PCR技术的原理和应用

nullPCR技术的原理和应用PCR技术的原理和应用Polymerase Chain Reaction主要内容主要内容PCR原理与特点 PCR在生物医学研究中的应用 第一部分 PCR原理与特点第一部分 PCR原理与特点PCR (Polymerase Chain Reaction)PCR (Polymerase Chain Reaction)1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功实验发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在《Science》上 发 表 1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术 PCR原理与特点PCR原理与特点　　　　　　　　　　　PCR: Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应一种选择性体外扩增DNA片断的技术 广泛应用于生物医学的研究中 是分子生物学的主流技术，是所有扩增技术中 应用范围最广的一种技术。 PCR原理与特点PCR原理与特点　　　　　　　　　　　PCR反应过程 1.变性(denature) 加热使双链DNA变成单链DNA 2.退火(annealing) 降温使引物与 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 结合形成模板－引物复合物 3.延伸(elongation) 耐热聚合酶作用下合成新的DNA链 nullPCR 循环 第一步 － 变性 （９３～９８℃）PCR循环PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃）PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃）PCR循环PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃）PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃）PCR循环第一个 PCR 循环 － 靶序列完成复制第一个 PCR 循环 － 靶序列完成复制PCR循环null 循环次数 DNA的链数 1 　 21 2 2 　22 4 3 　 23 8 10 　 210 1024 20 　220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿 PCR循环次数与DNA产量关系PCR循环PCR特点：高效扩增、忠实复制理论上：Yn=X·２n 理论上：Yn=X·２n J型 PCR循环nlogYnnull　　　　　　　　　　　PCR反应体系 模板(DNA or RNA)(template) 　DNA 耐热聚合酶(Taq polymerase) 一对引物(primers) 　脱氧核苷酸（dNTPs） 　反应缓冲体系(reaction buffer) PCR促进剂 null 灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量 PCR反应的特点nullPCR扩增产物的分析方法1、凝胶电泳分析法 琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法null琼脂糖凝胶电泳图nullPCR扩增产物的分析方法1、凝胶电泳分析法 琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法null主要PCR类型常规PCR 荧光定量PCR 原位PCR RT－PCR 多重PCR PCR－SSO 和 PCR－SSP 荧光定量PCR原理 Fluorescence Quantitative PCR荧光定量PCR原理 Fluorescence Quantitative PCR以 外 参 或 内 参 为 标 准，通 过 对 PCR终 产 物 的 分析 或 PCR 过 程 的 监 测，对 PCR 起 始 模 板 量 进行 定量。FQ-PCR荧光探针： 　TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon 荧光染料： 　　　　　 SYBR Green I、Eva Green结果结果每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 FQ-PCRnull定量PCR与定性PCR的本质区别定量PCR与定性PCR的本质区别PCR循环 常规PCR技术的不足　操作相对复杂，不安全 　扩增产物污染引起的假阳性 　只能定性不能定量 　不能揭示核酸水平与疾病发生发展的相关性 一、闭管化学，污染机会少。 二、实现真正的样本核酸准确定量。 三、宽广的动力学范围，无需梯度稀释。 四、探针使用，特异性更强。 五、光谱分析，敏感性更高。 六、高度自动化， 操作简单，无需后处理。 荧光定量PCR主要优点null荧光阈值 (threshold ) 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 。 　 荧光信号超过荧光背景，开始增加，进入指数扩增期时。 Ct 值 (Cycle，threshold ) 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。FQ-PCR与结果分析相关的两个重要概念： 荧光阈值与Ct值Ct值的意义Ct值的意义Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次扩增FQ-PCRCt值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同 Ct值 原始拷贝数 ?Ct值 原始拷贝数 ?Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 FQ-PCRnull1.原位PCR (in situ PCR) 把原位杂交的细胞定位技术与PCR扩增相结合的技术，主要用于基因的细胞定位、组织分布和基因表达的检测 2.反转录PCR （RT－PCR） 以mRNA为模板，通过反转录产生的cDNA为模板进行PCR扩增 3.多重PCR (multiplex PCR) 多对引物在同一个PCR反应体系中同时扩增几个不同靶区域的PCR扩增技术 null4.PCR－SSP 和 PCR－SSO 特异性引物PCR (PCR-SSP): 采用序列特异性引物进行PCR扩增的基因多态分析技术，主要用于多态性基因的分型 特异性探针PCR (PCR-SSO) 通过基因特异性的寡核苷酸探针与PCR扩增产物杂交 null第二部分 PCR在生物医学研究中的应用一、PCR技术在生物研究中的应用1)构建cDNA文库 2)基因突变检测 3)基因表达量检测 4)DNA序列多态性分析 5)DNA片断长度多态性分析 一、PCR技术在生物研究中的应用PCR技术在生物研究中的应用1)构建cDNA文库 mRNA提取--反转录合成单链cDNA—PCR扩增—cDNA克隆 2)基因突变检测 基因突变包括点突变、插入、缺失、重排和基因扩增等 方法包括：PCR-SSO, PCR-SSCP, PCR-RFLP, 3)基因表达量检测 用于检测细胞中基因表达量的测定 常用方法：荧光定量PCR PCR技术在生物研究中的应用PCR技术在生物研究中的应用4)DNA序列多态性分析 通常指单一基因位点上不同个体间等位基因的多态性以及单核苷 酸多态性 常用方法：PCR-SSO, PCR-RFLP, PCR-DHPLC 5)DNA片断长度多态性分析 通常指单一基因位点上，不同个体间等位基因片段长度的不同， 主要分为VNTR(variable number of tandem repeats)和 STR(short tandem repeat) PCR技术在生物研究中的应用二、PCR技术在临床医学的应用1)传染性病原体的检测 2)遗传病的分子诊断 3)肿瘤的诊断和疗效检测 4)血库血液筛查 5)药物遗传学和个体化治疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 二、PCR技术在临床医学的应用1.荧光定量PCR在病原体检测中的应用1.荧光定量PCR在病原体检测中的应用一、肝炎病毒定量检测 二、性病病原体检测 三、结核杆菌及呼吸道病原体检测 四、优生优育(TORCH)相关项目检测 临床应用null应用价值 建立新的病原体分子诊断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 评价和考核治疗效果。 用于传染病发病的监控、预测与预防。 体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。 新的药物及疗法的研究与开发。null传染性病原体的检测 a)肝炎病毒（HBV，HCV） b)HIV c)HPV d)CT/NG/UU e)TORCH f)呼吸道系列（流感，副流感，RSV等） 2. 遗传病的分子诊断 2. 遗传病的分子诊断 遗传学认为健康是人体遗传物质控制的代谢方式与人体周围环境之间保持的平衡。 未来的医学是遗传医学，未来的保健是遗传保健。 近十几年来分子生物学领域日新月异的进展为基础科研成果应用于临床疾病检验和治疗奠定了坚实基础。 遗传病分子诊断的应用范围遗传病分子诊断的应用范围 产前诊断(prenatal diagnosis) 新生儿筛查(newborn screening) 携带者筛查(heterozygote screening or carrier screening) 遗传预测(presymptomatic screening or predictive screening) null遗传病 1. 等位基因检测 2. 多基因遗传病的突变检测 3. 基因表达异常所致遗传病检测 null荧光PCR的作用： 可对原癌基因的突变和易位等作出检测； 可对原癌基因的mRNA进行定量分析； 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断； 探索癌变发生机理的研究提供参考； 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。 肿瘤的诊断肿瘤发生的分子机理肿瘤发生的分子机理癌基因的突变、扩增和调控失效 myc, ras, her-2 抑癌基因的突变 p53, RB 染色体异常(缺失、重排等） CML-费城染色体 t(9:22) 大肠癌－17，18染色体缺失 肿瘤分子诊断的研究内容肿瘤分子诊断的研究内容 肿瘤早期诊断及病程进展、转移和复发中的监测和癌前病变的辅助诊断中的作用 对肿瘤生物学行为进行判断（包括恶性程度，对放疗、化疗敏感性及耐药性等），指导临床进行个体化治疗 遗传缺陷的鉴定：肿瘤的遗传易感性（genetic susceptibility）。 药物遗传学概念药物遗传学概念 药物遗传学概念： 药物遗传学的研究主要集中在对药物代谢的遗传变异和编码药物代谢酶基因的多态性分析,从而决定药物的合理选择和使用剂量,以期得到最佳的治疗效果和避免严重的毒性反应。 “世界卫生组织：人类死亡1/3不是疾病所致，而是长期用药的毒副作用引起。”null 药物代谢酶多态性：细胞色素P450 药物转运蛋白多态性：P糖蛋白 药物作用靶位多态性：β肾上腺素能受体药物遗传学检测null 1.亲子鉴定 2.法医物证 3.PCR-RFLP技术的法医学应用 4.罪犯鉴定 法医鉴定null