中有扩增带，而感病亲本和感病株系中无扩 增带．出现这种显性遗传方式的可能原因是由于 SSR序列两端引物结合位点的变化或引物位点靠 近微卫星序列，抑制了引物的结合或完全阻止了这 种结合所造成．SSR引物是根据SSR序列两端的 保守域 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的，汤继凤¨叫研究发现，SSR序列的两 端并不一定是保守的，也有一定的变化，这种变化 可能导致了引物结合位点的变化，从而出现显性遗 传方式． 通过本研究发现农家品种和尚麦对目前条锈 菌优势小种条中32号的抗病基因是位于1B染色 体长臂上，并且发现此抗条锈基因不同于已知的位 于lB染色体长臂上的抗条锈基因，可能为新的抗 条锈基因，在目前抗条锈基因资源匮乏的情况下， 可以为抗条锈育种提供新的有效的基因资源．但在 本研究中仅采用了SSR标记类型，每条染色体上 SSR标记的数量是有限的，所以寻找与抗病基因紧 密连锁或完全连锁的SSR标记受到限制，因此还 需要开发或利用其他的标记类型，构建抗病基因的 精细遗传图谱，为抗病基因的分子标记辅助育种和 抗病基因克隆奠定基础． 参考文献 [1]万安民，赵中华，吴立人．2002年我国小麦条锈病发 生回顾[J]．植物保护，2003，29(2)：5—8． [2]RODERMS，KORZUNV，WENDEHAKEK．eta1．A microsatellitemapofwheat[J]．Genetics，1998，149： 207—223． [3]STEPHENSONP，BRYANG，KIRBYJ，eta1．Fifty newmicrosatellitelociforthewheatgeneticmap[J]． TheorApplGenet，1998，97：946—949． [4]PESTSOVAE，GANALMW，RODERMS．Isolation andmappingofmicrosatellitemarkersspecificfortheD genomeofbreadwheat[J]．Genome，2000，43：689— 697． (下转第349页) Ⅲ 舳 ，=一 万方数据 第3期 周鹤峰等：根癌农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化条件的研究 349 [6] [7] [8] 出版社。2002：742—744． DUCREUXLJ。MORRISWL，TAYLORMA。eta1． Agrobacterium—mediatedtransformationof Solanum phureja[J]．PlantCellRepots，2005，24(1)：lo一14． 程振东，卫志明，许智宏．根癌农杆菌对甘蓝型油菜 的转化及转基凶植的再生[J]．植物学报，1994，36 (9)：657—664． ZHANGX，HENNIQUESR，LINS S，eta1． 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