SNT 1999-2007 牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 犛犖／犜１９９９—２００７ 牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫 吸附试验操作规程 犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犪狀狋犻犵犲狀犮犪狆狋狌狉犲犱犲狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔 犳狅狉犫狅狏犻狀犲狏犻狉犪犾犱犻犪狉狉犺狅犲犪犿狌狊犮狅狊犪犾犱犻狊犲犪狊犲 ２００７１２２４发布 ２００８０７０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网(www.freebz.net) 免费标准网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 书书书 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫 吸附试验操作规程 ＳＮ／Ｔ１９９９—２００７  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．５　字数 ８ 千字 ２００８年２月第一版　２００８年２月第一次印刷 印数１—２０００  书号：１５５０６６·２１８４５９　定价 ６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子传阅、发售 ????? www.bzfxw.com ???? 免费标准网(www.freebz.net) 免费标准网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 书书书 前　　言 　　本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：董志珍、侯艳梅、赵祥平、肖妍、霍蕾。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 Ⅰ 犛犖／犜１９９９—２００７ 版权所有 · 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网(www.freebz.net) 免费标准网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫 吸附试验操作规程 １　范围 本标准规定了牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）操作方法。 本标准适用于牛病毒性腹泻粘膜病抗原的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 。 ２　 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成 协议 离婚协议模板下载合伙人协议 下载渠道分销协议免费下载敬业协议下载授课协议下载 的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法（ｎｅｑＩＳＯ３６９６） ３　原理 以边界病病毒特异性抗体包被酶标板，同时加入ＢＶＤＶ检测单克隆抗体及样品，样品即与两种抗 体结合，形成抗原抗体结合物，洗板后再加入二抗（与抗原抗体复合物结合）及底物，通过测量光密度值 而确定样品的结果。 ４　试验材料 ４．１　牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获犈犔犐犛犃诊断试剂盒 ２℃～８℃保存。试剂盒内应包括的物品如下： ａ）　牛病毒性腹泻粘膜病病毒多克隆抗体包被板； ｂ）　抗ＢＶＤＶ单克隆检测抗体； ｃ）　ＢＶＤＶ阳性对照； ｄ）　ＢＶＤＶ阴性对照； ｅ）　辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的牛抗鼠抗体； ｆ）　１０×样品稀释液； ｇ）　１０×浓缩洗液； ｈ）　ＴＭＢ底物溶液； ｉ）　终止液。 ４．２　样品的处理 ４．２．１　组织 ４．２．１．１　使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在２℃～８℃保存１个月或长期冷冻保存。组织样品最 好为扁桃体、脾脏、小肠及肺脏。 ４．２．１．２　用剪子将１ｇ～２ｇ的样品剪碎（２ｍｍ～５ｍｍ）。 ４．２．１．３　将剪碎的样品置于１０ｍＬ的离心管中，加入５ｍＬ样品稀释液（１×），混匀，室温感作１ｈ～２ｈ。 ４．２．１．４　１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取５０μＬ上清液作为检测用样品。按第７章进行试验。 ４．２．２　外周血液白细胞 ４．２．２．１　将肝素或ＥＤＴＡ抗凝的血样１０ｍＬ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。 １ 犛犖／犜１９９９—２００７ 版权所有 · 禁止翻制、电子传阅、发售 ????? www.bzfxw.com ???? 免费标准网(www.freebz.net) 免费标准网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 ４．２．２．２　用１０００μＬ移液器小心吸取血沉表层的淡黄色薄膜，重悬于５００μＬ的样品稀释液中，每一 个样品换一个吸头。室温放置１ｈ，在此期间偶尔漩涡振荡一次，下面继续４．２．２．６的操作。 ４．２．２．３　如果样品的压缩细胞体积非常小，那么用所有的血细胞来操作（包括红细胞），将细胞转移到 １０ｍＬ离心管中，并加入等体积的２℃～８℃预冷的０．１７ｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ４Ｃｌ溶液，放入离心管中，室温放 置１０ｍｉｎ。 ４．２．２．４　将离心管用２℃～８℃预冷的超纯水（或双蒸水）加满，轻轻地翻转摇匀，２５００ｒ／ｍｉｎ离心 ５ｍｉｎ。 ４．２．２．５　弃去上清液，加入５００μＬ样品稀释液（１×）到血细胞中，每个样品使用新的枪头涡动混匀，室 温中放置１ｈ，在此期间偶尔漩涡振荡一次。 ４．２．２．６　２５００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，用上清液作为检测样品，按第７章进行试验。 ４．２．３　鼻拭子 ４．２．３．１　取下拭子头，放入底部有小孔的微型离心管中（可用热针头打空）。将微型离心管放入另一个 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。 ４．２．３．２　弃去底部有小孔的微型管，并在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中加入与获得的粘液等体积的样品稀释液 （１×），混匀，室温下放置１ｈ～２ｈ。此期间偶尔摇晃一下。然后可按第７章操作程序进行试验。 ４．２．４　细胞培养物 ４．２．４．１　弃去细胞培养液，反复三次冻融后，收集细胞培养液到离心管中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃 去上清液。 ４．２．４．２　加入５００μＬ样品稀释液，振荡器上轻轻混匀，置于室温１ｈ，吸取５０μＬ作为检测用样，按 第７章操作程序进行试验。 ５　仪器与设备 ５．１　酶标仪（波长４５０ｎｍ或双波长４５０ｎｍ／６２０ｎｍ）。 ５．２　振荡器。 ５．３　高速台式离心机。 ５．４　冰箱。 ５．５　温箱。 ５．６　８道或１２道洗头洗板机。 ５．７　８道或１２道移液器（５０μＬ，３００μＬ）。 ５．８　单道移液器（０．５μＬ～１０μＬ；４０μＬ～２００μＬ；２００μＬ～１０００μＬ和２ｍＬ～１０ｍＬ）。 ５．９　吸头（１０μＬ，２００μＬ，１０００μＬ）。 ５．１０　剪刀和镊子（处理组织样品）。 ５．１１　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管。 ６　试剂准备 ６．１　试剂盒各组分在使用前恢复至室温（２０℃～２５℃）。 ６．２　水：ＧＢ／Ｔ６６８２所规定的一级水。 ６．３　０．１７ｍｏｌ／ＬＮＨ４Ｃｌ溶液（提取白细胞用）。 ６．４　洗涤液：用蒸馏水将浓缩洗液稀释１０倍（１∶１０），如３０ｍＬ浓缩液加入２７０ｍＬ蒸馏水，混匀备 用。稀释用蒸馏水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２的要求。 ２ 犛犖／犜１９９９—２００７ 版权所有 · 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网(www.freebz.net) 免费标准网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 ７　操作程序 ７．１　加抗犅犞犇犞单克隆检测抗体 用８道或者１２道移液器在每孔中加入５０μＬ抗ＢＶＤＶ单克隆检测抗体（试剂盒提供）。 ７．２　对照 加５０μＬ阴性对照血清至酶标板的Ａ１、Ｂ１孔。 加５０μＬ阳性对照血清至酶标板的Ａ２、Ｂ２孔。 ７．３　加样 在酶标板的其他相应孔中各加入５０μＬ已稀释好的被检样品。 ７．４　感作 将酶标板封膜后，在振荡器上混合１ｍｉｎ后，置２℃～８℃下过夜感作（１４ｈ～１８ｈ）或３７℃下感作 ３ｈ。 ７．５　洗涤 弃掉各孔的液体，每孔加入２５０μＬ～３００μＬ已稀释好的洗涤液，轻轻振动后甩掉，连续洗涤５次。 最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻拍，以去除孔内剩余的液体。 ７．６　加酶标结合物 每孔加入１００μＬ辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的牛抗鼠抗体。 ７．７　感作和洗涤 将酶标板封膜后，置室温下，感作３０ｍｉｎ。重复７．５洗涤。 ７．８　加底物 每孔加入１００μＬＴＭＢ底物溶液。 ７．９　感作 将酶标板置２０℃～２５℃下黑暗处感作１０ｍｉｎ，从加完第一孔开始计时。 ７．１０　加终止液 每孔加１００μＬ终止液，终止颜色反应。 ７．１１　测定吸光值（犗犇） 酶标仪以空气作为空白对照，于１５ｍｉｎ内，在４５０ｎｍ波长下测量和 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 样品和对照的犗犇值。 ８　试验有效性原则 只有在阳性对照孔所得的平均值（犘犆犡）减去阴性对照孔所得的平均值（犖犆犡）大于０．１５，且阴性 对照孔所得的平均值应小于０．２时，测定结果才有效。 ９　结果计算和判定 ９．１　结果计算 按式（１）、式（２）、式（３）计算结果。 犖犆犡 ＝犗犇Ａ１＋犗犇Ｂ１２ ………………………………（１） 　　式中： 犖犆犡———阴性对照血清孔犗犇值的平均值； 犗犇Ａ１———Ａ１孔阴性对照血清的犗犇值； 犗犇Ｂ１———Ｂ１孔阴性对照血清的犗犇值。 犛犖／犜１９９９—２００７ 版权所有 · 禁止翻制、电子传阅、发售 ????? www.bzfxw.com ???? 免费标准网(www.freebz.net) 免费标准网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 书书书 犛犖／犜１９９９—２００７ 犘犆犡 ＝犗犇Ａ２＋犗犇Ｂ２２ ………………………………（２） 　　式中： 犘犆犡———阳性对照血清孔犗犇值的平均值； 犗犇Ａ２———Ａ２孔阳性对照血清的犗犇值； 犗犇Ｂ２———Ｂ２孔阳性对照血清的犗犇值。 犛／犘＝ 犗犇Ｓ－犖犆犡犘犆犡－犖犆犡 ………………………………（３） 　　式中： 犗犇Ｓ———样品孔的犗犇值。 ９．２　结果判定 如果犛／犘值小于０．２０，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病阴性。 如果犛／犘值介于０．２０和０．３０之间，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病可疑，应重新检测；重新检测仍 为可疑则判为阳性。 如果犛／犘值大于等于０．３０，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病阳性。 ７００２— ９９９１ 犜／ 犖犛 书号：１５５０６６·２１８４５９ 定价： 　　６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网(www.freebz.net) 免费标准网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载