Bio-Plex悬液芯片系统简明使用教程(2008修订版)

Bio-Plex 悬液芯片系统简明使用教程 （2008修订版） Bio-Plex 悬液芯片系统 一、仪器名称：Bio-Plex 悬液芯片系统 二、规格型号：Bio-Plex 200 System 三、生产厂家：Bio-Rad Laboratories, Inc 四、产品简介 人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 （HGP）的完成和蛋白质组计划（HPP）的启动，获得了数量巨大的基因和蛋 白质信息，而要对如此庞大的信息进行全面的处理和研究，必须 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 和利用更为高效的硬件和软件 技术，建立新型、高效、快速的检测 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方法。生物芯片正是在这种背景下应运而生，其不仅在高 通量基因测序、基因表达研究、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用，也将在临床诊断中占据重要 地位[1]。液相芯片（liquichip）是新一代生物芯片技术，既能为后基因组时代科学研究提供强大的技 术支持，又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。 Bio-Plex 悬液芯片系统将先进的软件包、系统检验工具、微球耦联试剂和即用型细胞因子与磷 酸化蛋白测试试剂整合在一起，使硬件、软件和检测试剂形成一个功能强大的芯片技术平台，大大 提高了结果的精确性和可重复性，使用更加简便高效。该系统为蛋白与核酸研究人员提供了灵活的 复合测试方案，可在单个样品中同时分析多达 100 个生物分子。利用 100 种不同颜色微球（xMAP 技术）标记生物分子配体，每个微球可耦联一个对应不同靶分子的特异反应物。反应物可以是酶底 物、受体、抗原或者抗体。检测范围 0.2-3200pg/ml 或 1.95-32000 pg/ml， 自动的校正和校验工具可 以保证样品间差异、板间差、系统间差异控制在 10%以下，30 分钟可以完成 96 个样品的检测并获 得多达 10,000 个分析数据。多重检测获得的数据可以完全揭示生命分子的相互关系及信号传导途径。 [1] Hulse R E, Kunkler PE, Fedynyshyn J P, et al. Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue. J Neurosci Method, 2004, 136: 87-98. 五、技术原理 1、芯片原理：Bio-Plex 悬液芯片的核心技术是把微小的颗粒亦称微球（bead 或 microsphere）分 别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白质或寡核苷酸探针以共价的方式吸附到不同 颜色的微球上。微球直径为 5.6um，其制作过程按照严格的搭配比例掺入两种不同的红色分类荧光 染料，根据比例不同可以把球型基质分类为 100 种，每种标上不同的探针分子，从而可以对一个样 本中多达 100 种不同的目的分子进行同步检测。 在液相蛋白芯片中，先把针对不同检测物的不同颜色微球混合，然后加入被检测物，在悬液中 微球与被检测物特异性结合，并加上荧光标记。由于多种颜色微球可以放在同一反应体系中，所以 可以同时对一份标本的上百个指标进行检测。在液相基因芯片中，待测核酸可在聚合酶链式（PCR） 扩增中直接加入荧光标记，经过与微球反应后可进行检测。 2、检测原理： 如上图所示，微球被鞘流液体传送系统排成单列通过两束激光，一束判定颗粒的颜色（分类激 流动池 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 激光 532nm 分类激光 635nm 光电倍增管 光）从而决定被测物的类型和性质（定性），另一束（报告激光）测定颗粒上的荧光标记强度，从而 决定被测物的量（定量）。所得信号经过光电倍增管后经电脑处理，所得数据可以直接用来判断结果。 两束激光分别分析微球上的荧光颜色（特异性）和杂交信号（敏感性），而且激光只分析颗粒一定半 径的信息，所以检测特异性强，信躁比高，背景低。 六、结构组成 七、仪器操作规程 1、MCV 板介绍：MCV 板是用于维护（maintenance）、校正（calibration）和校验（Validation） 的操作板，大小与一般 96 孔板相同，如下图所示： 左上角两小孔用于 Calibration（仪器校正），箭头所示的右边部分用于 Validation（校验）。仪器 的每一步操作在屏幕上都有 MCV 板的黄色闪烁操作提示，则在进行操作前必须在闪烁部分加 入 MCV 板上提示的试剂。 2、开机： 注意：如果没配 HTF，在开机前必须确认鞘流液瓶的鞘流液已经充满（液位在上端出口下）， 废液瓶必须倾空，并确认两个瓶子与仪器连接完好。如果配有 HTF 的机器，必须检查鞘流 液桶的鞘流液是否足够。 打开仪器电源，点击电脑桌面的 Bio-Plex Manager 按钮 ，进入软件界面。 3、Start up 和仪器预热（warm up）：点击工具栏上的 Start up 按钮 ，在弹出的窗口中按照 黄色闪烁提示将相应的试剂加入到 MCV 板中，如下图所示，点击该窗口下方的 Enter/Retract Plate 键，弹出微孔板平台，将 MCV 板平放在平台上，再按 Enter 按钮，将 MCV 板推进仪器中，最后按 OK 按钮确定，开始进行 Start Up。 用于 Calibration 用于 Validation Start up 结束后，点击工具栏上的 按钮，将 MCV 板取出，然后开始进行仪器预热，点击工 具栏上的 预热按钮，仪器开始自动预热，一般预热 30min。 4、校正（Calibrate）：预热结束后进行仪器校正，点击工具栏上的 校正按钮，屏幕弹出如 下窗口： 输入用户名，选择 Calibrate kit 的批号（Control Number），CAL1 和 CAL2 的批号在 Calibrate kit 的 瓶子上都有显示，点击该窗口上的 Add 按钮将该数据输入电脑，如果已经输好，只需选择即可。 注意：如果是 Bio-Plex Manager 4.1 或以下版本软件，在选择 CAL2 的 Control Number 时要确定当次 检测的灵敏度范围，选择 High RP1（高灵敏度，0.2-3200pg）或 Low RP1(低灵敏度，1.95-32000pg) 的 Control Number。 如果是最新的 Bio-Plex Manager 5.0 版软件，则无需在 Calibrate 时选择灵敏度范围，而是在 Run 界面 直接选择。 按 OK 确定，屏幕弹出 MCV 板提示窗口： 加入黄色闪烁所提示的试剂，然后将 MCV 板推入仪器，按 OK 开始进行仪器校正。 注意：Calibrate kit 中的试剂 CAL1 和 CAL2 在加入前必须从 2-8℃恢复到室温，并进行漩涡混合 30 秒以上才能使用，每孔加入 5 滴，DI 水加入 3.5mL。 加入去离子水 和 70％异丙醇 各 3.5ml 点击弹出微孔板平台 5、创建和运行方法 Protocol setting 和 Run protocol： 点击工具栏的 New 按钮，屏幕即打开方法编辑 Protocol 窗口，如下图所示： Step 1：输入方法的一般信息 Step 2：选择分析样本： 如上图所示，选择分析物后，按 Add All 将其移到选择栏中（Selected）。 如果要增加分析物组合，点击 Add Panel 按钮，弹出窗口： 输入该分析物组合名称，点击右边的 Add 按钮，弹出上面的右边窗口，将新的 kit 上的微球编码输 入 Region 栏，把该微球对应的检测物名称输入到 Name 中，如果要继续增加分析物，点击 Add continue 按钮，如果编辑结束，则点击 Add 按钮。然后回到 Select Analyte 界面进行选择。 点击各个按钮 进行方法设置 方法描述 选择分析物 板格式化 输入 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品信息 输入Control信息 输入样本信息 运行方法 下拉选择分析物 增加、编辑分析物组合 Step 3：板格式化：必须对板中各空的分析样本进行规定，以便仪器在读板中自动识别。点击 Format Plate 后，如下图： 左上角为三个按钮分别为：自动全部重复编码，自动横向重复和自动纵向重复，数字框为规定复孔 数目。例如，标准品有 8 个，要做 2 复孔，则复孔选择 2，鼠标点击横向重复编码按钮，然后鼠标 在屏幕所示的板上按标准品所加的位置进行拖动，如从 A1 孔拉到 H2 孔，即可得到如上图的格式， 对待检样本、对照和背景也同样操作，如果不做复孔则复孔栏选 1。 Plate Groupings 此工具用来把孔分群，每一群中可以设置一个参照孔。群中每个孔的荧光强度相对于参照空的荧光 强度的比值将被计算出来。芯片阅读仪只能对格式化后的孔进行阅读，但板的分群是可选的，也可 以在读孔后进行设置。 具体操作及说明 在进行了孔的格式化后，可进行分群。点击 Plate Groupings 显示板分群工具。 首先在 Ratio 区下拉菜单中设置每群需要计算的比率形式：Reference/Member 或 Member/Reference。 依次为 Blank（背景），Control（对照），Standard （标准品），X（待检样本），取消孔设定 依次是 Select（选择），Group（分群），Reference（参照）， Ungroup（不分群，取消孔设置） 定义群 点击 Group 进行实验组分群设置，在实验中需要设置的孔的位置上拖动鼠标进行设置。 注意：在进行分群前，孔必须已被设定为 Sample，Standards，Control 或 blanks。 可以把几种不同类型的孔设为一群（如：一个群中可以包括 Standards，Samples，Controls 或/和 Blanks）。 复孔将自动的被放在相同的群中（即使鼠标只拖动了复孔中的一个 孔）。 被分群的孔的颜色会有所变化，群中最小标号的孔将被默认为参照孔。每群都会被赋予一个不同的 颜色。点击 Ungroup Sample 按钮 ，点击或拖动孔或群可以从群中删除个别孔，或删除整个群。 定义参照孔 点击 Reference 按钮 可以改变群中参照孔，点击需要设定的参照孔即可。对于复孔来说，群中 所有编号相同的复孔将自动被定义为相同的参照。 Step 4：输入标准品信息：如下图所示， Step 5：输入对照样本信息（Control information） 如果当此实验有对照样本，则该步必须进行编辑，如果没有对照样本，则该步骤可跳过，直接 编辑 Step 6。如下图，选择分析物，输入对照样本的浓度和稀释倍数即可。 选择分析物，一般所有 分析物的浓度都相同 输入各个分析物 标准品的浓度 选择后，再在下方输入 分析物的初始浓度和 稀 释 倍 数 ， 点 击 Calculate 按钮，左边标 准品浓度将自动计算 并输入 输入标准品浓度单位 选择偏差值，一般为 70-130% 选择回归参数模型，一般为指数 5PL，右边选择输 出标准曲线的横坐标和纵坐标类型，该 2 种参数也 可在结果输出后进行修改或编辑 Step 6：输入待检样本信息： 方法编辑结束后可点击工具栏上的保存按钮，将方法保存到指定的文件夹中。 Step 7：运行方法： 将板推进仪器中，点击屏幕 run Protocol 按钮，在该界面中选择每 region 100beads 和 50uL 样品 大小，如果是 Bio-Plex Manager 5.0 或一上版本，还需选择检测灵敏度（高灵敏度范围：0.2-3200pg/ml 或低灵敏度范围：1.95-32000pg/ml）。然后点击右上角的 Start 按钮，屏幕则弹出要求是否自动保存 结果，可选择该项，在继续弹出的窗口中选择运行结果要保存的文件夹，按 OK 后，则开始读板， 读板过程如下图所示： 运行界面（柱状图和点状图）设置及选项说明 软件中的 Run Protocol 窗口可以控制程序的运行，运行状态有两种窗口可以显示：原始数据表格显 示和柱状图/点状图显示。点击 Show/Hide Histogram/Bead Map 按钮 可显示原始数据表格，或 板格式化后的 孔对应的样本 输入各孔样本名称，也 可记在实验记事本中 输入各孔样本 稀释倍数 如果所有样本稀释倍数相同，则可 在此输入稀释倍数，然后自动计算 是同时显示原始数据及柱状图/点状图（原始数据表格显示在柱状图/点状图下面，在窗口最大化后可 同时显示出来）。 运行过程中，柱状图/点状图是在不断更新的，原始数据在阅 读仪读取完成后可显示。 在设置好运行选项后，点击右上角的 Start 按钮，Run Protocol 对话框出现，输入使用者名字及微板的条形码或 ID 号（此项 可不填）。点击 Eject/Retract Plate，并放入微板，点击 OK 开 始运行。 以下情况可能会使运行延迟： 阅读器光学系统没有预热，阅读仪将等到预热完成后开始运 行。 液流系统压力过低，会有警告信息出现，提示使用者检查鞘流 液水平，软管的连接等等。 平台的加热器不在特定的温度，警报信息出现，提示使用者等 待温度改变。 运行开始时，样品针将降低从平板的空中吸取样品，并回到初 始位置。 运行过程中，正在读取的孔的编码将在柱形图左上方以蓝色显 示。在图中浏览数据时，可使用柱形图上方的下拉菜单对分析 进行选择。 柱状图 柱形图显示所选孔，分析物和通道类型的每一个通道值的事件数。一个事件的定义是一个颗粒，如 一个微球或一团微球通过激光一次。每个事件在不同通道都会产生信号： 每个微球的荧光值在 Classification 1 和 Classification 通道 2 产生信号。 分析物上结合的荧光分子在 Reporter1 通道产生信号。 每个微球产生的光散射在 Doublet Discriminator 通道产生信号。光散射的量与微球的尺寸成比例。 在柱状图中，Y 轴代表事件，X 轴代表通道值，对所选通道来说此值范围从 1 到 32766。 DD Gate 范围 DD Gate 的指定范围可在 Run Protocol 的 Advanced Settings 中设置。DD Gate 范围在 柱状图中以两条垂直于 X 轴的的红色线表示。在 Protocol 窗口中，把鼠标放置于红线 上向左或有拖动可对 DD Gate 的范围进行更改。这一操作也将改变 Advanced Settings 对话窗中相应的范围。 在柱状图上鼠标右键点击从 Gate 菜单中选择 Show 或 Hide 可以显示或隐藏红色线条。 点击柱状图上方的 Restore Default Gates 按钮，可以重新使 Gate 的范围恢复为默 认值。 选择通道类型 柱状图可以显示不同的通道类型。鼠标右键点击柱状图， 从下拉菜单中选择 X-Axis。从 X- Axis 子菜单选择以下通 道类型： Doublet Discriminator 通道是检测小球通过红激光时的向 前光散射。光散射与小球尺寸相关，在柱状图中此通道可 以从聚集的小球中区分出单个的小球。此选项为默认的选 项。 Reporter 1 通道是检测小球通过绿激光时从每个小球的分 析物上结合的报告分子发射的荧光。每种小球的荧光总量 与检测中分析物的量成比例。这一设置可以对特定分析物的荧光信号分布进行观察。 Classification 1 通道是小球通过红色激光时，每个小球上内含的第一类染料的荧光。 Classification 2 通道是小球通过红色激光时，每个小球上内含的第二类染料的荧光。 注意：通道类型的改变将改变通道值范围及柱状图的显示。 缩放柱状图数据比例 点击柱状图工具栏上 Auto Scale 按钮 可以调节柱状图显示的比例。右键在菜单背景上点击，选 择 Set Scale 手动设置 Y 轴的范围，在跳出的窗口中，输入 Y 轴显示的事件的最大数值。数据默认的 显示是对数刻度。点击工具栏上的 Log/Linear 按钮 可改为线形显示。 放大和恢复柱状图尺寸 点击位于柱状图工具栏的 Zoom 按钮放大显示。点击 Maximize 按钮可以最大化柱状图。点击 Restore 按钮可以使柱状图恢复到默认大小。 点状图 小球的彩色图是指阅读中所有事件的密度点 图。图中不同的颜色小点代表在这些数值点上 不同数量的事件。 在默认的点状图中，X 轴是 Classification 1 通 道，Y 轴是 Classification 2 通道。图中默认数 值点类群代表了在检测中设置的不同的小球 及其相关分析物。 每个小球产生一组数据点而不是一个单一的 点，这是由荧光染料水平的细微变化和设置中 小球之间的密度的差异造成。 图中白色区域是指所选分析物期望的区域。把 鼠标放置在此区域上时，分析物的名字将显示出来。数据点群应 该落在这些区域中。 如果一个或多个数据群没有落在白色区域中，提示有可能小球退 色或在 Protocol 中分析物的选择错误等。如果所有的数据群都在 白色区域的外面，则可能管路中有气泡。 改变点状图中 X 和 Y 轴通道类型 在点状图上右键点击，从 X 轴子菜单中选择一个通道，在 Y 轴子 菜单中选择另一个通道，通道内容与柱状图中的通道内容相同。 点状图的缩放 数据的显示默认是 Log 形式。在工具栏上，点击 Log/Linear 按钮 可改变数据显示形式。 过滤点状图显示 点状图中每个颜色点代表在此数值点时通过阅读仪检测到的事件的 一定数量。不同的颜色用来区分事件的不同数量。通过调节显示可 使低数量事件不显示，或在数值点颜色改变之前特定数量的事件进 行显示。右键点击点状图并选择 Options。 注意：这一设置只改变点状图的显示，并不改变数据的读取。 在 Level Multiplier 中输入数值。此数值以指数形式来确定在某一个数值点颜色改变之前需要的事件 数量。默认值为 2，即颜色水平在事件数量为 2，4，8，16 时改变。 如果需要把低数量事件筛选掉，可选择 Filter Levels 检查框，用 Display about Level 旁的箭头键选择 低于某水平的事件不进行显示。如，Level Multiplier 设置为 2，Display about level 设置为 3，则数量 低于 8 的事件不进行显示。首先显示的是数量为 8 的事件，然后是数量为 16 的事件，然后依次是数 量为 32 的事件，等等。 显示中的颜色水平依次是，暗蓝色，紫色，暗绿色，亮蓝色，蓝色，亮绿色，橙色，黑色和棕色。 6、结果分析： 7、系统管路清洗、关机： 如果第一块板读完还要读第二块板，则需要先点击工具栏的 Wash between plate 按钮，按照 弹出窗口的提示在 MCV 板上加入相应的试剂，然后点 OK 开始清洗。 如果当天读板结束，要关机，则点击工具栏上的 Shut down 按钮 ，仍按照屏幕提示进行操 作，Shutdown 结束后，激光关闭，先关闭电脑的 Bio-Plex Manager 程序，然后关闭机器电源。 八、注意事项 1、每次操作：严格进行每次实验的 Start Up，Shut Down 和板间清洗 Wash Between Plates 操作， 原始数据，为各 孔的荧光值 报告表，含各孔 的最终浓度 标准曲线图 点击此按钮，则自动形 成 Excel 表格的报告 以避免鞘流系统的管路堵塞。 2、经常注意鞘流液瓶和废液瓶的液面，及时添加鞘流液和倒空废液。经常打开仪器的所有门观 察是否漏液，如果漏液及时联系 Bio-Rad 工程师进行维修。 3、如果仪器预热后闲置 4 小时，则激光自动关闭，这时如果要读板必须重新预热；如果温度改 变 2 度以上必须重新进行 Calibration。） 4、读板前的注意事项： 1）检查滤板是否平整。 2）目测平板待检孔是否充满 buffer。 3）平板在 1100 转室温摇床 30 秒。 4）检查废液瓶是否倒空和鞘流液瓶是否充满。 九、系统维护与保养 1、系统校验（Validation）： 每月做一次，仪器搬动后也必须进行校验，检查并验证系统的光学 系统、鞘流流路系统、报告激光和分类激光系统等。点击工具栏的校验按钮 ，在弹出的窗口 中选择 Validation kit 的 Control Number，和校验类型，一般选择 All，点击 OK 确定，按照弹出 的 MCV 板提示，在 MCV 板中加入相应的试剂，如下图： 注意：所有 Validation kit 中的试剂必须从 2-8℃恢复到室温，并进行漩涡混合 30 秒以上才能使用， 每孔加入 5 滴，DI 水和 70％异丙醇每孔加入 3.5mL。 将 MCV 板推入仪器，开始进行 Validation。 查看 Validation 结果：点击菜单栏的 View 菜单，选择 Validation Results，在弹出的窗口中查看结果。 2、每月保养：清洁仪器外表，先用温和洗涤剂，后用 10％漂白液擦拭仪器外表；若机器长期 不用，必须将机器的管路充满 20％乙醇，可用 20％乙醇代替鞘流液，然后进行 Wash Between Plate 操作。 十、附件 附件一：Bio-Plex 细胞因子检测操作指南（中文版） 附件二：Bio-Plex 氨基耦联原理与操作指南（中文版） 附件三：Bio-Plex 核酸耦联原理与操作（英文版） 附件一： Bio-Plex 细胞因子检测操作指南 一、检测所需的 Kits 和设备 二、实验准备 1、样品与标准品准备： 1）使用的稀释液如下表： 样品 样品和标准稀释液 细胞培养样品 细胞培养液，必须包含培养液所有成分，如 FBS 等 灌洗液 灌洗缓冲液，再加入浓度至少为 0.5%的 BSA 封闭 唾液或其他生物液 以最接近的样品缓冲液溶解，再加入浓度至少为 0.5%的 BSA 封闭 血清 使用 Bio-Plex 种属特异稀释液（如上表 3） 血浆 使用 Bio-Plex 种属特异稀释液（如上表 3） 2）所有样品在使用前必须冰浴冻藏（－20℃或－80℃），血清或血浆以 1000g，4℃离心 10min， 收集上清-20℃保存。 3）标准品工作曲线准备 每管冻干标准品加入 500uL 稀释液（如上表所示），作为标准储存液 漩涡混合 1－3 秒，冰浴 30min 后使用 根据不同跨度灵敏度范围准备工作曲线样品，准备好小离心管，标号，然后分别按下图进 行稀释： A）1.95－32000pg，以 Std1 浓度为 32000pg/mL： B）0.2－3200pg，以 Std1 浓度为 3200pg/mL 2、微珠，检测抗体和 Streptavidin-PE 荧光色素准备：在各自使用前准备，详见工作流程图 1）微珠：根据检测所用的孔数计算所需微珠体积和稀释液体积，按每孔 2uL（25×）微珠， 每孔最终加入体积为 50uL 计算，稀释液为 Assay Buffer，一般如下表： 稀释前以中速漩涡混合 30 秒，冰浴，避光保存直到使用。 2）检测抗体准备：在转移前 30 秒快速离心，以 Detection Antibody Diluent 稀释到 1×浓度， 注意，不同元检测稀释倍数不同，8 因子检测稀释倍数为 50，其他具体如下图表： 稀释后尽快使用，在室温避光下可稳定保存 4 小时 稀释倍数也可以按照如下计算：假如是 50×的，每孔需要 0.5uL 检测抗体，每孔最终加入体 积为 25uL。 3）Streptavidin－PE 荧光色素准备：在转移前 30 秒快速离心，稀释液为 Assay Buffer，如下 表所示： 稀释后尽快使用，在室温避光下可稳定保存 4 小时，使用时每孔加 50uL。 三、实验流程： 1、校准真空吸板机的真空度，打开吸板机，用 96 孔板盖住，调节真空阀门到 1-2″Hg 压力。 2、倒空废液瓶，将鞘流液装满。 3、工作流程图： 以 100uLBio-Plex Assay Buffer 润湿滤板，再用真空吸板机吸去所有 buffer，再将板放在干净的纸巾上，完全吸去所有 buffer 加入前漩涡混合 15－20 秒，每孔加入 50uL， 真空吸去 buffer；用 100uLBio-Plex wash buffer 洗 2 次，分别真空吸去 buffer，每次用不同干净 纸巾完全吸去 buffer，以避免交叉污染 轻弹样品和标准管 3-5 次，每孔加入 50uL，用 铝薄盖住，先 1100 转室温摇床 30 秒，再以 300 转摇 30min，然后轻轻移去铝薄，避免溅出，真 空抽去 buffer，再 100uLBio-Plex wash buffer 洗 3 次，分别真空吸去 buffer，每次用不同干净纸 巾完全吸去 buffer，以避免交叉污染 检测抗体加入前漩涡 混合，每孔加入 25uL， 盖上铝薄，先 1100 转 室温摇床 30 秒，再以 300 转摇 30min，然后 轻轻移去铝薄，避免 溅 出 ， 真 空 抽 去 buffer ， 再 以 100uLBio-Plex wash buffer 洗 3 次，分别真 空吸去 buffer，每次用 不同干净纸巾完全吸 去 buffer，以避免交叉 污染 Streptavidin－PE 荧光色素加入前漩涡混合， 每孔加入 50uL，用铝薄盖住，先 1100 转室 温摇床 30 秒，再以 300 转摇 10min。然后轻 轻移去铝薄，避免溅出，真空抽去 buffer，再 100uLBio-Plex wash buffer 洗 3 次，分别真空 吸去 buffer，每次用不同干净纸巾完全吸去 buffer，以避免交叉污染 用 125uL Bio-Plex assay buffer 重悬微珠， 以密封袋盖住，1100 转室温摇床 30 秒，便 可放入仪器中进行读盘检测 附件二： Bio-Plex 氨基耦联原理与操作 一、原理 Bio-Plex 氨基耦联试剂盒提供了一些缓冲液，用于将 60－150kD 分子量的蛋白质共价耦联到 5.5um 荧光染色的微珠上。耦联反应发生在微珠表面的羧基和蛋白质 N 末端的氨基上，进行羧胺反 应。耦联后形成稳定的共价键，不会轻易脱落，甚至可保存数月。试剂盒可进行 30 次反应，每次反 应需要 1.25×106 个羧基化的微珠（1 倍浓度）。这种蛋白质耦联微珠可用于蛋白质相互作用的研究。 一般微珠反应得率为 80％，即足够用在 Bio-Plex 上进行检测的每孔 5000 个微珠。 一般耦联需要 3 步：蛋白质准备，蛋白耦联和蛋白耦联验证。 A、蛋白质准备： 蛋白质样品的要求： 1、 蛋白质分子量：6－150kD， 2、 水溶性， 3、 样品不得含有如叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris 或其它任何含自由氨基的添加物。 4、 蛋白质必须溶解在 PBS 中，pH7.4。 5、 必须摸索出最佳的耦联条件，主要是摸索蛋白质的使用量，如下表所示的例子。注意， 不需要用最大量的蛋白质进行反应。 B、蛋白耦联：耦联反应分 2 步进行，微珠上的羧基在耦联前需要活化，EDC（1-乙基-3-[3-二甲 氨基丙基]炭化亚胺）与微珠上的羧基反应形成一种活化的 O-酰基异脲（O-acylisourea）中间体，在 水溶液中用 S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) (巯基乙酰基三甘氨酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 （NHS-MAG3）使这种中间体变得稳定。EDC 耦联 S-NHS 产生了 S-NHS-活化位点，O-酰基异脲和 S-NHS 的形成是氨基反应。但是 S-NHS 酯在生理 pH 下更稳定，随后这种中间体与蛋白质上的初级 氨基反应形成酰胺键。如果这种中间体不能和氨基反应，中间体将脱水并产生羧基，释放出 N-未取 代脲。这些反应在数分钟内同时迅速反应。 C、蛋白质耦联验证：耦联反应结束后需要对微珠进行计数并验证耦联效率。 用 PE（藻红素）标记的抗体连接到耦联的微珠上，再用 Bio-Plex 进行分析。或者用生物素化的 抗体反应再用 Streptavidin-PE(链亲和霉素－藻红素)，机器读出的荧光信号直接与耦联在微珠表面上 的蛋白量相关，如果荧光信号超过 2000MFI 可认为耦联成功。 二、除耦联试剂盒外所需的仪器和试剂 1、Bio-Plex 蛋白质芯片系统 2、Bio-Plex 蛋白质芯片系统附件：Validation kit 和 Calibration kit 3、漩涡混合器 4、离心机 5、组织培养旋转器 6、超声波清洗器 7、细胞计数器 8、蛋白质测定（如 lowry 法，以 BSA 作为标准） 9、缓冲液更换层析柱 10、化学试剂：EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]炭化亚胺），S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) (巯 基乙酰基三甘氨酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-MAG3） 11、其它试剂：对耦联蛋白特异的抗体（需 R-藻红素或生物素标记）， Streptavidin-PE(链亲和霉素－藻红素)， tips 头，移液枪，铝箔，小离心管，96 孔平底板，小角底槽等 三、耦联操作 A、蛋白质准备：如果样品不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris 或其它含自由氨基的添加物，并且 已溶在 PBS，pH7.4 中，可测定蛋白质浓度后直接用于耦联；如果样品含有以上任何一种添加物， 需要进行如下处理：使用 Bio-Spin 微型柱进行更换缓冲液，1000g，2min 离心去除缓冲液，加入 500ul PBS，1000g，2min 离心，重复 5 次，20－75ul 的样品上样到柱子中，1000g，5min 离心，样品冰浴， 测定蛋白质浓度后可直接用于耦联。 注意：更换缓冲液可能导致多达 20％的蛋白质损失， 必须准备足够耦联反应所需的 5－12ug 的蛋白质 B、耦联反应：在所有试剂使用前必须解冻或回复到室温 1）微珠活化： 选 择 COOH 微 珠 （1.25×106个/ml） 漩涡混合 30 秒 超声波震荡 30 秒 取 100ul 微珠到反 应管中 14000g 离心 4 分钟， 小心移除上清液 加入 100ul 微珠清 洗液 漩涡混合 10 秒 超声波震荡 10 秒 14000g 离心 4 分钟， 小心移除上清液 加入 80ul 微珠活化 缓冲液重悬微珠 漩涡混合 30 秒 超声波震荡 30 秒 使用前 准备 EDC（50mg/ml） 和 S-NHS（50mg/ml） 加入 10ul EDC 后迅 速加入 10ul S-NHS 到微珠中 漩涡混合 30 秒 用铝箔盖住反应管， 在室温中旋转混合 20min 加 150ul PBS，pH 7.4，漩涡混合 10 秒 14000g 离心 4 分钟， 小心移除上清液 加 100ul PBS，pH 7.4 重悬微珠 漩涡混合 30 秒 超声波震荡 15 秒 注意：EDC 必须确保新 鲜，反复冻融不得超过 5 次，最好分装后一次 性使用。 2）蛋白耦联： 加 5-12ug 的蛋白质 样品到活化的微珠 中 用 100ul PBS，pH 7.4 定溶到 500ul 用铝箔盖住反应管， 在室温中旋转混合 2 小时或者 4℃过夜 14000g 离心 4 分钟， 小心移除上清液 用 500ul PBS，pH 7.4 清洗耦联的微珠 14000g 离心 4 分钟， 小心移除上清液 不要超声波清洗 用 250ul 封闭缓冲液 重悬微珠，漩涡混合 15 秒 用铝箔盖住反应管， 在室温中旋转混合 30 分钟 14000g 离心 4 分钟， 小心移除上清液 用 500ul 储存缓冲液 清洗微珠， 16000g 离心 6 分钟，小心去 除上清 加入 150ul 储存缓冲 液保存微珠 可用血球计数器计 算微珠的浓度 盖上铝箔，4℃保存 耦联的微珠 可稳定保存 1 年 摸索最佳蛋白 量，可做一梯 度 四、耦联效率验证：可使用 2 种反应进行验证，一种是用 PE 耦联的抗体，另一种是先用 生物素化的抗体然后用 Streptavidin－PE 注意：所用的抗体种属必须一致，例如已经耦联了一个鼠抗人的抗体，那么二抗必须是来源于鼠 的抗体，如羊抗鼠和兔抗鼠等。 五、结果分析： 阴性对照（背景）的荧光值不得超过 100MFI 耦联微珠的荧光值超过 2000MFI 可认为耦联成功，如果耦联不成功，必须分析各种原因， 如操作，耦联蛋白质浓度和蛋白量等等。 或者 标记 2 个小离心管，其中 1 个 用于阴性对照 耦联的微珠漩涡混合 15 秒，每 管加入约 10000 个耦联的微珠 稀释 PE 标记的抗体至 1ug/ml， 加 50ul 到测试管中，阴性对照 管不加 盖上铝箔，室温旋转混合 30 分 钟 稀释生物素标记的抗体至 2ug/ml，加 50ul 到测试管中， 阴性对照管加 50ul 稀释缓冲 液，14000g 离心 4 分钟，移除 上清，加入50的2ug/ml Strepta- vidin-PE，阴性对照管加 50ul 稀释缓冲液。 盖上铝箔，室温孵育 10 分钟， 不需旋转混合 14000g 离心 4 分钟，小心移除上清 用 125ul 的储存缓冲液重悬微 珠，漩涡混合 15 秒，取 125ul 样品到平底 96 孔板中，开始用 Bio-Plex 仪器检验微珠