分子标记技术及其在水稻育种中的应用

分子标记技术及其在水稻育种中的应用 魏凤娟， 陈秀晨 （1.安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省农业科学院情报研究所，安徽 合肥 230031） 摘 要： 综述了分子标记的种类，对几种主要分子标记技术的技术原理、优缺点等方面进行了比较，概括了分子标记技术在水 稻育种中的应用进展。 关键词：分子标记； 水稻育种； 应用 中图分类号：S511；S188 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2010）08-0185-03 作为基因型易于识别的表现形式，遗传标记在植物种 质资源研究和育种工作中有着十分重要的地位。遗传标记 指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因，主要 包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记等 [1]。 形态标记指植物的外部特征；细胞标记主要是指染色体的 核型和带型包括染色体数目、大小和着丝点位置等；生化 标记主要包括同工酶和等位酶标记。这 3种标记都是基因 表达的结果，其多态性差，标记数量有限，易受环境因素影 响。分子标记技术以核酸为研究对象，能直接在 DNA分子 上检测生物间的差异。 1974年，Grodjicker创立了 RFLP 标记技术，之后基于 Southern杂交或 PCR扩增技术为基础的 DNA分子标记技 术相继被建立并广泛应用于生物遗传育种研究中，且在绘 制水稻遗传图谱、鉴定种质、定位农艺性状标记、克隆基因 定位和 MAS辅助育种等方面都有广泛应用， 极大地推动 了水稻遗传育种工作的进程。 1 分子标记的概念及其特点 分子标记的概念有广义和狭义之分[2]。 广义的分子标 记是指可遗传并可检测的 DNA序列或蛋白质； 狭义分子 标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的 特异性 DNA片段。 每一种标记都有其自身的特点和特定 的应用范围，分子标记与形态标记、细胞标记及生化标记 等遗传标记相比， 具有以下特点：（1） 准确性高。 直接以 DNA的形式表现，植物体的各个组织、各生长发育时期均 可检测，不受季节及环境因素限制，与基因表达与否无关； （2）数量多。 由于基因组 DNA的变异极其丰富，分子标记 数量几乎是无限的；（3）多态性高，自然界存在许多等位变 异，不需专门创造特殊的遗传材料；（4）共显性好。 许多分 子标记都表现为共显性，能更好地鉴别纯合基因与杂合基 因类型；（5）对表型无影响。 不影响目标性状的表达，与不 良性状无必然连锁。 2 几种主要分子标记技术比较 分子标记自从诞生之日起， 一直受到许多学者关注， 在历经短短几十年的迅猛发展后， 分子标记技术日趋成 熟。现有的 DNA分子标记技术有几十种，基于分子杂交技 术的分子标记如限制性长度片段多态性 (RFLP)和数目可 变串联重复多态性(VNTR )；基于 PCR 的分子标记主要有 2大类，其中随机引物的 PCR标记主要包括随机扩增多态 性 DNA (RAPD)、任意引物 PCR (AP—PCR)和 DNA 扩增 指纹印迹(DAF)，特异性引物的 RCR 标记主要包括序列标 志位点 (STS)、 简单重复序列 (SSR)、 内部简单重复序列 (ISSR)、 序列特异性扩增区 (SCAR)、 单引物扩增反应 (SPAR)、DNA单链构象多态性 (SSCP) 和双脱氧化指纹法 (ddF)； 基于限制性酶切和 RCR 技术的分子标记包括扩增 片段长度多态性 (AFLP)和酶切扩增多态性序列 (CAPS)； 基于 DNA 芯片技术的分子标记如核苷酸多态性 (SNP)[3]。 目前， 应用较广泛的分子标记技术主要有 RFLP、RAPD、 AFLP、SSR 和 ISSR 等，其主要技术原理、基本操作、优缺 点和应用等见表 1[3-7]。 3 分子标记在水稻育种中的应用 3.1 水稻分子遗传图谱的构建 1988 年，Mccouch 等 [8]构建了第 1 张水稻 RFLP 遗传 图谱， 是以籼稻品种 IR36 和爪哇稻杂交的 F2群体的 53 个植株中检测到等位 RFLP 分离而建立的 。 1994 年 ， Causse 等[9]又构建了 1 张含有 726 个 RFLP 分子标记的更 饱和的遗传图谱。陈洪等[10]构建了含有 52个 RAPD标记的 水稻分子标记图谱，总长度为 898.4 cm，标记间平均间距 为 17.3 cm。 熊立仲等[11]用野生稻(Oryza rufipogon Griff)杂 交的 F2和栽培稻品种矮脚南特为群体，构建了含有 612 个 分子标记的水稻遗传图谱，该图谱总长度为 1 973 cm，标 记间平均距离仅为 3.2 cm。 目前，利用 SSR标记已成功地 将水稻耐冷性基因定位于第 4、8 号染色体上，且与分子标 记 RM280、RM337紧密连锁， 水稻隐性香味基因位于第 8 号染色体上，在 SSR 标记 GROI 和 RM233 之间，且与 2 个 标记间的遗传距离分别为 3.3、5.7 cm。 1991年，日本发表 了水稻分子图谱 [12]， 并且进展较快， 他们结合 RAPD 和 RFLP 技术构建的图谱含有 RAPD 和 RFLP 标记 1 100 个，平均图距为 1.4 cm[13]。 日本和美国在构建水稻分子图 谱时，积极合作，互相交换探针，将各自的分子图谱整合， 获得了更精细致密的图谱。现有的水稻分子遗传图谱含有 3 267个 RFLP标记，其中 2 600个表达序列标签(ESTs)已被 定位(http://rgp.Dna.aff rc.go.jp/publicatagenetic.map2000/index. html)。 3.2 基因定位及其克隆 收稿日期：2010-01-21 作者简介：魏凤娟(1973-)，女，硕士，农艺师，E-mail: weijf1973@ 163.com. 广东农业科学 2010 年第 8 期 185 C M Y K 主要缺点 DNA 需要量大、费 时费力、周期长、技 术复杂、需要同位 素等[4] 重复性差、信 息量少[4] 产生的标记多为 显性、技术复杂、 对 DNA 质量要求 高、需要同位素等[6] 成本高、难度大、 现有的 SSR 标记 数量有限、突变率 高[7] 标记大多为显性 标记、计算杂合度 和父系分析等效 果差 主要优点 多态性不受环境等因素 影响、具有共显性、数量 多、标记范围广[3] 引物短、无种属特异性、 DNA 需要量少、程序简 单、成本低[5] 多态性丰富、标记数量 多、DNA 需要量少、重 复性好、快速、经济简 便、信息含量高[6] 多态性丰富、重复性 好、稳定性强 DNA 需要量少、多态性 丰富、操作简单、可靠性 高、用时少、稳定性高、 呈孟德尔式遗传 基本操作 提取 DNA→限制性内切 酶酶切→单链转移至杂 交膜上→标记探针, 使探 针与杂交膜上的单链 DNA 杂交→放射自显影→显示 DNA 中含有的与探针的序 列同源的限制性片段 提取 DNA→加入随机引物 PCR 扩增→凝胶电泳→观 察、拍照 提取 DNA→限制性内切酶 酶切→连接酶连接限制性片 段两端→PCR 引物与 3'接 头特异性识别→特异性扩增 构建基因组 DNA 文库→筛 选含有 SSR 标记的克隆→ 测序阳性克隆→合成引物→ PCR 扩增→电泳分析多态性 DNA 提取→ISSR 引物筛选→ ISSR-PCR 扩增→凝胶电泳 →观察、拍照 技术原理 利用特定的限制性内切酶识别并 切割不同生物个体的基因组 DNA， 得到大小不等的 DNA 片段，产生 的 DNA 数目和各片段长度反映了 DNA 分子上不同酶切位点的分布情况 利用随机引物（一般为 8～10 bp）通过 PCR 反应非定点扩增 DNA 片段，扩增 片段多态性反映了基因组相应区域的 DNA 多态性 利用限制性内切酶水解基因组 DNA，产 生不同大小的 DNA 片段，再使酶切片段 相连接，作为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA，然后以人工接头 的互补链为引物预扩增，最后在添加 1～3 个选择性核苷酸为引物，对模板 DNA 基 因进行选择性扩增，通过凝胶电泳分离检 测获得的 DNA 片段，根据不同的扩增片 段长度检测其多态性 个体核心序列或不同品种的重复次数不同, 但此重复序列两侧的 DNA 序列是保守的， 利用与侧连区域互补的引物，通过 PCR 扩 增分析核心序列重复组数的变异性 用锚定的微卫星 DNA 为引物，在 SSR 序列 3'端或 5'端加上 2～4个随机核苷酸，在 PCR 反应中，锚定引物引起特定位点退火，导致与 锚定引物互补的间隔不大的重复序列间 DNA 片段进行 PCR 反应 分子标记 限制性片段 多态性(RFLP) 随机扩增多态 性 DNA(RAPD) 扩增片段长度 多态性(AFLP) 简单重复序列 (SSR) 内部简单重复 序列(ISSR) 表 1 几种主要分子标记的比较 基因定位即确定基因在染色体上的位置及与之相连 锁的分子标记。 目前，由分子标记已经定位了超过 100 个 控制水稻重要性状的基因。 作物许多重要经济性状是由 微效多基因控制的数量性状[14]，传统的数量遗传学研究方 法不完善， 如在鉴别单个数量基因以及与之有关的染色 体片段和确定 QTL在染色体上的位置等方面存在较大缺 陷。 DNA分子标记的建立和发展加快了作物 QTL作图及 其定位方法的进程。 在已被定位的基因中，抗病虫的基因 定位最多，尤其是抗稻瘟病和白叶枯病基因。 朱立煌[15]利 用分池法(DNA Pool)在第 8 号染色体上定位了 1 个未知 的稻瘟病基因 , 命名为 Pi-zh， 与分子标记 BP127A， RG28，RG1034 等连锁。 美国学者 WU 等 [16]研究结果表明 Pi-62(t)基因位于水稻第 12 号染色体上，与 RZ816～RG9 的 22 个分子标记连锁， 且与 SP7C3、SP8C6、SP7H8 共分 离。利用 BAC库构建了包含该基因在内的饱和物理图谱； 通过染色体步移技术，对 Pi-62(t)基因进行亚克隆，目前已 获得了与 Pi-62(t)基因紧密连锁的 3个 BAC 克隆；同时定 位于上述区域还有 Pi-ta，Pi-b， 位于第 2 号染色体，与 RFLP标记 C2782B～C97的 22 个分子标记连锁，其他相关 标记分析发现 2 个相互重叠 YAC 克隆 Y3802 和 Y6791 与上述标记相关[17]。 目前，已从水稻品种资源中发现至少 19个抗白叶枯病基因[18]，科学家们利用经典遗传学方法对 大多数抗性基因进行了定位： 位于第 4 号染色体上的有 Xa-1、Xa-12、Xa-2、Xa-4； 位于第 5号染色体上的有 Xa- 5、Xa-13；位于第 10 号染色体上的有 Xa-3、Xa-4a(Xa-W, Xa-4b,Xa-6,Xa-a)、Xa-10、Xa-21[19]，且 Xa-21 基因被认为 是最有效的抗白叶枯基因。 Ronald 等 [20]对在 123 个 DNA 标记和 985 个随机引物中发现了 RFLP 标记的 RG103 以 及另外 2 个 RAPD 标记的 RAPD818 和 RAPD248 都位于 水稻的第 11 号条染色体上，且这 3 个标记与 Xa-21 基因 紧密连锁。此外，其他已定位的基因主要还包括恢复基因、 广亲和基因、高秆隐性基因、显性核不育基因和光敏雄性 核不育基因等。 3.3 种质资源的保存和遗传多样性分析 我国稻作历史悠久，稻区分布辽阔，经过长期自然 与人工选择已经形成丰富的稻种资源。但要长期保存这 些遗传资源其费用昂贵，随着相关资料的积累，鉴定并 淘汰重复资源、筛选数量少而保存多的遗传变异成为当 务之急。 利用 DNA 分子标记对物种间在 DNA 水平上的 多态性资料进行统计分析， 可以确定其核心种质资源、 了解其同源程度，以便能够用最少的种质资源而最大限 度地代表其遗传多样性。 赵勇等 [21]利用 16 对 SSR 引物 研究了来自不同国家的 23 份水稻种质资源的遗传多样 性， 结果表明水稻功能基因 SSR 标记能够有效地分析 水稻资源分类、地理分布、生态类型及系谱图谱等。 华 蕾等 [22]用 40 个 SSR 标记比较分析了 151 份我国常规稻 186 C M Y K 的遗传差异， 发现 39 个标记具有多态性， 且共检测到 213 个等位基因，每个位点为 2～11 个，平均 5.5 个，研究 还表明近 10 年来我国常规稻主栽品种丢失了一部分等 位基因， 水稻育种仍需加强对更广泛的种质亲本的选 择。 敖光辉等（2008）用 321 对 SSR 引物筛选 18 份籼粳 稻亚种多态性，筛选到 168 对引物具有明显的标记且多 态性较好。 3.4 分子辅助育种 在作物遗传育种中， 利用分子标记进行辅助选择 (MAS)可以提高选择的准确率与育种效率。近年来，利用分 子标记辅助水稻育种已取得重大进展， 尤其是关于抗稻 瘟病的研究则更多， 且关于抗病性基因方面的分子标记 辅助选择准确率较高。 郑康乐等[23]报道，国际水稻所利用 分子标记辅助选择方法成功地获得聚合了 3 个抗白叶枯 病基因和 3个抗稻瘟病基因的株系。陈红旗等[24]将分子标 记辅助选择方法与特异稻瘟病菌株接种鉴定和农艺性状 筛选相结合， 将 3 个抗稻瘟病基因 Pi-1、Pi-2 和 Pi-3 导 入保持系金 23B， 结果表明其对稻瘟病的抗病频率为 96.7%。彭琴等（2008）高结实率多倍体水稻杂种 F2代分子 标记的分离分析结果表明，水稻植株的杂合度越高，平均 结实率就越高。 4 展望 分子标记技术是分子生物学的重要组成部分。 随着 分子生物学理论和技术的不断更新与完善， 必将有更多 分析速度更快、成本更低、信息更大、稳定性更高的分子标 记被开发。 分子标记技术已被广泛用于作物育种，并取得 了较大成效， 但由于每种分子标记技术都有自身的优缺 点， 在各自特定的领域中均有不可替代的作用。 因此，需 要各种分子标记技术相互融合、 相互渗透才能更好地运 用于实际育种工作中。 参考文献： [1] Lvan hintum T J. 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