SNT 2833-2011 委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范

SNT 2833-2011 委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８３３—２０１１委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狏犲狀犲狕狌犲犾犪狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 · 禁止翻制、电子发售书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织公布的《陆生动物手册》（２００９年...

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８３３—２０１１委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狏犲狀犲狕狌犲犾犪狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 · 禁止翻制、电子发售书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织公布的《陆生动物手册》（２００９年版）第２．５．１４章“委内瑞拉马脑脊髓炎”。除编辑性修改外，主要技术变化如下： ———细化了间接免疫荧光分型试验方法； ———增加了血凝试验内容； ———修改了ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ的底物作用时间为３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ； ———删除了补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、肖进文、李应国、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、朱来华、周启明。 Ⅰ 犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范１　范围本标准规定了委内瑞拉马脑脊髓炎的病毒分离、间接免疫荧光分型试验、血凝抑制试验、ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ和蚀斑减数中和试验的技术要求。本标准适用于进出境动物的委内瑞拉马脑脊髓炎检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＶＥＥ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：委内瑞拉马脑脊髓炎ＥＥＥ（ｅａｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：东方型马脑脊髓炎ＷＥＥ（ｗｅｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：西方型马脑脊髓炎ＲＫ１３细胞系（ｒａｂｂｉｔｋｉｄｎｅｙ１３ｃｅｌｌｌｉｎｅ）：兔肾细胞系Ｖｅｒｏ细胞系（ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ）：非洲绿猴肾细胞系４　生物安全要求本标准的病毒分离、间接免疫荧光分型试验和蚀斑减数中和试验，均需要在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。人员需提前进行ＶＥＥ疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在１∶２０以上。５　样品采集５．１　试剂和材料采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见Ａ．１．３）、柠檬酸钠抗凝剂（配制见Ａ．１．４）。５．２　采样数量和类型采样的数量按照ＧＢ／Ｔ１８０８８的要求执行。样品类型包括：全血、血清、脑脊液、组织［脑和（或）脊髓］。１犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售５．３　采集方法５．３．１　血液样品无菌采集１０ｍＬ～１５ｍＬ全血，立即转至含柠檬酸钠抗凝剂（终浓度为１０％）的离心管中，低温运送。５．３．２　血清样品每头动物采集全血１０ｍＬ～１５ｍＬ，提取血清３ｍＬ以上，低温运送到实验室。５．３．３　脑脊液样品无菌采集脑脊液１ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．４　组织样品无菌采取动物的脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温４８ｈ内运送到实验室。如果４８ｈ内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。６　病原分离鉴定６．１　病毒分离６．１．１　设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥３０００犵）、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（１．０ｍＬ～１０ｍＬ）及配套枪头。６．１．２　试剂和材料６．１．２．１　ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞。６．１．２．２　ＭＥＭ培养基。６．１．２．３　３日龄～５日龄乳鼠。６．１．２．４　６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚。６．１．２．５　胎牛血清（无ＢＶＤＶ抗体及其他牛病抗体）。６．１．２．６　样品缓冲液，配制见Ａ．１．３。６．１．２．７　细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．１．２．８　ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．１．３　操作方法６．１．３．１　样品制备组织样品低温均质后，加入样品缓冲液制成１０％悬液，１５００犵，４℃离心２０ｍｉｎ。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。６．１．３．２　细胞分离试验用适量ＡＴＶ缓冲液，将培养的ＲＫ１３细胞和（或）Ｖｅｒｏ细胞传代。待细胞长至８０％～１００％，每瓶细胞按１０％体积加入样品悬液，３７℃感作１ｈ～２ｈ后加入细胞维持液，３７℃培养６ｄ～８ｄ，逐日观察２犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售细胞病变。每份样品接种ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞各２瓶，同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变，则将细胞反复冻融３次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞；将出现７０％～９０％细胞病变的细胞培养物反复冻融后，取上清液进行间接免疫荧光分型试验鉴定。６．１．３．３　鸡胚分离每份样品接种２枚～４枚６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚卵黄囊，每枚０．５ｍＬ，孵化７ｄ。弃２４ｈ内死亡鸡胚，收集２４ｈ后死亡的鸡胚，用间接免疫荧光分型试验鉴定。若第一代鸡胚无死亡，再盲传一代。６．１．４　结果判定６．１．４．１　细胞分离试验细胞对照无任何细胞病变，细胞生长良好，试验成立。若被检样品连传两代均无细胞病变则判定为阴性；若出现圆缩、脱落等细胞病变，进一步进行间接免疫荧光分型试验。６．１．４．２　鸡胚分离试验若连传两代，均无鸡胚死亡，判定为阴性；若出现鸡胚死亡，进一步进行间接免疫荧光分型试验。６．２　间接免疫荧光分型试验６．２．１　设备和器材生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、二氧化碳培养箱（３７℃±２℃）、超低温冰箱、荧光显微镜、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管和移液器等。６．２．２　试剂和材料６．２．２．１　丙酮（－７０℃预冷）。６．２．２．２　Ｖｅｒｏ细胞。６．２．２．３　ＭＥＭ培养基。６．２．２．４　ＶＥＥＶ病毒储液。６．２．２．５　胎牛血清（无ＢＶＤＶ及其他牛病病毒抗体）。６．２．２．６　正常小鼠腹水，用无菌ＰＢＳ稀释到１∶１６０。６．２．２．７　多价ＶＥＥ抗体，由指定单位提供。６．２．２．８　ＦＩＴＣ标记的抗小鼠抗体，使用商品说明书推荐的稀释度或预试验确定。６．２．２．９　ＶＥＥ单克隆抗体：１Ａ３Ａ５（１ＡＢ，１Ｃ特异性）；１Ａ１Ｂ９（１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ特异性）；１Ａ６Ｃ３（１ＡＢ特异性）；３Ｂ４Ｃ４（１ＡＢ，１Ｃ，１Ｄ特异性）。６．２．２．１０　细胞生长液和细胞维持液，配制见Ａ．２．１。６．２．２．１１　ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．２．２．１２　ＰＢＳ溶液，配制见Ａ．３．１。６．２．２．１３　封固溶液，配制见Ａ．３．２。６．２．３　操作步骤６．２．３．１　细胞准备试验前１ｄ～２ｄ，将Ｖｅｒｏ细胞用ＡＴＶ缓冲液消化传代到Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，３７℃、５％二氧化碳培养。待细胞长至８０％～１００％，移去管内的培养液，换成细胞维持液。对于每一个分离株的鉴定，需准３犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售备３６支Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管。６．２．３．２　固定和预染色６．２．３．２．１　用无血清ＭＥＭ培养基将分离株从１０－２到１０－５梯度稀释。每个梯度样品接种６支～８支Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，０．１ｍＬ／管。取６支作正常细胞对照，用ＭＥＭ（１×，ｐＨ７．２）稀释各种亚型的ＶＥＥ病毒储液到１００ＴＣＩＤ５０～１０００ＴＣＩＤ５０后，接种Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管作阳性对照。３７℃、５％二氧化碳培养１８ｈ后，从每个稀释度各取１块玻片用丙酮固定，５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。６．２．３．２．２　用多价ＶＥＥ抗体做一抗，３７℃湿盒孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。ＰＢＳ润洗一次后，在新鲜ＰＢＳ中浸泡５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，双蒸水中润洗一次，置于玻片架上，细胞面向上。６．２．３．２．３　用ＦＩＴＣ标记的抗小鼠抗体做二抗，３７℃湿盒中孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。同前洗涤，空气中干燥，用荧光显微镜观察结果。若病毒生长量不足，再培养４ｈ～６ｈ或更长。确定出最佳感染效果后，将余下的坡片固定备用。固定好的玻片置于密闭的盒子中，－７０℃保存备用。６．２．３．２．４　组织冰冻切片（８μｍ），丙酮固定５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；组织涂片空气中干燥３０ｍｉｎ，丙酮固定。将固定好的片子密闭保存于－７０℃备用。６．２．３．３　染色用ＶＥＥ多价抗体、１Ａ３Ａ５，１Ａ１Ｂ９，１Ａ６Ｃ３，３Ｂ４Ｃ４和正常小鼠腹水做一抗，ＦＩＴＣ标记抗小鼠抗体做二抗，进行ＩＦＡ染色，方法同６．２．３．２．２和６．２．３．２．３。同时对阳性对照和正常细胞对照进行染色。６．２．４　结果判定若阳性对照出现特异性荧光，正常细胞对照无任何特异性荧光，且正常小鼠腹水做一抗的玻片无特异性荧光，则试验成立。将待检样品获得的试验结果和ＩＦＡ分型鉴定表（见表１）进行比较，确定感染的类型。表１　犐犉犃分型鉴定表亚型ＶＥＥ多价抗体１Ａ３Ａ５１Ａ１Ｂ９１Ａ６Ｃ３３Ｂ４Ｃ４正常小鼠腹水１ＡＢ＋＋－＋＋－１Ｃ＋＋－－＋－１Ｄ＋－＋－＋－１Ｅ，１Ｆ＋－＋－－－正常培养细胞－－－－－－　　注：“＋”代表有荧光，用“－”代表无荧光。７　血清学检测７．１　血凝抑制试验７．１．１　设备和器材Ｕ型血凝板、冷冻离心机（≥３０００犵）、温箱（３７℃±２℃）、移液器（８孔道和单孔道）及配套枪头。４犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售７．１．２　试剂和材料７．１．２．１　阳性血清（指定单拉提供）。７．１．２．２　阴性血清（指定单位提供）。７．１．２．３　抗原（指定单位提供）。７．１．２．４　２５％白陶土溶液（用硼酸盐缓冲液配制）。７．１．２．５　硼酸盐缓冲液（ｐＨ９．０），配制见Ａ．４．１。７．１．２．６　ＤＧＶ缓冲液，配制见Ａ．４．２。７．１．２．７　红细胞：采集公鹅血，用ＤＧＶ缓冲液洗涤３次，重悬于ＤＧＶ缓冲液中成７％悬液。存放于４℃备用。临用前用硼酸盐缓冲液１∶２４稀释。７．１．２．８　待检血清：５６℃灭活３０ｍｉｎ，取０．１ｍＬ待检血清加０．４ｍＬ２５％白陶土溶液，混匀，置于３７℃作用３０ｍｉｎ，３０００犵离心５ｍｉｎ，取上清液备用。７．１．３　操作方法７．１．３．１　犎犃试验将抗原用硼酸盐缓冲液作１０倍稀释，４℃放置１ｈ。在血凝板的第１孔～第１２孔加入０．０５ｍＬ硼酸盐缓冲液；吸取０．０５ｍＬ稀释后的抗原加入第１孔，混匀；从第一孔吸取０．０５ｍＬ混匀后的抗原加入第２孔，混匀后吸取０．０５ｍＬ至第３孔，依次倍比稀释至第１１孔。从第１１孔吸取０．０５ｍＬ弃之。每孔加入０．０５ｍＬ工作浓度的公鹅红细胞，室温孵育４５ｍｉｎ～６０ｍｉｎ后观察结果。以红细胞发生完全凝集的最高稀释度作为病毒抗原的１个血凝素单位（１ＨＡ）。配制８单位抗原用于ＨＩ试验。７．１．３．２　犎犐试验ＨＩ试验程序见表２。除第１孔外，血凝板的第２孔～第１０孔，每孔加入０．０２５ｍＬ硼酸盐缓冲液。第１孔和第２孔各加入０．０２５ｍＬ血清样品，混匀后从第２孔吸取０．０２５ｍＬ血清加入第３孔，依次倍比稀释至第８孔，混匀后从第８孔吸取０．０２５ｍＬ，弃去。第９孔和第１０孔不加血清，第９孔为血凝素对照，第１０孔为稀释液对照。除第１０孔外，每孔加入８单位抗原０．０２５ｍＬ，４℃，过夜（或２２℃～２４℃，反应１ｈ）。每孔加入０．０５ｍＬ工作浓度的鹅红细胞悬液，３７℃，３０ｍｉｎ后判定结果。每次试验设立阳性和阴性血清对照。表２　犎犐试验程序单位为毫升孔号１２３４５６７８９１０稀释梯度１／５１／１０１／２０１／４０１／８０１／１６０１／３２０１／６４０血凝素对照稀释液对照硼酸盐稀释液血清　０．０２５　　０．０２５０．０２５烍烌烎　０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎 →０．０２５０．０２５　　　０．０２５　　　０．０５８单位抗原０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５４℃，过夜（或２２℃～２４℃，反应１ｈ）红细胞０．０５反应３７℃，３０ｍｉｎ举例 — — — — — ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ — ５犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售７．１．４　结果判定阳性血清对照ＨＩ滴度误差不超过一个滴度，阴性对照ＨＩ滴度小于１／１０，试验才为有效；待检血清的ＨＩ滴度在１／１０～１／２０之间为可疑，大于１／４０为阳性，小于１／１０为阴性。可疑样品重复试验后仍大于１∶１０的判为阳性。７．２　犐犵犕捕获犈犔犐犛犃７．２．１　设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、温箱（３７℃±２℃）、洗板机、酶标仪（４０５ｎｍ）、ｐＨ仪、天平（０．１ｇ）、单道微量移液器（１μＬ～２０μＬ和２０μＬ～２００μＬ）、多道微量移液器（２０μＬ～２００μＬ）及配套枪头、９６孔微量反应板。７．２．２　试剂和材料７．２．２．１　ＡＢＴＳ底物溶液。７．２．２．２　捕获抗体（羊抗马ＩｇＭ抗体）。７．２．２．３　辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗（２Ａ２Ｃ３）。７．２．２．４　病毒抗原，由指定单位提供。７．２．２．５　正常组织抗原，由指定单位提供。７．２．２．６　阳性血清（血清ＯＤ４０５ｎｍ值不小于０．６）。７．２．２．７　阴性血清（血清ＯＤ４０５ｎｍ值小于０．２）。７．２．２．８　包被液、磷酸盐缓冲溶液、封闭液和ＰＢＳＴ溶液，配制见Ａ．５。７．２．２．９　检测样品：马血清和（或）马脑脊液。７．２．３　试验步骤７．２．３．１　样品准备：用ＰＢＳＴ溶液将阴阳性血清和被检血清１∶４００倍稀释；脑脊液做１∶２倍稀释。７．２．３．２　包被：用包被液稀释捕获抗体至工作浓度，每孔１００μＬ加至９６孔微量反应板，密封后置湿盒中４℃静置１４ｈ。包被好的微量反应板４℃可保存４５ｄ。注：每批捕获抗体应通过试验滴定以确定其最佳包被浓度。７．２．３．３　封闭：取７．２．３．２包被好的微量反应板，弃去孔内液体，每孔加入３００μＬＰＢＳＴ溶液进行洗涤，重复３次。每孔加入３００μＬ封闭液，室温封闭６０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ，弃去孔内液体，同前洗涤３次。７．２．３．４　参照表３，进行试验布局。表３　犈犔犐犛犃试验布局孔号１２３４５６７８９１０１１１２Ａ犅犾犪狀犽犅犾犪狀犽Ｓ１ａＳ１ａＳ２ａＳ２ａＳ３ａＳ３ａＳ４ａＳ４ａＳ５ａＳ５ａＢ犅犾犪狀犽犪犅犾犪狀犽犫Ｓ１ｂＳ１ｂＳ２ｂＳ２ｂＳ３ｂＳ３ｂＳ４ｂＳ４ｂＳ５ｂＳ５ｂＣＳ６ａＳ６ａＳ７ａＳ７ａＳ８ａＳ８ａＳ９ａＳ９ａＳ１０ａＳ１０ａＳ１１ａＳ１１ａＤＳ６ｂＳ６ｂＳ７ｂＳ７ｂＳ８ｂＳ８ｂＳ９ｂＳ９ｂＳ１０ｂＳ１０ｂＳ１１ｂＳ１１ｂＥＳ１２ａＳ１２ａＳ１３ａＳ１３ａＳ１４ａＳ１４ａＳ１５ａＳ１５ａＳ１６ａＳ１６ａＳ１７ａＳ１７ａＦＳ１２ｂＳ１２ｂＳ１３ｂＳ１３ｂＳ１４ｂＳ１４ｂＳ１５ｂＳ１５ｂＳ１６ｂＳ１６ｂＳ１７ｂＳ１７ｂＧＳ１８ａＳ１８ａＳ１９ａＳ１９ａＳ２０ａＳ２０ａＳ２１ａＳ２１ａ犘犆犪犘犆犪犖犆犪犖犆犪ＨＳ１８ｂＳ１８ｂＳ１９ｂＳ１９ｂＳ２０ｂＳ２０ｂＳ２１ｂＳ２１ｂ犘犆犫犘犆犫犖犆犫犖犆犫　　注：Ｂｌａｎｋ为空白对照，ＰＣ为阳性对照，ＮＣ为阴性对照，Ｓ为检测样品。ａ为正常组织抗原组，ｂ为病毒抗原组。一块９６孔微量反应板可检测２１个未知样品。６犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售７．２．３．５　加入稀释后的待检样品、阳性血清、阴性血清，空白对照孔用ＰＢＳＴ代替，每孔５０μＬ，３７℃、孵育９０ｍｉｎ～１０５ｍｉｎ。７．２．３．６　同前洗板３次。加入用ＰＢＳＴ稀释的病毒抗原和正常组织抗原，Ａ１和Ａ２孔加入５０μＬＰＢＳＴ，作无抗原对照。混匀，置湿盒中４℃孵育１４ｈ～２８ｈ。７．２．３．７　同前洗板３次。每孔加入５０μＬＰＢＳＴ稀释的辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗，３７℃、湿盒中孵育９０ｍｉｎ～１０５ｍｉｎ。７．２．３．８　同前洗板３次。每孔加入５０μＬ底物溶液，混匀、封口后在室温避光孵育３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ。７．２．３．９　用酶标仪测定ＯＤ４０５ｎｍ值。７．２．４　结果判定７．２．４．１　有效性判定分别计算阳性血清对照病毒抗原孔和阴性血清对照病毒抗原孔的平均ＯＤ４０５ｎｍ值，用阳性对照的平均ＯＤ４０５ｎｍ值除以阴性对照的平均ＯＤ４０５ｎｍ计算Ｐ／Ｎ值。Ｐ／Ｎ值≥２．０试验方有效。７．２．４．２　阳性临界值的计算阳性临界值等于两个阴性血清对照病毒抗原孔的平均ＯＤ４０５ｎｍ值再乘以２。７．２．４．３　结果判定被检样品的ＯＤ４０５ｎｍ值大于或等于阳性临界值，判定为阳性；被检样品的ＯＤ４０５ｎｍ值小于阳性临界值，判定为阴性；若同一样品病毒抗原孔产生的ＯＤ４０５ｎｍ值大于阳性临界ＯＤ４０５ｎｍ值，但正常抗原孔产生的ＯＤ４０５ｎｍ值大于病毒抗原孔产生的ＯＤ４０５ｎｍ，试验为非特异性反应，需重新试验。７．３　蚀斑减数中和试验（犘犚犖犜）７．３．１　设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、水浴锅、二氧化碳培养箱、倒置式光学显微镜、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、微量移液器（５０μＬ～２００μＬ）（及配套枪头）。７．３．２　试剂和材料７．３．２．１　试剂ＥＭＥＭ培养基、１０×Ｅａｒｌｅ’ｓＢＢＳ缓冲液，胎牛血清（ＦＢＳ）（无ＢＶＤＶ、ＶＥＥ、ＥＥＥ和ＷＥＥ抗体，并经辐照处理）、制霉菌素Ｂ、庆大霉素、碳酸氢钠溶液、中性红和铺板溶液（溶液Ⅰ和Ⅱ），配制见Ａ．６。７．３．２．２　材料Ｖｅｒｏ细胞、病毒储液（ＥＥＥ，ＷＥＥ，ＶＥＥ）、阳性血清（分别抗ＶＥＥ，ＥＥＥ和ＷＥＥ）、阴性血清、待检样品（血清和／或脑脊液）、玻璃移液管、离心管、细胞培养瓶。７．３．３　操作步骤７．３．３．１　病毒抗原的工作浓度确定７．３．３．１．１　病毒接种用ＥＭＥＭ无血清培养基将病毒储液从１０－１到１０－８梯度稀释后，每个梯度取０．２ｍＬ液体和７犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售０．２ｍＬＥＭＥＭ（含２０％ＦＢＳ）混合，３７℃孵育７５ｍｉｎ～８０ｍｉｎ。每个稀释度各接种两瓶Ｖｅｒｏ细胞，０．１ｍＬ／瓶，３７℃孵育１ｈ～２ｈ。７．３．３．１．２　铺板计数将铺板溶液Ⅱ置于５６℃水浴３０ｍｉｎ后转移到４７℃水浴，同时将铺板溶液Ⅰ置于４７℃水浴。铺板前１５ｍｉｎ配制铺板溶液：将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ等体积混合，置于４７℃水浴备用。弃去感作病毒液，每瓶加铺板溶液６ｍＬ，水平放置１５ｍｉｎ，待琼脂自然凝固后，３７℃倒置培养２ｄ～３ｄ。逐日观察每个稀释度的蚀斑形成情况。取最接近１００ｐｆｕ（蚀斑形成单位）的稀释度，按式（１）折算为１００ｐｆｕ／０．１ｍＬ的稀释度（Ｘ）。用该稀释度作为病毒储液的工作浓度。（ｐｆｕ／０．１ｍＬ）×（稀释度）＝（１００／０．１ｍＬ）×（Ｘ） ……………………（１）７．３．３．２　细胞准备将Ｖｅｒｏ细胞传于２５ｃｍ２细胞瓶中，待细胞长满备用。若同时检测ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ和ＶＥＥＶ，每次试验至少需１８瓶细胞作试验对照：３瓶用作细胞对照，６瓶用作感染工作浓度病毒对照（每种病毒２瓶），３瓶用作感染１０－１工作浓度病毒对照（每种病毒１瓶），６瓶用作ＥＥＥ、ＷＥＥ、ＶＥＥ阳性血清对照（每种病毒做两瓶：一瓶加１∶１０稀释血清，一瓶加１∶１００稀释血清）。每份样品，若同时做ＶＥＥ、ＥＥＥ和ＷＥＥ鉴别，需用６瓶细胞：每种病毒用２瓶，一瓶加１∶１０稀释血清，一瓶加１∶１００血清。７．３．３．３　血清样品的稀释７．３．３．３．１　无菌吸取０．２ｍＬ待检样品和阳性血清加入０．８ｍＬＥＭＥＭ（含１×抗生素）中做１∶５稀释后，取０．１ｍＬ稀释液加到０．９ｍＬ的ＥＭＥＭ（含１×抗生素）中，使得血清稀释度为１∶５０。样品和对照血清，５６℃灭活２５ｍｉｎ～３５ｍｉｎ。取１．５ｍＬ、离心管若干，如下分装： ———待测样品和阳性血清：每种病毒，各取１∶５稀释和１∶５０稀释的血清０．２ｍＬ分别加入不同的离心管中； ———病毒对照：每种病毒，取３支管，每支加入０．２ｍＬＥＭＥＭ培养基（２０％ＦＢＳ）。２支做工作浓度病毒对照，１支做１０－１工作浓度病毒对照； ———细胞对照：只含０．２ｍＬＥＭＥＭ培养基（１０％ＦＢＳ）。将配制好的样品和对照置冰盒中，备用。７．３．３．４　中和反应７．３．３．４．１　按７．３．３．１．２准备工作浓度病毒液（１００ｐｆｕ／０．１ｍＬ）。取０．２ｍＬ工作浓度病毒液加至１．８ｍＬＥＭＥＭ中，制备成１０－１工作浓度病毒液（１０ｐｆｕ／０．１ｍＬ）。７．３．３．４．２　取０．２ｍＬ工作浓度病毒液加入到７．３．３．３．１分装的待检血清和阳性血清中，稀释血清至１∶１０和１∶１００；取０．２ｍＬ稀释好的工作浓度病毒液和１０－１工作浓度病毒液加入到７．３．３．３．１的病毒对照中；细胞对照不添加病毒液。分别混匀，３７℃孵育７５ｍｉｎ～８０ｍｉｎ后转移到冰盒中备用。７．３．３．５　接种弃去细胞培养液，取７．３．３．４．２反应后的混合物０．１ｍＬ加至７．３．３．２准备的细胞单层，使混合液均匀布满整个细胞表面。细胞对照加０．１ｍＬＥＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）。３７℃孵育１ｈ～２ｈ，每隔２０ｍｉｎ摇动一次细胞瓶。７．３．３．６　铺板按照７．３．３．１．２的方法进行铺板。待琼脂自然凝固，３７℃、５％二氧化碳倒置培养２ｄ～３ｄ，观察结果。８犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售７．３．４　结果判定７．３．４．１　１０－１工作浓度病毒对照相对于工作浓度病毒对照蚀斑减少９０％±５％；阳性血清对照在１∶１０和１∶１００两个稀释度均无蚀斑出现，或蚀斑数在１０个以内；细胞对照组无任何病毒蚀斑，细胞生长良好，则试验成立。７．３．４．２　若样品出现较多蚀斑，数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的２０％（及以上），判定为阴性；若样品蚀斑数相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的１０％～２０％，判定为可疑；若无可见病毒蚀斑，或蚀斑数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的１０％（及以内），判定为阳性。８　结果报告８．１　病原分离鉴定病原分离试验阳性，且免疫荧光分型试验中只检测出一种病毒，或其中一种委内瑞拉马脑脊髓炎病毒的反应性大于其他委内瑞拉马脑脊髓炎病毒４倍以上，可判定该亚型的委内瑞拉马脑脊髓炎阳性。否则，报告为委内瑞拉马脑脊髓炎阴性。８．２　血清学检测在血凝抑制试验和病毒蚀斑减数中和试验中，任一试验结果为阳性，判定为委内瑞拉马脑脊髓炎抗体阳性，否则报告为委内瑞拉马脑脊髓炎抗体阴性；若同一动物的脑脊液和血清的ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ检测结果均为阳性，报告为委内瑞拉马脑脊髓炎阳性，否则，需进一步试验。９犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售附　录　犃（规范性附录）溶液配制犃．１　采样用试剂犃．１．１　犘犅犛／犅犛犃溶液配制磷酸氢钠　　　　　　　　　　１．１９ｇ磷酸二氢钠０．２２ｇ氯化钠８．５ｇ牛血清白蛋白（ＢＳＡ）７．５ｇ混合前三种药品，加双蒸水９００ｍＬ，用氢氧化钠调节ｐＨ至７．８，定容到１Ｌ。加入牛血清白蛋白，溶解后过滤除菌。４℃保存。犃．１．２　抗生素溶液青霉素Ｇ钾（１５８６Ｕ／ｍｇ）　　　　　１５．７７ｇ硫酸链霉素５０ｇ加水至１Ｌ，溶解后过滤除菌。－２０℃保存。犃．１．３　样品缓冲液在采集组织样品前，取抗生素溶液０．２ｍＬ加入１００ｍＬＰＢＳ／ＢＳＡ溶液。４℃保存。犃．１．４　柠檬酸钠抗凝剂柠檬酸钠　　　　　　　　３０ｇ柠檬酸１０ｇ葡萄糖２５ｇ加水１Ｌ。高压灭菌，室温保存。犃．２　病原分离用试剂犃．２．１　细胞生长液和维持液按照ＭＥＭ培养基说明书配制，通过添加氢氧化钠或者盐酸溶液调节ｐＨ值至６．９和７．２两个梯度，前者用于ＲＫ１３细胞培养，后者用于Ｖｅｒｏ细胞培养；并添加胎牛血清制备８％和２％两种不同血清浓度的培养基，前者作为细胞生长液，后者作为细胞维持液。犃．２．２　犃犜犞缓冲液氯化钠　　　　　　　８．０ｇ氯化钾０．４ｇ右旋葡萄糖１．０ｇ碳酸氢钠０．５８ｇ０１犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售胰蛋白酶０．５ｇ乙二胺四乙酸二钠０．２ｇ５％酚红０．４ｍＬ加双蒸水到８００ｍＬ，用氢氧化钠溶液调节ｐＨ到７．２，定容至１Ｌ。过滤除菌。－２０℃保存。犃．３　犐犉犃试验用试剂犃．３．１　犘犅犛溶液氯化钠　　　　　　　８．５０ｇ磷酸氢钠１．３３ｇ磷酸二氢钠０．２２ｇ加水至９００ｍＬ，用氢氧化钠溶液调节ｐＨ至７．２，定容至１Ｌ。１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌。室温保存。犃．３．２　封固溶液甘油／ＰＢＳ溶液（１∶１，体积比），１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌后存放于室温。犃．４　血凝抑制试验用试剂犃．４．１　硼酸盐缓冲液（狆犎９．０，含０．４％犅犛犃）１．５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠　　　　１６０ｍＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ硼酸２００ｍＬ１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠４７ｍＬ加水至１８００ｍＬ，用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液或０．５ｍｏｌ／Ｌ硼酸调节ｐＨ到９．０，定容至２Ｌ。每升硼酸盐缓冲液加入４ｇ牛血清白蛋白。犃．４．２　犇犌犞缓冲液犃．４．２．１　犃液明胶　　　　　　　　　　　　０．６００ｇ二乙基巴比妥酸（巴比妥）０．５８０ｇ犃．４．２．２　犅液巴比妥钠　　　　　　　０．３８０ｇ无水氯化钙０．０２０ｇ氯化钠８．５００ｇ葡萄糖１０．０００ｇ硫柳汞０．１００ｇ七水硫酸镁０．１２０ｇ犃．４．２．３　配制分别用２５０ｍＬ和７５０ｍＬ水溶解配制Ａ液和Ｂ液。混合Ａ液和Ｂ液，１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌后于室温保存。１１犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售犃．５　犈犔犐犛犃试验用试剂犃．５．１　包被液无水碳酸钠　　　　　　０．３８６ｇ无水碳酸氢钠０．７６ｇ蒸馏水２００ｍＬ用５ｍｏｌ／Ｌ盐酸将ｐＨ调至９．６±０．０５，４℃保存，１周内使用。犃．５．２　磷酸缓冲溶液（犘犅犛）氯化钠　　　　　　　　８．５ｇ磷酸二氢钠０．２２ｇ磷酸氢二钠１．１９ｇ加水９００ｍＬ，用盐酸将ｐＨ调至７．２±０．１，定容至１Ｌ，１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌后室温保存。犃．５．３　犘犅犛犜溶液０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ　　　　１．０Ｌ吐温２００．５ｍＬ犃．５．４　封闭液脱脂奶粉　　　　　　　５．０ｇＰＢＳ：吐温２１００．０ｍＬ用玻棒搅拌使其充分溶解，置于４℃储存，１周内使用。犃．６　蚀斑减数中和试验用试剂犃．６．１　犈犕犈犕培养基ＭＥＭｗｉｔｈＥａｒｌｅ’ｓ盐　　　９．６１ｇＥｄａｍｉｎｔｙｐｅＳ５．０ｇ（单独溶解于１００ｍＬ水中）丙酮酸钠１０．０ｍＬＬ谷氨酰胺１２．０ｍＬ碳酸氢钠１．５ｇ将ＥＭＥＭ、丙酮酸钠、Ｌ谷氨酰胺及碳酸氢钠混合后，加入溶解的ＥｄａｍｉｎｔｙｐｅＳ，加双蒸水至１Ｌ。用２ｍｏｌ／Ｌ盐酸调节ｐＨ至７．０～７．２，过滤除菌。临用前按要求加入胎牛血清。注：ＥＭＥＭ培养基市售可用。犃．６．２　０．１％中性红中性红（６５％ｄｙｅｉｎｐｏｗｄｅｒ）　　　０．１５１ｇ加双蒸水１Ｌ，１１５℃，１０ｍｉｎ，高压灭菌（或过滤除菌）。４℃避光保存。注：０．１％中性红市售可用犃．６．３　７．５％碳酸氢钠溶液准确称取７５ｇ碳酸氢钠，加入９２５ｍＬ双蒸水，定容至１Ｌ。２１犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售犃．６．４　铺板溶液配制表见表Ａ．１。表犃．１　铺板溶液配制表液体单位为毫升，固体单位为克终体积／含量／（ｍＬ／ｇ）１００１５０２００２５０３００４００５００６００７００８００１０００溶液 Ⅰ Ｅａｒｌｅ’ｓＢＢＳ缓冲液（１０×）ａ１０１５２０２５３０４０５０６０７０８０１００灭菌双蒸水３４５１６８８５１０２１３８１７０２０４２３８２７２３４０胎牛血清２３４５６８１０１２１４１６２０庆大霉素（５０ｍｇ／ｍＬ）０．１０．１５０．２０．２５０．３０．４０．５０．６０．７０．８１制霉菌素Ｂ（１ｍｇ／ｍＬ）０．０５０．０７０．１０．１２０．１５０．２０．２５０．３０．３５０．４０．５０．１％中性红（注意避光）１１．５２２．５３４５６７８１０碳酸氢钠（７．５％）（最后加）３４．５６７．５９１２１５１８２１２４３０制备方法配制完毕后，过滤除菌。溶液 Ⅱ 低熔点琼脂／ｇ１１．５２２．５３４５６７８１０灭菌双蒸水５０７５１００１２５１５０２００２５０３００３５０４００５００制备方法１２１℃，１０ｍｉｎ高压灭菌。　　ａ市售可用。３１犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有 · 禁止翻制、电子发售书书书１１０２— ３３８２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８３３—２０１１  中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本８８０×１２３０１／１６　印张１．２５　字数２７千字２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２２０１２　定价２１．００元版权所有 · 禁止翻制、电子发售

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