bFGFPLGA缓释微球及其体外释药性能研究

32 中国生化药物杂志Chine卵Joumal0fBiochemicalPIIa册aceutics20lO年第3I卷第1期 bFGF—PLGA缓释微球及其体外释药性能研究 武继民1，-，汪鹛飞2，李志宏2，袁晓燕1 (1．天津大学材料科学与工程学院，天津300072；2．军事医学科学院卫生装备研究所，天津300161) 摘 要：目的以bFGF为缓释药物、PLGA为药物载体制备bFGF．PLGA缓释微球，观察微球表面形态，检测微球 物理性能和体外释药行为。方法采用wI／0／W2复乳溶剂挥发法制作微球；通过扫描电镜观察微球的表面形态结 构；利用EuSA法测试微球中药物的载药量和包封率，并对微球中药物的体外释放行为进行研究。结果微球表面 圆滑均匀，平均粒径(0．75±O．08)舯，栽药量[(59．9±1．9)×IO．3]％，包封率为(79．9±2．8)％；在为期45d的体外 释放试验中’bFGF累积释放率达到80％。结论bFGF．PLGA微球能够稳定地在较长时间释放药物bFGF，验证了PL． GA微球作为bFGF控制释放载体的可行性。 关键词：bf．GF；PLGA微球；缓释 中图分类号：R944．9文献标识码：A 文章编号：1005．1678(2010)01．0032．03 Plre]pa豫ti仰ofbFGF-PLGAcontroUed-rele嬲elIlicr嬲pheres粕dtlleirs邺tai肿d reIea鸵perf0珊锄ce伽V砌Ⅵ wuJi-IIlinl，-，wANGPeng．fei2，uZlIi．hon92，YuAN)(iao．y明1 (1．＆砌ofQ厂膨口把晓Z&拓珊∞口耐魄i扎eeri略，氕口，巧流所疵聍珊毋，‰痂300072，珊打Ⅺ 2．胁tft吮矿胁拙口f匈“咖靴眦，Ac础形矿肘溉。砂胁妣f＆如聊部，m彬，l300161，蕊i眦) Abstract：Purpo辩TbpreparebF℃F-PLGAmicrosphere8arldtoinvestigatethecharacteristics． MethodsnebFGF—PLGAlIlicrosphereswerepreparedbyWI／O／W2multiplee砌lsionvolatilizingmetllod， themorphologyw砸inVestigatedusingscanningelectronrnicmsc叩e(SEM)，山eELISAmethodw∞u∞dtoes- tablishtlIe11egressionequationandtodetectthedmgloadingamount蚰denc印suIatione珩ciency，鹊well嬲 叭stained—rele舾eprofilein钟itro．ResIll缸ThemicmspheresseeⅡ抡dtobesmoothandunifonn埘tllmeanpani— clesizeof(0．75±O．08)肛m，thethedmgloading砌ount龃dencapsulationefficiencywere[(59．9±1．9) ×10．j]％aIld(79．9±2．8)％，respectively，吐Ieaccu咖lativerele娼eratiow鹊upto80％inthecontinuo吣 periodoffony—fiVedays．CondusionnebFGF-PLGAIIlicrosphereshavebetterpha珊acemicalpropeni伪舳d long-timesustainedrele踞ee矗．ectin口西ro． Key word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 s：bFGF；PIJGAnlicmsphere8；sustainedrele嬲e 碱性成纤维细胞生长因子(b舾ic铀mbl髂tgr0·wth ‰t0玛，bFGF)是一种具有广谱作用的促进组织或血 管形成生长因子[1．2l。bFGF在细胞外基质(ECM)中 是联结细胞行为的专一信号因子，在创伤愈合中起 到促血管化的主要作用【3圳，因此bFGF及其制剂的 相关应用研究一直是组织工程支架材料、再生医学、 收稿日期：2009明．20 基金项目：国家自然科学基金(30970724)和天津市自然基金 (08JCYBJC340D)项目资助 作者简介：武继民(1963．)，研究员。从事生物材料研究，Tel：022． 8465626l，E·mil：whujiIIlir所@yalloo．om．cn。 创伤治疗领域最活跃的课题之一。但是，bFGF作为 一种碱性多肽bJ，在体内扩散快、对热和酸敏感、易 被蛋白酶分解、半衰期短(3—5IIlin)，因此其生物学 效应不能得到充分发挥。如何有效地发挥bFGF的 生物学效应制约着bFGF的进一步体内应用研究， 药剂学的缓释技术较好的解决了这个问题。通过微 球包埋，使bFGF与外界的酶解环境相对隔离，能够 在相当长的时间内缓释药物并使局部药物浓度维持 在一个相当的水平。 本文研究筛选出较理想的乳酸．羟基乙酸共聚 物(PLGA)作为缓释载体，通过wI／O／W2溶剂挥发 法(复乳法)，对bFGF进行微纳米包埋，制成bFGF． 万方数据 中国生化药物杂志chineseJounlalofBiochefnic8lPhaHllaceutics2010年第31卷第1期 33 PLGA缓释微球。并研究了其释药行为。 1材料 bFGF冻干粉剂(北京双鹭生物制药有限公司)； PLGA(75／25，相对分子质量5．0万，山东医疗器械研 究所)；聚乙烯醇(PvA，纯度：96％一98％，水解度： 98％，聚合度：1750±50，中国医药集团上海化学试 剂公司)；bFGFELIsA试剂盒(双抗夹心96孔，ADL 进口分装)；二氯甲烷等试剂均为分析纯。 JSM-6700F型场发射扫描电镜(日本)；x．520型 高速匀浆机(美国)；78．1型磁力加热搅拌器(江苏金 坛市富华电器厂)；cR22G型超速冷冻离心机(日 本)；Freezone6型真空冷冻干燥机(美国)；DH4000A 型隔水式电热恒温培养箱(天津泰斯特医疗器械厂)； sHA．CA型水浴恒温振荡器(江苏金坛市医疗仪器 厂)；MuLl'IsKANMK3全自动多功能酶标仪(美国)。 2方 法 2．1 bFGF．眦A微球的制备 采用溶剂挥发法制备包埋bFGF的PLGA微球。 将水溶性的bFGF溶于生理盐水中作为内水相 (w．)，PLGA溶于二氯甲烷中作为油相(O)，不同浓 度、体积的PVA水溶液作为外水相(W2)。将内水相 逐滴滴入油相中，以高速匀浆机在30000r／ITIin下 乳化1lIlin形成初乳(w，／O)，待初乳稳定后，将初乳 液滴入一定体积不同浓度的PVA水溶液中(w2)， 15000r／面n下搅拌3IIlin形成复乳(wI／O／W2)。然 后将复乳液倒人烧杯中，磁力搅拌挥发3—5h，过 滤，3500一5000r／面n离心15—20min，去离子水洗 涤、过滤后再离心，如此反复操作3—5遍，直至将多 余的PvA清除。将样品一20℃冷冻保存至少48h； 冷冻干燥24h，收集微球粉末待用。 2．2bFGF．PI_GA微球表面形貌观察 将少量的微球粉末放在贴有双面胶的载玻片 上，制成相应的扫描电镜样品，喷金后利用sEM观 察微球表面形貌。 2．3 EUsA检测法及 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的绘制 采用双抗体夹心EusA法测试，利用抗人bFGF 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的bFGF与 单抗结合，加入生物素化的抗人bFGF抗体(二抗)， 它将与结合在单抗上的人bFGF结合而形成免疫复 合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的strepta． vidin与二抗的生物素结合，加入TMB显色。在450 nm波长处测定吸光度(A)值，bFGF浓度与A值成 正比，可通过标准曲线求出样品中bFGF浓度。 作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本 底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要扣除标准品 稀释液造成的本底，如果样品未用标准品稀释液稀 释，不需扣除标准品稀释液造成的本底。以浓度分 别为600，300，150，75，37．5，18．75，9．38，0pg／mL标 准品浓度为横坐标，以与之对应的A值为纵坐标， 作图建立bFGF的标准曲线并得出标准方程。然后 根据样品A值在该曲线图上查出bFGF浓度。 2。4微球中bFGF的栽药量和包封率测定 称取微球20哗，加入二氯甲烷2mL中，使其完 全溶解，再加入0．1咖l／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)1 mL，充分搅拌、静置、分液，收集水相冻存，EusA法 测定样品A值。根据样品A值及标准曲线计算待 测液中bFGF的浓度，从而计算出测试微球中的 bFGF含量。载药量=(微球中bFGF质量／微球总质 量)×100％；包封率=(微球中bFGF质量／投入 bFGF总质量)×100％。 2．5微球中bFGF的体外释放行为研究 称取微球50IIlg装入释放管中，以0．1啪l／L磷 酸盐缓冲液(pH7．4)10mL为释放介质，于37℃振 荡速度为100r／lIlin的水浴恒温振荡器中，分别在 0．5，1，2，3，5，8，12，17，23，30，45d取出释放介质2 mL于离心管中标号冻存待测并及时加入同样体积 的释放介质。 由标准曲线计算出微球中bFGF的释放量，并 计算累积释放率，得到微球中bFGF的体外释放曲 线。突释率为微球中药物在第l天的累积释放率。 3 结 果 3．1微球的形态与粒径 经SEM观察，bFGF．PLGA微球表面光滑无孔 隙，球形好；形态及粒径大小较均匀。如图1所示。 微球粒径为(0．75±0．08)“m。 图l b}G}-儿GA儆眯农脱肜祝sEM倒 Fig．1SEMimageofbFGF-PLGAmicr08phe瑚 3．2标准曲线的建立 进行线性回归得标准曲线方程：C=322．58A一 87．68。r2=0．9199。 3．3微球载药量、包封率及体外释药行为 5批次测定结果见表l。bFGF．PLGA缓释微球 万方数据 34 中国生化药物杂志chine即JDumaJofBiochemjcalPll锄aeeutics2010年第31卷第1期 载药量和包封率平均值分别为(59．9×10。3)％和 79．9％，微球的突释率均值为20．0％。微球在45d 内，能够持续释放bFGF，且释放浓度比较稳定。将 上述5批试样混合后经检测，45d微球中bFGF的累 积释放率达80％。bFGF微球的体外释药曲线也显 示，bFGF．PLGA缓释微球能够体外持续释药，具有明 显的缓释作用(图2)。 表1 bFGF．PLGA缓释微球载药量、包封率和突释率 m．1 Dnlgloadillg砌ount，朋capsul8ti彻棚ciencyalldillitial blIrst他le聃epercentageofbFGF-PLGAmicm8pher{es f／a 图2 bFGF-P的～微球的体外释药曲线 Fig．2Jh砌．Drelea∞profileofbFGF—PLGAmic∞8phe瑚 4讨论 bFGF作为一种广泛存在于人体各组织中但含 量极微的生物活性物质，主要作用于中胚层组织与 神经外胚层组织和细胞，能够促进多种细胞分裂增 值，促进微血管分化，使局部毛细血管增加，改善血 液循环，刺激骨细胞DNA合成和增值，增加骨细胞 合成胶原和非胶原蛋白的能力，诱导胚胎发育№J。 因此，bFGF能够有效地促进骨、软骨、肌腱、皮肤、血 管、韧带和中枢神经等多种组织的创伤修复；并且与 肿瘤的生长、增殖及一些神经性系统疾病的发生具 有密切联系【7J。 本研究制备的bFGF．PLGA缓释微球，使其在创 伤初期修复阶段，持续在组织局部释放bFGF，并维 持在有效生理浓度，以显著促进创伤组织修复。本 研究以PLGA为载体材料，应用单因素设计+正交 设计进行bFGF微球制备工艺优化，结果显示， bFGF．PLGA缓释微球表面光滑圆整，球体均匀性较 好，微球冻干后呈疏松白色粉末，再分散性良好，可 在常规条件下进行分装。 一般认为，缓释制剂在突释期内释放的药物量 应占总量的20％左右，且药物释放曲线平滑，没有 过大的波动[8J。本研究显示，微球的体外释药规律 符合HigIlichi方程，突释率均值为20．0％，45d后累 积释放量达到80％，且其浓度保持在一定的水平。 因此，在45d内bFGF微球体外缓释作用明显，并且 释出bFGF浓度变化不大，实验结果比较理想。 总之，本研究所制备的bFGF—PLGA缓释微球有 望发展成为一种具有对bFGF进行中长期缓释功能 的药物载体，为研制符合临床治疗需要的中长效注 射剂提供实验依据。同时，若bFGF．PLGA缓释微球 引入支架材料，将有效促进血管化⋯0|，在组织工程 研究领域具有广阔的应用前景。 参考文献： [1]1曲gtaY．Ti鲰lefeI；en硼tionhsed∞霉M汕factor嗣舶∞[J]．Tis叭e Eng，2003，9(SupplI)：s5一S15． [2]Detilli即xKA，caItiniPA，Ka瑚damjE．Beyond曲giogen髓i8：tllec小 didpmtectivepotentiaIoffibmbl舾t刚tlIfacto卜2[J]Ic肌JPhys“ HⅧⅫ∞0l，2004，82：1044·1052． [3]B∞咖FT，st蛐eIIka“cI．Fu眦ⅡonalgtnIctu弛alldcom州ti蛐0fthe “tmenlIlⅡmmi】【[J】．JPatbol，2003，200：423．428． [4]I哪哪埔nH，us，ph枷sM，eta1．The舶peu6c缸西叫ren档i8incritical Hnlbi卵hemiavi8tlIelocalizeddeHvery．ofbFGF白咖i砌chyd叩k 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