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60^Coγ射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株及培养基优化.pdf

60^Coγ射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株及培养基优化

sunfor2011
2012-01-12 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《60^Coγ射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株及培养基优化pdf》,可适用于高中教育领域

核农学报():~JournalofNuclearAgriculturalSciences文章编号:()Co射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株及培养基优化梁新乐陈敏张虹胡奇杰(.浙江工商大学浙江杭州.杭州凯胜生物技术有限公司浙江杭州)摘要:用Co射线对绿色产色链霉菌A.O菌株进行了诱变处理以正突变率为标准确定诱变的适宜剂量为Gv。诱变后得到株较高产突变菌株其中H.菌株经连续传代次遗传性状稳定阿维拉霉素发酵单位达到.mg/L。采用响应面分析法对菌株H.生产阿维拉霉素的发酵培养基碳氮源进行了优化设计。在所试验的碳氮源中可溶性淀粉、核糖分别作为唯一碳源时阿维拉霉素发酵单位较高分J,J达.和.mg/L乳糖、果糖、葡萄糖分别作为唯一碳源时菌株的效价较低%的豆粕粉和%的大豆蛋白胨作为氮源时阿维拉霉素发酵单位分别为.和.mg/L。采用双碳源双氮源更有利于菌株提高阿维拉霉素的发酵单位响应面分析结果表明可溶性淀粉、核糖和大豆蛋白胨对阿维拉霉素发酵单位影响较显著。优化后的碳氮源组成为:可溶性淀粉.g/LD.核糖.lg/L豆粕粉.g/L大豆蛋白胨.g/L。优化后的模型计算出阿维拉霉素发酵单位由原来的.mg/L提高到.mg/L。关键词:链霉菌Co诱变阿维拉霉素响应面分析法oCoY.IRRADIATIoNMUTATIoNINDUCTIoNFORSCREENINGoFAVILAMYCINSTRAINSWITHHIGHPRoDUCTIVITYANDITSCULTUREMEDIUMoP’IMlZATIoNLIANGXin.e’CHENMingZHANGHongHUQi.jie(DepartmentofBiochemcalEngineeringZhefiangGongShangUniversityHangzhouZhejiangHangzhouKaiShengBiotechnologyCoLtdHangzhouZ^莉昭)Abstract:Coirradiationwasusedformutationtreatmenttoscreenhighavilamycinproductionstrains.IrradiationatGygaveapositivemutationratioat.%.ThederivedmutantH一strainofStreptomycesviridoehrongenesshowedhighavilamycinproductivityat.mg/L.TheneffectsofdifferentcarbonandnitrogensourcesontheproducingstrainH一wereinvestigatedbyonefactortestandoptimizedwithResponseSurfaceMethodology.Theresultsindicatedthattheoptimumcarbonandnitrogensourceweresolublestarch.g/Lribose.g/Lsoypowder.g/Landsoypeptone.g/L.Underthoseconditionsthepredictedconsistentvalueofavilamycinsyieldwas.mg/Lwhichwasinconsistentwiththemeasuredvalue.Keywords:StreptomycesviridoehrongenesirradiationinductionavilamycinsResponseSurfaceMethodology阿维拉霉素(Avilamycin)又名卑霉素由绿色产色链霉菌(Streptomycesviridoehrongenes)合成属寡糖类抗生素⋯能抑制多种革兰氏阳性细菌的生长阿维拉霉素中以组分A的活性最高对链球菌、杆菌、梭菌、葡萄球菌作用显著其中包括对糖肽类抗生素具有抗性的肠球菌、青霉素抗性的链球菌以及甲氧苯青霉素抗收稿日期:..作者简介:梁新乐(一)男湖北江陵县人副教授研究方向为应用微生物学。Email:dbiotmail.zjgsu.edu.cn维普资讯http:wwwcqvipcom核农学报l卷性的葡萄球菌“可作为万古霉素或其他抗生素的替代品来治疗多种感染性疾病。阿维拉霉素分子结构独特安全性高不易被肠道吸收基本无残留毒性小不存在交叉耐药性易降解对环境污染小同时还具有良好的加工性能因此在主要的养殖业国家如欧盟、日本、巴西被广泛添加于鸡、猪饲料中以提高畜禽的生产绩效和抗病能力j。我国农业部于年批准进口使用进口兽药再注册目录()外兽药证字号。目前阿维拉霉素主要由美国礼来公司生产其商品名为效美素(Maxus)ET介绍其应用效果的文章较多但与其发酵生产相关的研究在国内外报道较少。朱传合等将微波诱变效应、N离子注入法运用于阿维拉霉素高产菌株的诱变育种上突变株阿维拉霉素效价分别达到.和.mg/L。Weitnauer等对绿色产色链霉菌株TU的合成基因簇进行了研究通过基因重组获得了阿维拉霉素的结构类似物。除此目前没有检索到其他关于阿维拉霉素生产效价的报道。绿色产色链霉菌株H.是经亚硝基胍(NTG)等诱变后筛选获得的株阿维拉霉素的突变株。响应面分析法(ResponseSurfaceAnaLysisRSA)⋯是综合试验分析和数学建模最经济合理的试验设计。它以回归法作为函数恒算工具通过多项式近似把因子与试验结果(响应值)的关系函数化以此对因子进行全面分析研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系。近年来该方法已成功地应用于发酵培养基的优化、酶解反应等。本文采用响应面分析法对H.发酵培养基中碳源和氮源的种类、浓度、配比进行了优化设计以期提高菌株的发酵单位。.材料与方法.菌种阿维拉霉素产生菌株StreptomycesvirichromodenesA.本实验室NTG诱变获得。藤黄微球菌(Microccusluteus)中国工业微生物菌种保藏中心。.培养基培养基包括以下种:)链霉菌活化培养基:KNOg/L可溶性淀粉.g/LKHPO,.g/LMgS·H.g/LVeSO,.g/LNaC.g/L琼脂.g/LpH.~.)发酵培养基:甘露醇.g/L豆粕粉.g/LL缬氨酸.g/LpH.~.)牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏.g/L蛋白胨.g/LNaC.g/LpH.~.)牛肉膏蛋白胨半固体培养基:牛肉膏.g/L蛋白胨.g/LNaC.g/L琼脂.g/LpH.~.)牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏.g/L蛋白胨.g/LNaC.g/L琼脂.g/LpH.~.。.方法..种子培养将原始菌种转接到活化培养基平板于℃恒温培养d将孢子转接到另一块平板℃恒温培养d后再转接至试管斜面(活化培养基)℃恒温培养d后即为种子。..种子扩培将lOml.%的生理盐水倒入产孢子的斜面中用接种铲刮下斜面表面的孢子用灭菌的移液管接入装有种子培养基的ml/ml三角瓶中每瓶ml(接种量%)于℃r/min摇培h左右。..发酵培养将培养好的种子培养基接入装有发酵培养基的ml/ml三角瓶中每瓶ml(接种量%)于℃r/min摇培h后停止发酵提取样品测定参数。..效价测定法采用二剂量法。取发酵液ml加入ml甲醇混匀置于℃培养箱中h。取出后以r/min离心min取上清液做效价测定。每个平板上都取一个牛津杯滴入同一浓度的标准液。求出标准液抑菌圈直径的平均值并与各平板的标准液相比得出一个校正数。用各个平板的校正数对发酵液的抑菌圈直径进行校正所得的校正值在标准曲线上查得对应标准品浓度即为所测定发酵液生物效价。..诱变选育方法活化后的菌体用无菌生理盐水(.%的NaCI溶液)稀释射线诱变前稀释成细胞密度为l个/ml的菌悬液。Co射线诱变在浙江大学原子核农业科学研究所进行剂量分别为、、、Gy。..数据分析采用国际上最常用的统计软件SAS.对试验数据进行回归分析。用P值检验测试回归系数的显著性。多项式模型方程拟合的性质由确定系数R表达其统计学上的显著性由F检验确定。用微分计算预测最佳点。结果与分析.射线诱变筛选高产菌株通过观察Co射线的诱变剂量与菌体致死率之间的关系(图)按照诱变剂量选择的一般原则选取菌体致死率大约在%~%之间的诱变剂量来观维普资讯http:wwwcqvipcom期Co射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株及培养基优化察其正突变率。单菌落经摇培发酵与出发菌株相比较产量提高的为正突变株最后统计各诱变剂量下的正突变率把正突变率最高的剂量作为最佳诱变剂量。从图可以看出。Coy射线照射剂量为Gy时正突变率最高(.%)。与原始菌株A阿维拉霉素发酵单位(.mg/L)相比突变菌株H一、H一、H一、H一、H.具有较大发酵单位(图)其中H一的发酵单位最大为.mg/l是原始菌株的.倍。为提高H一发酵单位本试验对其发酵培养基的碳源及氮源进行了进一步优化。£l兰j£{剂量dose(G’)图射线对菌株A一致死率及正突变率的影响Fig.Effectsof∞CoirradiationonthelethalrateandpositivemutantrateofA一strain{瞬三螓=突变株Noofmulantstrains图出发菌株A一经射线诱变突变株的筛选结果Fig.DiagramofavilamycinproductionbymutantsderivedfromthemutationwithCirradiationonA.strain.碳源对菌株H.阿维拉霉素发酵单位的影响由图可知以可溶性淀粉、核糖、甘露醇分别作为唯一碳源时菌株H一阿维拉霉素发酵单位较高以乳糖、果糖、葡萄糖作为碳源时菌株的效价较低。菌株H一以%可溶性淀粉作为碳源阿维拉霉素的发酵单位最大达到.mg/L。其次是%的核糖。文献报道。。的培养基一般以甘露醇作为碳源但甘露醇的原料价格较昂贵。可溶性淀粉廉价易得因此以可溶性淀粉作为主要碳源。考虑到菌体快速生长的需要除淀粉外还加入适量小分子糖以缩短停滞期促进菌丝体的生长。AtAABtBBCtCCDlDDEtEEFIFF碱泺种类及浓f耍typesofcarbonresourceanditsconcentration图绿色产色链霉菌H.菌株发酵不同碳源阿维拉霉素效价比较Fig.ComparisonofavilamycintiterwithdifferentcarbnsourcesutilizedbymutantH一A:可溶性淀粉B:乳糖C:果糖D:葡萄糖E:核糖F:甘露醇。字母脚注l、、分别表示%、%、%的浓度。下图同A:solublestarchB:lactoseC:fructoseD:glusoceE:riboseF:SOrbito.Footnotedenote%%and%concentration.respectively.ThesameasFig..氮源对菌株H.阿维拉霉素发酵单位的影响图表示了不同氮源对菌株H.阿维拉霉素发图绿色产色链霉菌H一菌株发酵不同氮源阿维拉霉素效价比较Fig.ComparisonofavilamycintiterwithdifferentnitrogensourcesutilizedbymutantH一A:豆粕粉B:大豆蛋白胨D:酵母膏E:牛肉膏F:硝酸钾A:soybeanpowderB:soybeanpeptoneD:yeastextractE:beefextract:F:potassiumnitrate∞∞∞∞∞加一一El一c一Ec一一>l}{蕞衬姑塞维普资讯http:wwwcqvipcom核农学报l卷酵单位的影响。豆粕粉、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸钾都可以作为阿维拉霉素发酵用氮源不同种类氮源对发酵单位影响较大。其中%的豆粕粉和%的大豆蛋白胨作为氮源时阿维拉霉素的发酵单位有较大值分别为.和.mg/L。酵母膏、牛肉膏、硝酸钾等氮源经常用于放线菌的菌种活化与种子培养中但这些较易利用的氮源不利于促进次级代谢产物的生成阿维拉霉素发酵单位较小不适合于发酵培养基。.响应面法(SAS法)确定最佳碳氮源组合本试验采用双碳源双氮源做响应面来确定碳氮源的最佳比例。以可溶性淀粉、豆粕粉、核糖和大豆蛋白胨为个试验因子分别表示为。、、、。采用二次回归方程常用的中心组合设计原理来设计试验方案。根据单因素试验结果以及经验设计因素的水平值其因素和水平见表l每个试验重复次取其平均值用SAS软件进行分析。表试验变量的实际浓度及其对应的编码值TablelLevelsofthevariablestestedinCCD(g/L)编码值codedlevelsXx'X】(注:xI:可溶性淀粉x:豆粕粉x:核糖)【:大显蚩自胨Note:XI:solublestarchX:soybeanpowder:ribose】(:soybeanpeptone以发酵单位为响应值Y可溶性淀粉、豆粕粉、核糖以及大豆蛋白胨为个自变量用SAS软件对试验数据做响应面分析。由表可知拟合的二次回归方程式为:Y:..l.l.xOOll.x.xll一.xl.xl一.x.xl.x.x整个回归模型的为.F值为.回归标准差.说明回归方程的拟合程度较好。表发酵单位为响应值的回归分析结果TableAnalysisofvarianceforthefittedquadraticpolynomialmodel图所示为SAS软件对试验数据的回归从图中可以看出试验响应因子间的作用对于应变量发酵单位的影响都存在一个明显的顶点即有一个极大值。根据程序分析计算得。为.(.g/L):为.(.g/L)为.(.lg/L)为.(.g/L)时发酵单位有最大产量模型预测值为.mg/L。a:y=f(xlX)b:y:咀Ix)c:y(x)图(abc)响应面的立体图Fig.Theresponsesurfaceplots(abC)ofthemodelequationfittedtothedataofthecentralcompositedesign。:可溶性淀粉:豆粕粉扎:大豆蛋白胨XI:solublestarch:soybeanpowderX:soybeanpeptone维普资讯http:wwwcqvipcomJournalofNuclearAgriculturalSciences():~.培养基优化配方验证通过上面的培养基优化确定最优发酵培养基配方中碳源与氮源分别为可溶性淀粉O.g/LD一核糖为.g/L豆粕粉为.g/L大豆蛋白胨为.OL。通过摇培发酵验证阿维拉霉素发酵单位为.±.mg/L试验结果和预测值很接近说明整个方程的预测较为成功。结论本试验以链霉菌AO为出发菌株经过∞co射线诱变获得了较佳的诱变剂量并筛选获得高产突变株H.。采用响应面法对其发酵培养基配方中的碳源、氮源的种类、浓度与组合进行了优化设计。试验结果表明优化后的培养基配方与原始培养基相比组份虽然增多了但产物阿维拉霉素的合成获得了较大的提高。文献报道的培养基以甘露醇作为碳源以豆粕粉、缬氨酸作为氮源成本较高经优化后以可溶性淀粉、核糖作为碳源适量增加大豆蛋白胨取消缬氨酸原料成本下降的同时发酵单位也提高了。参考文献:OWrightDE.Theorthosomycinsanewfamilyofantibiotics.elrahedmn:ChampneyWSToborCL.E(SCH)inhibitsbothtranslationandSribosomalsubunitformationinStaphylococcusaureusceilsAntimicrob.AgentsChemother:~FosterDRRybakMJ.PharmacologicandbacteriologicpropertiesofSCH(Ziraein)aninvestigationalantibioticfromtheeverninomicinfamily.Pharnmeotherapy:~FuchsPCBarryALeta.InvitroactivitiesofSCHaloneandincombinationwithotherantimlembialagents.Antimierob.AgentsChemother:~欧盟决定延长阿维拉霉素的使用.中国动物保健:ChauvinCGicquelBruneauMeta.UseofavilamycinforgrowthpromotionandavilamyeinresistanceamongEnterococeusfaeeiumfrombroilersinamatchedeasecontrolstudyinFrance.PreventiveVeterinaryMedicine:~http:www.ivde.gov.en:wasOIsearchehannelid:朱传合贺亚男等.微波对阿维拉霉素产生菌诱变效应的研究.现代生物医学进展.:~朱传合贺亚男等.N离子注人阿维拉霉素产生菌诱变效应的研究.核技术:~WeitnauerGMuhlenwegAeta.BiosynthesisoftheorthosomyeinantibioticavilamyeinA:deductionsfromthemolecularanalysisoftheavibiosyntheticgeneclusterofStreptomycesviridochmmogenesTuandproductionofnewantibiotics.Chemistry&Biology。:~MillerASitterRR.UsingthefoldedoverrunPlackettBarmandesigntoconsiderinteractions.Technometrics:~RatnamBVVNarasimhaRaoMeta.Optimizationoffermentationconditionsfortheproductionofethanolfromsagostarchusingrepnsesurfacemethodology.WorldJournalofMicrobiologyandBioteehnology:~IsmallAUnderMeta.OptimizationofbutylgalactosidesynthesisbyBgalaetosidasefromAspergillusory~eneworientations.EnzymeandMicrobialTechnology:~(上接第页)陈存及梁一池等.毛竹种源多性状综合选择的研究林业科学():陈光才马乃训.竹子遗传育种研究进展.林业科学研究():~宁材强戴启惠.撑篙竹×大绿竹杂交选育的研究.广西林业科学():~O邢新婷.麻竹不同地理群体遗传变异分析及良种选育研究.中国林业科学研究院袁金玲傅懋毅等.几个丛生竹种杂交育种的研究.中国林学会竹子分会编.中国林学会首届竹业学术大会论文集卓仁英.竹子生物技术育种研究进展.浙江林学院学报():江泽慧主编.世界竹藤.辽宁科学技术出版社O郑光华.种子生理研究.北京:科学出版社宋松泉程红焱等.种子生物学研究指南.北京:科学出版社郝建平郭美丽宋莲芬.拟南芥抗盐单基因突变体的诱导与筛选.山西大学学报():~王长泉宋恒.杜鹃抗盐突变体的筛选.核农学报():~l周小梅赵运林等.几种冷季型草坪草辐射敏感性及其辐射育种半致死剂量的确定.湘潭师范学院学报(自然科学版)():~马建中鱼红斌伊虎英.中国北方主要牧草品种的辐射敏感性与辐射育种适宜剂量的探讨.核农学通报():~冯志杰.高等植物的辐射敏感性.北京:原子能出版社~维普资讯http:wwwcqvipcom

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