维生素B12的生物合成、发酵生产与应用

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, June 25; 24(6): 927-932 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn © 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved Received: March 13, 2008; Accepted: April 7, 2008 Supported by: the National Project of Scientific and Technical(No. 2007BAI46B06). Corresponding author: Hong Yi. Tel: +86-311-88632172; E-mail: yihonglaoshi@163.com “十一五”国家科技支撑计划项目(No. 2007BAI46B06)资助。 综 述 维生素 B12的生物合成、发酵生产与应用 马蕙, 王丽丽, 张春晓, 仪宏 河北科技大学生物科学与 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院, 石家庄 050018 摘 要: 维生素 B12(VB12)是一种重要的动物和人类营养因子, 广泛应用于饲料、食品和医药卫生领域。中国已成为全球 VB12的主要产地, 2007年产量为 27 t, 占全球总产量的 77%。VB12是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子, 化学合 成极其困难, 所有 VB12产品均采用生物发酵制备其主体结构。VB12主要由古生菌和一些真细菌通过有氧或厌氧两种途径 合成, 工业上主要采用费式丙酸菌(Propionibacterium freudenrechii）和脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)进行发酵生 产。综述了 VB12的基本性质, 生物合成途径, 以及发酵生产工艺, 并对 VB12的应用与市场前景作了 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 关键词 : 维生素 B12, 生物合成 , 发酵 , 应用 Biosynthesis, Fermentation and Application of Vitamin B12 – a Review Hui Ma, Lili Wang, Chunxiao Zhang, and Hong Yi College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050018, China Abstract: Vitamin B12 is an important nutrient widely used in feed, food and medicine field. China is the primary producing area and the VB12 production is 27 t in 2007, 77% of total production in the world. VB12 is the most complex small molecule difficult to chemosynthesize. It ismanufactured by bacteria and archaea via two alternative routes, aerobic or anaerobic pathway. The main strains used in industry fermentation are Propionibacterium freudenrechii and Pseudomonas denitrificans. The basic characteristics, biosynthesis and fermentation of vitamin B12 are reviewed. The vitamin B12 application and market are also summarized. Keywords: vitamin B12, biosynthesis, fermentation, application 1 维生素 B12简介 维生素 B 1 2 , 简称 V B 1 2 , 又称为钴胺素 (cobalamin), 是一类含有钴的咕啉类化合物总称。它 是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子, 也是 唯一含有金属离子的维生素; 其结晶为红色, 故又 称红色维生素。VB12最初是由 Minot 和 Murphy 于 1926年用肝浸膏治疗恶性贫血时发现[1], 1948年由 Rickes 和 Smith 分别从肝脏中纯化和结晶[2,3], 1956 年由 Hodgkin 等用 X-射线法 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 了其晶体结构[4], 如图 1所示, 即中心咕啉环、中心环轴向 Coβ配基部 分及 1 个含有核苷酸环的 Coα配基。中心咕啉环由 相连的 4 个吡咯和 1 个钴原子组成, 钴螯合在 4 个 吡咯中心。咕啉环轴向上方的配基不同(即 Coβ配基 928 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2008 Vol.24 No.6 Journals.im.ac.cn 不同), 则会产生不同形式的钴胺素类物质, 如腺苷 钴 胺 素 (Adenosylcobalamin) 或 甲 基 钴 胺 素 (Methylcobalamin)。由于其结构复杂, 所以它也是自 然界中生物合成途径最繁琐的小分子生物物质 [5]。 1972 年美国科学家伍德沃德(Woodward, R.B)领导 100 多个合作者历时 11 年, 共同完成了全化学合成 工作[6]。 2 维生素 B12的生物合成 作为最复杂的和十分重要的小分子, VB12 的生 物合成已有详尽研究。VB12主要由古生菌和一些真 细菌通过有氧或厌氧两种途径合成, 涉及到相关合 成基因 30 余个 [5], Battersby、Blanche、 Scott、 Warren、Escalante-Semerena等通过对脱氮假单胞菌 图 1 维生素 B12 及其衍生物的结构[5] Fig. 1 Structure of vitamin B12 and some of its derivatives The numbering and labeling of the molecule are shown together with the names used to refer to incomplete derivatives of the compound (Pseudomonas denitrificans)的研究, 阐明了 VB12好 氧合成路径[5,7–11]。对厌氧合成路径的研究主要源于 以 下 3 种 菌 : 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 (Salmonella typhimurium)[12] 、 巨 大 芽 孢 杆 菌 (Bacillus megaterium)[13]和费氏丙酸杆菌 (Propionibacterium freudenreichii)[14], Roessner和 Scott对 VB12的厌氧合 成路径做了专门综述[15]。 2.1 ALA 的生物合成 VB12 的生物合成从五碳前体 5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolaevulinic acid, ALA)开始[11]。ALA可通过 C4或 C5两条途径合成。C4途径中, 由琥珀酰 CoA 和甘氨酸在 ALA合成酶的催化下合成 ALA。C5途 径从谷氨酸开始, 在谷胺酰-tRNA 合成酶的催化下, 谷氨酸转移到 tRNA 分子上, 形成谷胺酰-tRNA, 谷 胺酰-tRNA 在谷胺酰-tRNA 脱氢酶的作用下, 合成 谷胺醛(glutamate 1-semialdehyde, GSA), 再经谷胺 醛氨基转移酶的催化合成 ALA[11]。 2.2 从 ALA 到尿卟啉原Ⅲ的生物合成 这是好氧途径和厌氧途径共同的步骤, 该过程 由 ALA脱水酶(HemB)催化 2个 ALA分子形成胆色 素原(Porphobilinogen), 再经胆色素原脱氨酶(HemC) 催 化 形 成 含 4 个 吡 咯 的 分 子 前 尿 卟 啉 原 (preuroporphyrinogen), 再由尿卟啉原Ⅲ合成酶 (HemD)催化 4 个吡咯分子环化形成尿卟啉原Ⅲ (uroporphyrinogen Ⅲ)[10]。 2.3 由尿卟啉原Ⅲ到前咕啉 6(precorrin 6)或钴- 前咕啉 6(Co-precorrion 6)的生物合成 该过程涉及环缩合和去乙酰基, 是好氧过程和 厌氧过程主要不同的环节。在好氧合成途径中形成 前咕啉 6, 催化这一过程需要 5个依赖于 SAM(S-腺 苷-L-甲硫氨酸) 的甲基转移酶(CobA, CobG, CobJ, CobM和 CobF)逐步转移 6个甲基基团, 并以单加氧 马蕙等: 维生素 B12的生物合成、发酵生产与应用 929 Journals.im.ac.cn 酶催化氧原子的结合而著称[10]。 在厌氧合成途径中则将尿卟啉原Ⅲ转化成钴- 前咕啉 6。该过程也需要 5 个甲基转移酶(CysG 或 CbiK, CbiL, CbiH, CbiF), 但不同的是早期将钴原子 并入到大环中。合成前咕啉 2 之后, 即将钴原子螯 合到大环中, 形成钴-前咕啉 2, 具有螯合钴原子的 酶在不同生物中所催化的酶不同, 如 S. typhimurium 的 CysG、CbiK和 P. freudenreichii、B. megaterium 的 CbiX酶都有相同的酶活性。 2.4 将前咕啉 6/钴-前咕啉 6 转化成腺苷钴胺素 好氧途径中, 前咕啉 6经还原、甲基化、脱羧、 甲基重排及酰胺化反应生成钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺 (Cob(Ⅱ)yrinic acid a, c-diamide)。CobK还原生成二 氢前咕啉 6(Dihydro-precorrin 6), 再经 CobL催化的 C-5和 C-15位的甲基化及脱羧, 合成前咕啉 8, 前咕 啉 8 在 CobH 催化下 , 经甲基重排形成氢咕啉酸 (Hydrogenobyrinic acid), 氢咕啉酸在 CobB 催化下 酰胺化形成氢咕啉酸 a, c-二酰胺(Hydrogenobyrinic acid a, c-diamide), 好氧菌利用依赖于ATP的钴鏊合 酶(CobNST)催化钴元素插入到氢咕啉酸 a, c-二酰胺 的咕啉环中心 , 从而得到具有钴元素的中间体 , 钴 (Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinic acid a, c-diamide)。 在厌氧途径中没有发现 CobNST复合物。 厌 氧 途 径 中 , 钴 前 咕 啉 6 在 CbiJ 、 CbiE(CbiEGH)、CbiT、CbiC和 CbiA等酶的作用下, 也经过还原、甲基化、脱羧、甲基重排及酰胺化反 应生成钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinic acid a, c-diamide)。除了厌氧途径中二氢前咕啉 6、前咕 啉 8 和氢咕啉酸由相应的钴化合物替代外 , 好氧 和厌氧途径中将前咕啉 6 或钴-前咕啉 6 转化成 腺苷钴胺素过程中的中间产物结构可看作是相 同的 [10]。 从钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺之后,好氧和厌氧合成 路径又重新趋于一致。钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺经过还 原、腺苷化、酰胺化等步骤, 最终合成腺苷钴胺素, 好氧与厌氧途径中的中间产物完全一致, 只是利用 的催化酶有所差异[10]。 目前 VB12 合成路径中的大部分中间产物结构 都已阐明, 但仍有少量中间产物如钴-前咕啉 6A, 6B, 7等的结构尚未阐明[15], 仍在继续研究之中。 3 VB12的工业生产 由于 VB12的结构极为复杂, 其化学合成高度繁 琐昂贵, 从肝脏等动物组织提取的效率和效益也十 分低下, 所以只能通过微生物发酵法来实现商业化 生产[16,17]。较早期采用链霉素发酵废液提取, 上个世 纪 70年代被专门发酵取代。 3.1 菌株 只有原核微生物才能合成 VB12, 可用于生产的 菌株及其报道产率见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1[18]。 其中, P. shermanii和 P. denitrificans是目前工 业生产 VB12的主要生产菌种, P. shermanii的生产水 平达到 30~40 mg/L, P. denitrificans的生产水平达到 100~160 mg/L。 表 1 生产 VB12 的各种细菌及其产率 Table 1 Bacteria producing VB12 and the corresponding yield Strain Yield/(mg/L) Bacteria FM-02T 2.6 Rhodopseudomonas sp. 2.3 Methanobacillus omelianskii 8.8 Methanobacillus mixture 35 Micromonospora sp. 11.5 Nocardia gadneri 4.5 N. rugosa 14 Propionibacterium freudenreichii 25 Propionibacterium shermanii 23~39 Propionibacterium vannielli 25 Protoaminobacter ruber 2.5 Pseudomonas denitrificans 59 Streptomyces olivaceus 8.5 3.2 发酵工艺 3.2.1 厌氧发酵工艺 菌株采用 P. shermanii。该菌从葡萄糖降解产生 丙酸(PA)、乙酸(AA)的 Wood-Werkman 途径中, 涉 及一个关键酶——甲基丙二酰 CoA 异构酶, 该酶需 要 VB12作为辅酶, 所以 P. shermanii 含有一条从头 合成 VB12的完整途径。在 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 研究方面, 已经有 许多针对丙酸杆菌的基本生理特性进行工艺优化的 报道。例如: 日本学者 Ye等[19,20]报道了一种由厌氧、 好氧周期交替循环的新型操作工艺。Ye的工作发现 氧是改变细胞代谢途径的一个关键参数。在厌氧阶 段, 葡萄糖降解产生丙酸、乙酸及 CO2, 同时胞内合 930 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2008 Vol.24 No.6 Journals.im.ac.cn 成 VB12; 在微好氧阶段, 可以降低丙酸的抑制。因 此适当的厌氧和好氧交替, 可以充分促进菌体生长, 提高 VB12 产量。为了解除胞外丙乙酸的抑制 , Hatanaka 等 [21]曾建立了一套由中空纤维滤膜器和 VB12 发酵罐组成的膜反应系统, 滤膜器可有效去除 发酵过程中产生的丙酸。使用这套膜反应器进行 P. shermanii 发酵, VB12产量比普通发酵罐发酵产量提 高 24 倍。德国 GBF 的研究人员采用糖蜜原料和两 阶段发酵工艺 , 在第一阶段以获得丙酸为主 , 第二 阶段获得 VB12为主[22]。Shimizu 报道, 采用细胞循 环技术(膜反应器)可以有效解除 PA和 AA的抑制作 用, 或者采用与 Ralstoia eutropha H16混合培养技术, 利用 R. eutropha降解 PA和 AA, 也可以提高发酵效 率[23]。在实际工业生产方面, 经过近几年的市场竞 争 , 仅剩下石药集团保留一条百吨罐的生产线 , 它 以 P. shermanii 为生产菌株, 该工艺主要流程如下: 冷冻管菌种; 软营养琼脂穿刺培养 30°C, 4 d; 母瓶 30°C液体培养 3 d; 一级种子罐 30°C培养 2 d; 二级 种罐 30°C培养 2 d、用氨水维持 pH 6.5; 发酵罐 30°C 培养 90 h、缓慢间歇搅拌、用氨水维持 pH 6.5。 培养基以葡萄糖为主要碳源, 玉米浆为主要氮 源, 补加钴离子及前体 5,6-二甲基苯丙咪唑(DBI)。 该工艺 VB12 产物中 80%以上为腺苷钴胺素 (Ado-VB12), 并且杂质相关物含量低 , 在生产腺苷 钴胺素时比采用 P. denitrificans 的好氧工艺具有明 显优势。 由于 Propionibacterium属于经典安全菌(GRAS), 人们更喜欢用丙酸菌生产 VB12, 对其研究也越来越 深入, 拟从基因工程的角度提高 VB12的合成量。如 Sattler等[24]从 P. freudenreichii (shermanii)中克隆了 Urogen III甲基转移酶 cobA基因, Roessner等[14]也从 该菌中克隆了 UrogenⅢ到 VB12合成过程中的 14个 基因。为了有效的利用 VB12生物合成基因, 科研人 员建立了 P. freudenreichii (shermanii)的遗传转化系 统[25–27]。 Piao等[28]将VB12合成过程中 hemB和 cobA 基因导入 P. freudenreichii, 使得其 VB12的合成量提 高到原来的 2.2倍。 3.2.2 好氧发酵工艺 好氧发酵工艺是目前工业化生产 VB12 的主要 工艺 , 全球 80%以上的产量来自该工艺 , 以 P. denitrificans 为生产菌株, 培养基采用甜菜糖蜜或麦 芽糖为主要碳源 , 玉米浆或酵母膏为氮源 , 补加无 机盐、钴离子以及 DBI。在实验室研究方面, Marwaha 等[29]报道甜菜碱对发酵的促进作用, 张嗣良等[30]报 道了基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技 术。在实际工业生产方面, 除了 DSM在欧洲保留一 条好氧生产线之外, 国内的石药集团、华药集团和 玉峰生物工程公司也采用好氧工艺, 发酵装置采用 120 m3 的标准好氧发酵罐, 一般采用流加碳源的分 批补料工艺, 发酵最适温度 28°C, pH 7.0, 发酵过程 添加甜菜碱 1.5%~2%, 发酵周期 180 h左右, 发酵结 束时细胞内和细胞外均含 VB12, 最终含量约 100~160 mg/L。该工艺的发酵单位超过了厌氧工艺 的三倍, 所以在生产氰钴胺素(CN-Ado)时具有很大 优势 , 而氰钴胺素因为其化学性质稳定 , 而成为 VB12在饲料等领域的主要应用形式。 3.3 维生素 B12 的提取工艺 发酵结束时, P. shermanii所产生的 VB12集中在 胞内, P. denitrificans 产生的 VB12胞内和胞外都有, 因此两种微生物的提取工艺略有差异。P. shermanii 厌氧发酵结束后, 过滤收集菌体, 加热水解使 VB12 释放到胞外, 再次过滤收集滤液, 经吸附、解吸、氰 化钠转化、再吸附、再解吸、层析、结晶、干燥得 到成品[16]。目前厌氧工艺的总收率为 50%~70%。P. denitrificans 好氧发酵结束后, 发酵液直接加热水解, 释放出胞内 VB12, 液固分离后, 滤液交由树脂吸附, 开始后续分离纯化操作。一般采用树脂原位氰化 , 目前好氧工艺的总收率达到 80%左右。 4 应用与市场 4.1 VB12 的应用 4.1.1 医疗与保健方面的应用 主要用于治疗各种 VB12缺乏症, 例如: 可以治 疗巨幼红细胞性贫血、药物中毒引起的贫血、再生 障碍性贫血和白细胞减少症等[31,32]; 与泛酸搭配使 用, 可以预防恶性贫血症, 有助于 Fe2+的吸收和胃 酸的分泌; 也被用于治疗关节炎、面部神经麻痹、 三叉神经痛、肝炎、疱疹、哮喘和其它过敏症、过 敏性皮炎、寻麻疹、湿疹和滑囊炎; VB12还可以用于 神经质、烦躁、失眠、记忆减退、抑郁病症的治疗[33]。 新的研究表明, VB12 缺乏还会造成抑郁症等精神疾 病。VB12 作为治疗剂或保健品是十分安全的, 超过 马蕙等: 维生素 B12的生物合成、发酵生产与应用 931 Journals.im.ac.cn RDA 几千倍以上的 VB12被静脉或肌肉注射没有发 现中毒现象。 4.1.2 在饲料方面的应用 VB12能够促进家禽、家畜特别是幼禽、幼畜生 长发育、提高饲料蛋白质的利用率, 从而可用作饲 料添加剂[16]。用 VB12水溶液处理鱼卵或鱼苗, 能够 提高鱼对水中有毒物质如苯和重金属的耐受力, 降 低死亡率。自从欧洲“疯牛病”事件后, 采用维生素等 化学结构明确的营养强化剂来替代“肉骨粉”有了更 大的发展空间。目前世界上生产的 VB12大部分用于 饲料工业。 4.1.3 在其它方面的应用 在发达国家, VB12与其他物质复配用于化妆品; 在食品工业上, VB12可作为火腿、香肠、冰淇淋、鱼 肉酱等食品的着色剂。在家庭生活中, 将 VB12溶液 吸附在活性碳、沸石、无纺纤维或纸上, 或制成肥 皂、牙膏等; 可用于厕所、冰箱等的防臭, 消除硫化 物和醛的气味; VB12 也可用于环保中土壤和地表水 常见污染物——有机卤化物的脱卤。 4.2 VB12 的国内外市场分析 自 1949年美国施贵宝公司、礼莱公司、普强公 司和雅培公司等进行工业化生产开始, 在以后的几 十年里, VB12需求量增长缓慢。自上世纪 90年代起, 其市场容量有了较快增长, 到 2002 年达到 20 多吨, 美国、德国、印度和中国为主要生产国。其中, 美 国市场上 VB12药用约占 40%, 饲料用约占 36%, 食 品用约占 24%。 在 2003 年之前的较长一段时期, VB12价格比较昂贵和稳定, 1990 年以前, 国际市场 价格为每千克 5000~5500美元, 90年代中期, 上升到 6500~7000美元, 2002年, 我国出口报价 7200~7500 美元[33]。2003 年, VB12产量迅速增加, 供求关系发 生变化 , 国际价格下跌迅速 , 目前已经不足每千克 3000美元。 国内, 1966年华北制药厂率先生产 VB12。20世 纪 60~70 年代, VB12在全国年产量仅有几十千克。 到 80 年代末, 年产量达到 150 kg。自 90 年代中期 起, 进入高速增长期, 1999、2000、2001年其年产量 分别为 3.4 t、4.3 t和 6.2 t, 2003年上升到 10 t以上。 2003 年以来出口价格下降, VB12产量增幅已不如前 几年, 但产量仍不断增加[33], 到 2007年VB12及其衍 生物生产总量为 27 t, 占全球总产量的 77%, 中国成 为 VB12 主要生产国。国内生产企业有华北制药集 团、石药集团、河北玉峰集团、宁夏多维药业等。 2007年, 我国VB12(含衍生物)出口数量为 21 t, 占国 内产量的 78%, 出口市场主要是美国、印度、德国、 日本和荷兰。 就消费与市场区域来讲, 由于欧、美、日各国 经济发达, 他们是 VB12消费的最主要市场, 目前基 本保持在 3%~5%的需求增长速度 ; 亚洲对包括 VB12 在内的维生素的需求也不断增加, 年增长率保 持在 10%~15%。目前, 无论是作为动物饲料, 还是 用于药品、食品添加剂, 维生素预混剂使用已超过 了单一应用, 这一趋势还在不断增加。 就国内市场而言, 随着我国经济的发展和居民 生活水平的提高, VB12需求将持续扩展。主要来自三 个方面的推动力: 其一是饮食结构变化, 对肉类、家 禽、蛋类等食物的消耗将持续增长, 这将导致动物 养殖业和饲料产业的发展, 饲料工业对 VB12的需求 将持续增加; 其二是健康意识的提高, 导致普通健 康人群对维生素类以及添加维生素的营养食品、保 健食品的需求日益增大; 其三是老龄化社会的到来, 对 VB12 缺乏症的医疗保健和食品强化的需求将会 稳步增加。 REFERENCES [1] Minot GR, Murphy WP. 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