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植物组织培养技术(三)

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植物组织培养技术(三)null第七章 愈伤组织(callus)的形成和形态发生 第七章 愈伤组织(callus)的形成和形态发生 一般情况下,植物组织均能诱发形成愈伤组织; 由外植体形成愈伤组织,标志着植物组织培养的开始。一、愈伤组织的诱导一、愈伤组织的诱导利用植物组织培养技术,促使细胞脱分化的过程。1 诱导的实质:2 诱导涉及的主要组成成分:1) 外植体A 外植体的选取-----根据不同的培养目的如为获得愈伤组织,可取植株茎的切段、叶、根、花和种子,或把 其中的某些组织切成片或块状,接种到培养基上即可;如要要定量地研究愈伤组织的...

植物组织培养技术(三)
null第七章 愈伤组织(callus)的形成和形态发生 第七章 愈伤组织(callus)的形成和形态发生 一般情况下,植物组织均能诱发形成愈伤组织; 由外植体形成愈伤组织,标志着植物组织培养的开始。一、愈伤组织的诱导一、愈伤组织的诱导利用植物组织培养技术,促使细胞脱分化的过程。1 诱导的实质:2 诱导涉及的主要组成成分:1) 外植体A 外植体的选取-----根据不同的培养目的如为获得愈伤组织,可取植株茎的切段、叶、根、花和种子,或把 其中的某些组织切成片或块状,接种到培养基上即可;如要要定量地研究愈伤组织的发生,则要考虑外植体的一致性,包括植物材料的来源、大小、形状、生理部位等,常选用组织块较大的材料,如胡萝卜的贮藏根等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、适合于培养的外植体。B 外植体的制备B 外植体的制备外植体的灭菌处理; 对灭菌后的外植体进行修整。除去所有坏死的组织,将材料切成5mm厚度的圆柱形或方形小块。应注意把握组织块的大小,太大会增加染菌的机会,太小又会增加损害完整细胞的比例使之难以发生细胞分裂,且不易操作。一般情形下,每9cm培养基上,接种5-6块外植体。C 外植体的接种多数直接放置在培养基上null外植体的体积应尽可能小,从而得到较大数量的外植体。圆柱体的表面积大,利于组织块和外界气体和营 养物的交换。外植体的损伤表面分泌物,具有促进愈伤组织形 成的能力,因此表面积越大,产生分泌物数量也 越多,愈伤组织的得率也越高。2)植物生长调节物质2)植物生长调节物质常用的生长素是:2,4-D,IAA,NAA; 常用的细胞分裂素是:KT,6-BA。 在多数情况下用2,4-D就能成功诱导愈伤。通常情况下,诱导愈伤组织的培养基中都含有植物生长调节物质。3 愈伤组织形成的条件愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类,而是 培养条件,其中激素的种类和浓度最为重要。二、愈伤组织形成的过程二、愈伤组织形成的过程 外植体中已分化的活细胞,在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织。 从单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织,这一过程被大致划分为三个时期(诱导期、分裂期和形成期)。null接种的外植体的细胞通常处于静止状态,因为它们都是成熟细胞。 在诱导期,通过一些刺激因素和激素的诱导作用,使细胞合成代谢活化,细胞内物质代谢旺盛,但是细胞大小和形态没有多大变化,所以外观无明显特征。 诱导期的长短,因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异,如胡萝卜的诱导期要好几天,新鲜的菊芋块茎则只要22h。 生长在不同关照条件下的植株,对其诱导分裂的难易程度也不一样。一般生长在弱光下的植株比生长在强光下的植株的外植体易于诱导分裂,且分裂频率高。 1 诱导期:细胞正在准备进行分裂的时期null分裂期是指细胞脱分化,不断增生子细胞而形成愈伤组织的过程。 外植体在细胞分裂期间,其形态结构和生理生化都发生显著变化。 1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后,细胞数可增加10倍。 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。 3.细胞体积小,内无液泡,如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。 4.细胞的核和核仁增大到最大。 5.细胞中RNA含量减少,而DNA含量保持不变。 6. 随着细胞不断分裂和组织生长,细胞的总干重、蛋白质和 核酸含量大大增加,新细胞壁的合成极快。2 分裂期:细胞从开始分裂到持续分裂的时期分裂期分裂期null细胞分裂快,结构疏松,缺少有组织的结构,颜色浅而透明处于分裂期愈伤组织的共同特征是:外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别, 如烟草、胡萝卜等脱分化较易,而禾谷类的脱分化较难;花器脱 分化较易,而茎叶较难;幼嫩组织脱分化较易,而成熟的老组织 较难。注意:null进入形成期后,细胞的体积不再减少,并保持相对稳定。 细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂,结果形成瘤状或片状的拟分生组织。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心,或者进一步分化为维管组织。 出现了各种类型的细胞。3 形成期:细胞停止分裂,出现形态和功能各异的细胞的时期。null分化期三、愈伤组织的培养三、愈伤组织的培养1 培养基2 愈伤的培养方式:MS培养基+2,4-D培养分为固体和液体培养两大类。 液体培养又分静止和振荡培养的二类。 3 继代培养(传代):3 继代培养(传代):愈伤组织在培养基上生长一段时间以后,由于营养物质枯竭,水分散失,以及代谢产物的积累,必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代。 通过继代培养,可使愈伤组织无限期地保持在不分的增殖状态。然而,如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代,它们则不可避免地发生分化,产生新的结构。 一般在25-28℃下进行固体培养时,每隔4-5周进行一次继代培养。null 继代培养必须及时进行,长期不传代常常由于代谢产物的累积,对组织起毒害作用,某些植物愈伤组织的褐化现象即往往由此引起的。褐化的愈伤组织反复地进行继代培养,可使愈伤组织恢复活力而迅速生长。组织块较小时,继代培养时可将整块组织转移。组织块较大时,可先将组织分成几小块再接种。 理论上愈伤组织是可以无限制继代,但愈伤组织继代次数增加,形态发生能力逐渐丧失。null原因:遗传因素即继代培养中通常出现染色体紊乱。如多倍体和非整倍体null1)光照:愈伤组织的诱导需弱光或不需光,分化需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。 2)温度:一般采用24~28℃的恒温条件进行。 3)湿度:较大,以免引起培养基干缩。 4 培养条件四 、愈伤组织的增殖方式 四 、愈伤组织的增殖方式 一般来说,愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面,而与琼脂接触的一面极少细胞增殖,只是细胞分化形成紧密的组织块。它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。 愈伤组织之间的质地有显著不同,有的很松脆,有的很坚实,且这两类愈伤组织可互相转变。其 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 是:加入高浓度的生长物质,可使坚实的愈伤组织变为松脆。反之,减低或除去生长物质,则松脆的愈伤组织可以转变为坚实。 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色,有光泽,也有淡绿色或绿色的;老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。 nullCallus may be heavily lignified (木质化)and hard in texture, whereas others break easily into small fragments(fri able). 五、 愈伤组织的形态发生方式 五、 愈伤组织的形态发生方式 愈伤组织分生细胞团可进行再分化,即进行形态建成,可再产生完整的植株。 形态建成:外植体在适宜的培养条件下经脱分化、分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。 null指细胞或愈伤组织培养物,通过形成不定芽或根再生成植株,这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。 愈伤组织的器官发生顺序有四种情况:(1)愈伤组织中有根或芽器官的分别形成,即无根的芽或无芽的根;(2)先形成芽,再在芽伸长后,在其茎的基部长出根而形成小植株,多数植物属这种情况;(3)先产生根,再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成,尤其对于单子叶植物;(4)先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根,然后两者结合起来形成一株小植株。 在组织培养中,从外植体形成器官或无性系的形态发生,有下面 两种方式:1.不定芽和根的发生。null外植体高生长素(2,4-D)脱分化形成愈伤组织再分化分化成芽分化成根形成完整植株高(细胞分裂素/生长素)低(细胞分裂素/生长素)生长物质控制器官分化的模式图2.胚状体的发生。2.胚状体的发生。指由培养细胞诱导分化出的似胚芽、胚根、胚轴的胚状结构,进而长成完整植株。 胚状体形成完整植株,与不定芽和根发生相比,有以下三个特征: 1)具有两极性,即在发育的早期阶段,从其方向相反的两端分化出茎端与根端,而不定芽或不定根都为单向极性; 2)胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系,而不定芽或不定根往往是与愈伤组织的维管组织相联系; 3)胚状体的维管组织的分布是独立的Y形,而不定芽的维管组织无此现象。 在胚状体发生过程中,培养基中的氮源、植物生长物质对其形成十分重要。 小结小结 细胞和愈伤组织的形态发生,主要受外植体本身、培养基和培养环境等三大类因素的调控。 六、愈伤组织状态的调控六、愈伤组织状态的调控1.  高度的胚性或再分化能力,以便从这些愈伤组织得到再生植物。 2.  容易散碎,以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系,并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。 3.  旺盛的自我增殖能力,以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。 4.  经过长期继代保存而不丧失胚性,有便有可能对它们进行各种遗传操作。 来源于不同植物或同一种植物不同部们的愈伤组织,在颜色、结 构和生长习性上都可能存在差异,其遗传生理功能也可能或是具 有胚性,或是不具胚性,在不同的实验中由于目的的不同,对愈 伤组织状态的要求也不完全相同。1 优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2-3个:null1.遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同,如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成,而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。 2.器官和部位 通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织,无论在生理上或形态上,其差别均不大。但是对有些植物而言,确有明显差异。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗,水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。 3.年龄 年龄较幼的外植体,不仅易于诱导形成愈伤组织,而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明,下部的器官形成频率低,愈入上部,苗的分化频率越高,苗分化频率越低。因此在组织培养中,要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养,可大大提高苗的分化频率。 (一)材料本身 2 诱导愈伤组织时通常采用的策略null 培养基的各种成分和物理性质,都对器官发生产生一定影响,但起决定作用的仍然是植物生长调节剂,特别是生长素和细胞分裂素的配比。 1.生长调节剂 细胞分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件之一,生长素对芽的抑制作用可为细胞分裂素所克服。细胞分裂素/生长素比例高时有利于芽形成;而这一比例低时,有利于根的形成。这样通过变换激素的种类和浓度,即可有效地调节培养组织的器官分化。 但是,要注意的是不同的生长素和细胞分裂素,对生根和长芽的效果是不同的。如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效果好,但用IAA和IBA处理,产生的根比较健壮,而用NAA处理,产生的根则较纤细。2,4-D往往对生根不利,特别是在较高浓度下。Kt和BA能广泛地诱导芽的形成,但BA比Kt的效力大。玉米素的作用范围较窄,但对某些植物有特效。因此,往往多数植物采用BA 和Kt来诱导芽的形成。 (二)培养基null2.无机营养元素 在植物组织培养中和整体植物一样,细胞的生长也要求满足植物生长的必要元素,若完全投入或过多或不足,也会影响细胞生长和分化。不过其影响不如激素的影响明显。但是各种类型的植物,器官所需要的每种元素的量,特别是大量元素是有区别的,如生根培养要求无机离子浓度小一些,所以常用1/2MS或White。如有些植物要求的氮,以硝酸态形式供应为佳;而有些植物要求的氮,以铵态氮的形式供应为佳。 当某些营养元素的供应不足时,愈伤组织所表现出来的症状如下: 氮——某些组织(如五叶地锦)表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色;不能形成导管。 氮、钾和磷——细胞过度生长,形成层组织减退; 硫——非常明显地褪绿。 铁——细胞分裂停止。 硼——细胞分裂停滞,细胞伸长。 锰或钼——影响细胞伸长。 null3.有机成分 在培养基中加了糖各类B族维生素、肌醇和甘氯酸等,可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。各中氯基酸和嘌 呤、嘧啶类物质,可以促进器官分化。其中酪氨酸可明显增加烟草组织培养的器官形成。酰胺类往往有促进器官形成的作用。水解酪蛋白中含有多种氨基酸,在进行器官分化培养时,加入一定量是有益的。 null4. 物理性质 培养基的物理性质(固体或液体状态,渗透压等)对形态发生有明显的影响。在胡萝卜和石刁柏的培养过程中,需要改变培养基的形式,才能顺利地分化出苗。其方法是:第一阶段诱导形成愈伤组织,应在固体培养基上进行培养;第二阶段细胞和胚状体的增殖,需在液体培养基中完成;第三阶段由胚状体发育成可移植的植株,又应转移到固体琼脂培养基上进行培养。 培养基中的渗透压,对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响,在花药培养中受到普遍的重视。如油菜花药培养宜先在高糖(9-10%)培养基中培养,有利于细胞增殖和胚状体的形成。 null1.光周期的影响 光周期的需要与否,应根据植物种类培养目的来决定。 在愈伤组织诱导阶段,一般采用三种做法:全暗、周期性光照、散射性光照,上述两种做法诱导率差异不大。另一些植物差异较大,如石刁柏全暗诱导愈伤组织,要比周期性光照下好得多。大豆愈伤组织诱导采用散射性光照比较好;光照对地钱干重的增加明显地优于黑暗培养。 器官发生阶段,一般给予周期性光照比较好。光周期长短因植物种类而异。多数植物8-10小时黑暗为宜。如茄子、苹果等。也有例外,有些植物如石刁柏需要16小时光照,12小时黑暗。(三)培养环境条件null 2.温度 在组织培养中,一般都采用22-25℃的恒温条件下进行外植体的培养。对一般植物来讲,都可较好地形成芽和根。但是很多资料表明 ,温度高低对器官发生的数量和质量仍有影响。如对喜温性植物如茄科、葫芦科、兰科、禾本科等的培养温度一般可控制在26-28℃比较适宜。而对于冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等植物则培养温度可控制在25℃以下较为适宜。 培养周期中的昼夜温差,至今,多数植物离体培养,均采用恒温培养。而国内有关小麦、水稻花药培养温度试验的报道认为:在诱导花形成愈伤组织时,昼夜恒温较好,而在器官分化时,昼夜具有一定温差比较好,分化出的小植株比较健壮。菊芋试验也有类似的报道。 七 愈伤组织培养的应用七 愈伤组织培养的应用 愈伤组织培养作为一种最常见的培养形式,除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外,其他几种培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生再生植株,而且,愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源,因此,愈伤组织培养具有多种用途。 可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律,对植物遗传育种具有特殊意义; 可用于大规模工厂化生产有用化合物,或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系,或用于原生质体培养中的原生质体来源等。愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用加快了园艺植物新品种和良种繁育速度,特别是对于无性繁殖的果树、观赏树木等; 培养无病毒苗木,这在香蕉、马铃薯、柑橘、草莓等植物上均得到了成功应用; 获得倍性不同的植株,这对于无性繁殖园艺植物的育种,具有较大的利用价值; 克服远缘杂交困难; 利用种质资源长期保存和远距离运输,应用组织培养保存种质资源具有节约土地、人力、物力,手续简单,便于交流; 诱发和立体筛选突变体; 制造人工种子,为某些濒危和珍贵物种的繁殖,提供一种高效手段。练习练习名词解释:愈伤组织培养、细胞全能性、外植体、脱分化、在分化、胚状体 愈伤组织培养对外植体有何要求? 使用植物生长物质应注意些什么? 愈伤组织的形态发生有哪两种情况?并比较各自形成的完整植株有何不同? 简述愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用。
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