罗哌卡因PLGA微球在小鼠坐骨神经旁的缓释作用

罗哌卡因 PLGA微球在小鼠 坐骨神经旁的缓释作用 田洪居 1 � 陈仲清2 � 刘永前1 � 刘玲玲 1 ( 1厦门市第二医院麻醉科,厦门 361026; 2南方医科大学附属南方医院 SICU, 广州 510515) 摘要 � 目的: 研究罗哌卡因 PLGA微球 ( ROP�PLGA�MS)在小鼠坐骨神经旁的缓释作用。方法: 昆 明小鼠 110只,随机均分为 A、B两组, 给药侧坐骨神经旁分别植入 ROP�PLGA�MS和罗哌卡因 PL� GA空白微球混合物 (ROP /PLGA�MS); 对照侧均植入 PLGA空白微球 ( PLGA�MS), 建立动物模型 (每侧植药量 800mg /Kg )。各组小鼠均随机分 11组 ( n= 5) ,分布于给药后 5m in、15m in、30m in、1h、 2h、3h、4h、10h、18h、30h、48h时间点, 采用热踏板法及 4�po int scale评分测定坐骨神经阻滞时效, 高 效液相色谱法 (HPLC)测定血药浓度。结果: 两组小鼠坐骨神经阻滞结果发现 A组的局麻药阻滞 时间较 B组延长约 10倍。血药浓度变化显示: A组 3h后测罗哌卡因, 血药浓度相对平稳,达到峰 值时间晚, 峰值 ( Cmax ) = 129. 80 � 259. 70ng /m ,l且血药浓度一直维持较低水平。B组在 5m in时 血浆即可测及较高浓度罗哌卡因,并迅速达到 Cmax= 1559. 00 � 123. 39ng /m ,l其后快速下降。结 论: ROP�PLGA�MS在小鼠体内具有缓释作用,有效延长罗哌卡因时效,且血药浓度低,毒性小。 关键词 � 小鼠;罗哌卡因 PLGA微球;植入;坐骨神经;神经阻滞 THE SUSTAINED�RELEASE OF ROPIVACAINE PLGA M ICROSPHERES IN THE MOUSE SCIATIC NERVE TIAN Hong�Ju1, CHEN Zhong�Q ing2, L IU Y ong�Q ian, LIU Ling�Ling ( 1 Department o f Anesthesio logy, N o. 2 Hosp ital o f X iamen, X iam en 361026, China; 2 Departmen t o f S ICU, Nanfang Hosp ita,l SouthernM edicalUn iversity, Guang zhou 510515) Abstract� Ob ject ive: To study the sustained�re lease e ffect of rop ivaca ine PLGA m icrospheres (ROP�PL� GA�MS) nearby themouse sciat ic nerve. M ethods: 110Kunm ingm icew ere random ly d iv ided intoA, B group ( n = 55) . The drug sides o f group A were implanted w ith ROP�PLGA�MS nearby the sciatic nerves, the group B w ere implanted w ith the m ixtures of Rop ivaca ine and b lank PLGA m icrospheres ( ROP /PLGA �MS), and the contro l sidesw ere all imp lanted w ith the placebom icrospheres( PLGA�MS), the implanted vo lume of each side w as 800mg /kg. Each group w as random ly d iv ided into e leven sub� group according to ( n= 5) the tim e point ( 5m in, 15m in, 30m in, 1h, 2h, 3h, 4h, 10h, 18h, 30h and 48h) a fter adm inistrat ion. The efficacy o f the drug w as determ ined by m easure the sensory and mo tor nerve b lockade by the hot plate test and 4�po int sca le. The b lood concen trat ion o f drug w asmeasured by the h igh�performance liquid chrom atography (HPLC) in corresponding t ime po in.t Resu lts: The blockade effect of sc iat ic nervew as found that ROP�PLGA�MS caused sensory andmotor never b lockmo re than 30 hours, and thatROP /PLGA�MS caused sensory andmo tor never b lock less than 3 hours. P lasma concen� tration changes suggest that the m icro�ropivacaine w ere detected in p lasma o f group A m ice, and reach the peak ( Cmax ) slow ly in 10h, Cmax = 129. 80 � 259. 70ng /m ,l plasm a concentration of ropivacaine ma intained a re lative ly low leve,l drug stay about 30 hours. In Group B the h igher p lasma concentrations of ropivacaine can be detected in 5m in, and reach Cmax ( 1559. 00 � 123. 39ng /m l) quick ly, then de� creased rap id ly. Conclusion: ROP�PLGA�MS has sustained re lease e ffect in m ice and can pro longed anal� gesia of ropivacaine w ith litt le tox icity. Key words� M ice; ROP�PLGA�MS; Implan;t Sciat ic nerve; N erve b lockade 296 中国疼痛医学杂志 Ch inese Journa l of Pa inM ed icin e 2010, 16, ( 5 ) � � 局部应用局麻药进行镇痛是一种直接有效的方 法 [ 1]。临床上常采用间断注射局麻药或体内导管 植入持续给药达到镇痛需求,但需要比较昂贵的设 备及连续监护 [ 2, 3] , 长时间留置导管易引起感染及 导管移位等问题 [ 4]。近十多年来, 随着药物缓释技 术的发展, 制备一种单次给药满足临床镇痛治疗的 局麻药缓释制剂的研究逐见成效。罗哌卡因是一种 新型局麻药,在临床镇痛治疗上体现出显著的优越 性。本研究以生物降解聚合物乳酸羟乙基乙酸共聚 物 ( PLGA )为载体材料, 盐酸罗哌卡因为包裹药物, 采用W /O /W复乳溶剂挥发法 [ 5]合成罗哌卡因 PL� GA缓释微球 ( ROP�PLGA�MS), 通过比较 ROP�PL� GA�MS和罗哌卡因 PLGA空白微球混合物 ( ROP/ PLGA�MS)在小鼠坐骨神经的阻滞时效, 研究 ROP� PLGA�MS的缓释效应。 材料与方法 1. 材料和仪器 � 台式离心机 TGL�16B和 TDL�5(上海安亭科学 仪器厂 ); FJ�200高速分散匀浆机 (上海标本模型 厂 ) ; CL�2型恒温磁力搅拌器 (巩义市英峪予华仪器 厂 ) ; YLS�6B智能热板仪; LC�20AT高效液相色谱仪 (日本岛津 )。药剂: 盐酸罗哌卡因 ( Ropivacaine, ROP) (白云医用胶有限公司, 批号: 01070, 纯度: 99% ); 乳酸羟基乙酸共聚物 ( lactic acid�glyco lic acid�copo lymer, PLGA, 75 /25) (山东省医疗器械研究 所,批号: 07062305, M. W: 10000); 聚乙烯醇 ( po lyv i� nyl a lcoho,l PVA ) (北京百灵威化学技术有限公司, 批号: 9002�89�5, 纯度: 88%, M. W: 22000) ; 氢氧化 钠、二氯甲烷 ( d ichloromethane, DCM )、乙腈、甲醇 (色谱纯 )。 2. 实验方法 ( 1)药物制备:采用W /O /W乳剂 �扩散溶剂挥 发法按一定的比例称取一定量 ROP、PLGA和乳化 剂制备 ROP�PLGA�MS[ 5, 7]。并按同样的方法制备 乳 PLGA空白微球 ( PLGA�MS)。测得制成的 ROP� PLGA�MS平均粒径为 ( 2. 525 � 0. 047) �m,质粒均 匀,理化性质较稳定;测得载药量为 6. 067 � 0. 312 % (W /W ), 包封率为 58. 05 � 1. 169 % [ 5]。按 ROP�PLGA�MS的载药量用罗哌卡因与 PLGA空白 微球均匀混合制成与其罗哌卡因含量相同的罗哌卡 因 PLGA空白微球混合物 ( ROP /PLGA �MS)。 ( 2)动物实验: 20~ 22g雌性昆明小鼠 (许可证 号: scxk(粤 ) 2006�0015 2006A004)。给予 50~ 50. 5! 度 YLS�6B智能热板仪踏板,剔除在 5秒内或超 30秒后出现撤腿反应的小鼠 [ 8] , 并符合双侧下肢感 觉运动差异无统计学意义的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。将筛选后符合标 准的雌性昆明小鼠 110只, 随机分 A、B两组 ( n = 55), 在 2%的七氟醚吸入麻醉后, 将小鼠双下肢解 剖暴露坐骨神经后,均匀包埋微球或注入盐酸罗哌 卡因建立动物模型,具体分组及处理 (见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1)。 表 1� 实验分组 Tab le 1� Exper im en tal group 分组 group 给药侧 drug s ide 对照侧 con trol side A组 ROP�PLGA�MS PLGA�MS B组 ROP /PLGA�MS PLGA�MS 微球的每侧植药量均为 800mg /Kg,给药侧均含等剂量罗哌卡因 The im planted volum e of each s ide w as 800m g /kg 各组小鼠均随机分 11组 ( n= 5) , 分布于给药 后 5m in、15m in、30m in、1h、2h、3h、4h、10h、18h、30h、 48h时间点,通过对各小鼠进行双下肢感觉运动阻 滞评估药物时效。感觉阻滞评估: 各通过小鼠自身 双下肢对照比较热踏板撤腿潜伏时间考察小鼠坐骨 神经的感觉阻滞效应。给予 YLS�6B智能热板仪 (温度 50~ 50. 5! )行小鼠双下肢分别热板踏板试 验,以踏板时间 30秒为封顶时间 [ 8] , 每组小鼠只完 成一个时间点的热踏板试验 [ 9 ]。运动阻滞评估: 采 用提尾观察小鼠后爪的伸展及屈曲能力以 4�po int scale进行评分: 正常足部及趾部伸展及屈曲为 1 分; 足部及趾部正常屈曲, 伸展能力受抑制为 2分; 足部及趾部尚能屈曲,但伸展无能为 3分;足部及趾 部失去屈曲及伸展能力, 步态异常甚至出现拖腿现 象为 4分 [ 9]。 ( 3)血浆样品的处理与测定: 两组小鼠均在相 应时间点进行眼眶取血 0. 5m ,l肝素抗凝, 3500bpm 离心 8m in, 分离血浆 0. 3m ,l置于 - 20! 冰箱中备 用。分析测定时,室温下溶解,取血浆标本 200� l加 入内标液 ( 1. 0 �g. mL�1 ) 400�l混匀, 加入甲醇 100� ,l漩涡 2m in, 10000bpm离心 10m in, 提取适量 上清液,自动进样 20� l。 ( 4)色谱条件:色谱柱: Shim�pack VP�ODS 250L ∀ 4. 6mm,柱温:室温; 流动相:甲醇:乙腈: 水 ( 20mM NaH2 PO4调 pH至 4. 6) = 27: 13: 60(V: V ), 流速 1. 0mL. m in �1 ;检测波长为 210nm; 内标: 布比卡因; 定 量方法:峰面积法。自动进样量: 20�l。 297 中国疼痛医学杂志 Ch inese Journal ofPain M ed icine 2010, 16, ( 5) ( 5)标准工作曲线溶液的配制及曲线制备: 精 密称取 ROP标准溶液,用小鼠血浆依次稀释成 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0. 5, 1. 0, 2. 0和 4. 0�g. mL- 1的含药血 浆。以 ROP峰面积与内标峰面积比对 ROP的质量 浓度 X (�g. mL- 1 )进行线性回归, 得线性方程为 Y = 0. 2994X�0. 0031, 相关系数 r= 0. 99998。在 ROP 的质量浓度为 0. 05~ 4. 0�g mL- 1范围内线性关系 良好, 最低检测限为 0. 05 �g. mL�1。根据标准曲线, 计算出不同时间点的血药浓度。 3. 统计学处理 实验数据及图表均用 SPSS 13. 0统计软件处 理,药效学参数分别采用配对样本 t检验和 W ilcox� on符号秩检验, P < 0. 05具有差异统计学意义。实 验数据以 X � S表示。 结 果 1. 感觉阻滞结果 A组小鼠在罗哌卡因 PLGA微球坐骨神经旁植 入后 3h, 给药侧肢体开始出现明显的感觉阻滞效 果, 较对照侧对热伤害刺激的反应明显迟钝, 10~ 18 小时达到药效高峰, 30h起药效开始减退; 48小时 后药效接近消退,神经阻滞时间约 30小时。 B组小 鼠给药侧 5m in至 2h对热踏板基本无逃避反应 (踏 板撤退潜伏时间多超过 30s) , 4小时恢复 (见表 2), 说明 ROP�PLGA�MS在阻滞小鼠坐骨感觉神经 较 ROP /PLGA�MS延长 10倍以上。 表 2� 小鼠对热踏板的反应时间 ( n= 5, X � S) Table 2� The response tim e of m ice to the hot p late( n= 5, X � S) 时间点 tim e poin t A组 (秒 ) 给药侧 drug side 对照侧 contro l s ide P值 B组 (秒 ) 给药侧 drug sid e 对照侧 control side P值 5m in 13. 16 � 2. 18 13. 34 � 2. 26 0. 411 30 13. 13 � 1. 07 0. 000 15m in 14. 11 � 3. 21 13. 60 � 1. 90 0. 658 30 13. 25 � 1. 24 0. 000 30m in 13. 74 � 2. 91 13. 11 � 2. 08 0. 312 30 14. 36 � 0. 95 0. 000 1h 13. 96 � 3. 14 13. 14 � 1. 88 0. 726 30 14. 46 � 2. 23 0. 000 2h 13. 42 � 2. 75 13. 33 � 2. 06 0. 521 29. 62 � 4. 42 13. 06 � 2. 51 0. 000 3h 18. 43 � 2. 57 13. 20 � 1. 80 0. 000 21. 94 � 3. 44 12. 95 � 1. 75 0. 000 4h 22. 14 � 1. 70 13. 74 � 1. 27 0. 000 13. 51 � 1. 80 12. 97 � 1. 94 0. 179 10h 26. 50 � 4. 48 13. 65 � 2. 23 0. 000 12. 37 � 2. 44 12. 83 � 2. 52 0. 573 18h 27. 30 � 5. 04 13. 72 � 3. 62 0. 000 13. 12 � 2. 23 12. 79 � 2. 84 0. 591 30h 21. 75 � 5. 54 15. 19 � 2. 86 0. 000 13. 08 � 3. 09 13. 18 � 2. 43 0. 479 48h 17. 28 � 4. 97 14. 97 � 3. 69 0. 284 13. 51 � 2. 47 13. 20 � 1. 64 0. 530 � � 2. 运动阻滞结果 小鼠对照侧肢体均无运动阻滞现象; A组小鼠 给药侧肢体 3h时, 80%运动阻滞评分为 2分, 20% 为 1分 (P = 0. 014) ; 10h与 18h时 80%运动阻滞评 分为 2分, 20%为 3分, 运动阻滞达到高峰 (P = 0. 004) ; 30h时 40%运动阻滞评分为 1分, 60%运动阻 滞评分为 2分,运动阻滞开始恢复 (P = 0. 05); 48小 时后基本恢复正常 (P = 0. 317) ,各时间点各小鼠行 走及步态均未见明显异常。 B组小鼠给药侧肢体在 5m in�2h运动阻滞评分均为 5分,出现拖腿现象 ( P = 0. 000) ; 3h时 80%运动阻滞评分为 2分, 20%为 1分 ( P= 0. 014) , 4h恢复。 3. 血浆中罗哌卡因浓度的测定结果 A组小鼠 3h时血浆测及罗哌卡因 62. 80 � 23. 77ng /m ,l 10h Cm ax= 129. 80 � 259. 70ng /m ,l 30h后 下降至 89. 20 � 31. 92ng /m l, 48小时未测及, 药物 平均留置时间 ( MRT )约 3 0小时。B组小鼠在给 药后 5m in血浆即可测及罗哌卡因为 5 70. 60 � 1 1 4. 0 3 ng /m l, 3 0m in时均快速达到 Cmax = 1 559. 00 � 123. 39ng /m l, 3 h迅速降至 154. 40 � 23. 5 8ng /m l, 4h时均未测及 , MRT < 4小时 (见 图 1)。 298 中国疼痛医学杂志 Ch inese Journa l of Pa inM ed icin e 2010, 16, ( 5 ) 图 1� A组、B组小鼠在给药后相应时间点的罗哌卡因平均血浆浓度 ( n= 5) F ig. 1� The m ean con cen tration of p lam a in group A and group Bm ice in correspond ing t im e po int( n= 5) 讨 论 乳酸羟乙基乙酸共聚物 ( PLGA )是一种生物可 降解的分子材料,由于其易合成、质量稳定及生物可 降解, 近十多年来被广泛用作微球控制系统的骨架 材料, 特别在埋植微球领域得到广泛应用,部分药品 制剂已获 FDA批准应用于临床。国外有研究将其 应用于利多卡因及布比卡因的缓释合成, 并发现可 达到缓释及延长镇痛时间的作用 [ 2, 3, 9 ] ,但极少关于 罗哌卡因缓释方面的研究报道。 本文研究发现将 PLGA作为罗哌卡因的载体材 料,可成功合成罗哌卡因 PLGA微球,前期研究发现 其在体外可以缓慢释放, 一周内约 80%罗哌卡因稳 定释放 [ 5]。今研究是以固态微球植入小鼠坐骨神 经旁考察 ROP�PLGA�MS的缓释作用。 Sh ikanov等 人在实验中发现乳酸羟基乙酸共聚物空白微球对小 鼠坐骨神经无阻滞作用 [ 9] ,各小鼠均以植入 PLGA� MS作为对照可均衡手术及固态药物对坐骨神经的 影响因素, 研究 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 无神经阻滞效应 [ 9] , 因而参照 性强。 B组给药侧给予 ROP /PLGA�MS植入对照, 排除 ROP /PLGA�MS延长药物时效可能及固态形式 给药的影响因素。 研究发现 ROP�PLGA�MS在小鼠坐骨神经旁起 到较好的缓释作用,作用时间延长约 10倍, 运动阻 滞轻微,单纯的固态物质混合无此效果,血药浓度测 定结果发现 ROP�PLGA�MS中的罗哌卡因清除时间 显著延长,血药浓度低且波动小。局麻药的毒性一 般为血液药物浓度过高引起, ROP�PLGA�MS的这种 缓慢释放使血液吸收减少, 血浆局麻药浓度极大程 度降低,不易达到局麻药的毒性阈值,且因其稳定而 缓慢的释放,运动阻滞程度进一步减轻。 综上所述, ROP�PLGA�MS可以降低局麻药毒 性, 增加药物生物利用度, 延长神经阻滞时间, 同时 感觉运动分离加强 , 在临床镇痛方面具有深远 意义。 参 考 文 献 1� GrantG J, P iskoun B, BansinathM. 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