从脑细胞悬液到干细胞研究的20年历程_上_

第 28 卷 第 2 期 河南大学学报(医学版) Vol. 28� No. 2 2009 年 5 月 Journal o f Henan U niversit y ( M edical Science) May . 2009 专 家 简 介 � � 杨波, 男, 1963年出生。郑州大学一附院神经外科教授, 主任医师,博士研究生导 师。1985年毕业从事神经外科以来, 长期致力于急性重型脑、脊髓损伤、脑血管病、颅内 肿瘤和神经干细胞、间质干细胞等课题研究。主持或主要参与河南省医学科技创新人 才工程项目�神经干细胞培养和移植的基础及临床研究 、�间质干细胞诱导移植治疗 神经系统病变的基础和临床研究 和�高内涵药物筛选对水通道蛋白 AQP4抑制剂和脑 水肿的研究 ;河南省科技厅攻关项目�脑血管病恢复期胚胎神经干细胞移植的基础和应用研究 和�神经干 细胞移植治疗视神经损伤的基础及临床研究 ;河南省高校杰出科研人才创新工程项目�骨髓间充质干细胞 向神经细胞定向分化的关键调控基因和诱导因子的定位与功能研究 ; 国家自然科学基金�逆转录病毒中介 SiRNA特异失活眼内通道 AQP4的基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达对实验性青光眼大鼠眼压的影响 ;教育部新世纪优秀人才支 持计划�高效特异的 AT M 基因 SiRNA系统对脑胶质瘤的治疗作用 ; 河南省医学科技攻关计划项目(重点 项目)�脑胶质瘤术后肿瘤干细胞培养和个体化特异性放疗及化疗研究 。并于专业核心杂志上发表研究论 文 30余篇。获国家及省部级成果奖 6项。 编者按: � 神经系统存在着多种难治甚至不治之症,例如:瘫痪、昏迷、植物生存、脊髓截瘫、小儿脑瘫、老年性 痴呆,脑胶质瘤,肌萎缩侧索硬化等。长期以来,学者束手无策, 患者痛苦无奈, 是世界性难题,且已患病和新 增病例数量极为庞大,对国家、社会、家庭、个人带来的直接经济损失和精神痛苦无以计数。神经干细胞、间 质干细胞和脑胶质瘤肿瘤干细胞的研究和应用,为提高上述患者生活质量,发挥了初步作用。杨波教授在该 领域的长期、系统研究经历,也许能够为该领域的其他学者的研究起到抛砖引玉的作用, 同时也提供一些多 方面交流和探讨的话题。本刊将分三次报道杨波教授在该领域的研究, 敬请致力于与此有关的科研工作者 给予关注。 从脑细胞悬液到干细胞研究的 20年历程(上) 杨 � 波,杜 � 英,关方霞,宋来君,张清勇,张志强,冯祖荫 (郑州大学一附院神经外科, 河南 郑州 450052) 摘 � 要: 从脑细胞悬液到干细胞研究, 至少历经 20余年。按照时间顺序, 回顾了从上世纪 80年代到现在的干细胞 研究历程。初期,应用脑细胞悬液或脑组织块直接脑内移植治疗几种难治性疾病。上世纪末,神经组织干细胞研 究启动并逐渐深入和广泛。本世纪初至今,相继开展了自体骨髓间质干细胞、外周血干细胞、脐血间质干细胞、羊 膜间质干细胞、肿瘤干细胞等体内和体外研究。近几年, 在大量的基础与动物实验基础上, 逐渐开展了上述几种干 细胞的临床应用初步研究,以及脑胶质瘤干细胞个体化特异性的放疗和化疗 ,对若干神经系统难治性疾病的治疗 取得了一些独特的效果,提高了患者的生活质量。 关键词: 脑细胞; 神经干细胞;间质干细胞; 肿瘤干细胞;移植 中图分类号: Q813. 1� � � 文献标识码: A 文章编号: 1672- 7606( 2009) 02- 0077- 04 � 收稿日期: 2009- 02- 12 � � 近几年,神经干细胞,间质干细胞等研究和应用 在世界范围内, 越来越深入和广泛。随着美国全面开 放干细胞的研究和临床应用,必将带动新一轮的干细 胞研究热潮。回顾历史, 纵观现状, 有助于与国际研 78��� 河南大学学报(医学版) , 2009 年, 第 28 卷第 2 期 究进展相同步。 1 � 脑组织细胞悬液移植治疗脑脊髓损 伤的动物试验和临床研究 � � 1988年前后,国内外掀起脑细胞悬液移植热潮, 当时的文献报道对帕金森病有一定效果。我们针对 脑外伤、脊髓损伤进行了胚胎脑组织移植治疗脑脊髓 损伤的动物试验,结果发现: 移植组较对照组从病理 和行为学指标观察, 均有明显好转( P< 0. 005)。在 此基础上,进行了胚胎脑组织细胞悬液脑损伤灶多点 注射治疗脑外伤患者 1 例, 瘫痪的肢体肌张力降低, 活动灵活度提高;如果现在回顾性再次检测当年全国 范围内多中心接受过此类移植治疗的患者,对脑移植 安全性的 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 将是非常珍贵的资料。另外 1例,顽固 性癫痫患者,经过移植治疗后, 癫痫发作次数明显减 少,后维持多年。同期,又进行了胚胎大白兔脑垂体 移植的动物试验,移植后不同时间段, 用放射免疫法 检测动物血清中垂体激素含量变化,其升高有显著性 意义( P< 0. 005)。但是,在这一历史阶段, 国内外大 范围进行的这种胚胎脑组织细胞悬液移植方法的缺 点在于: ! 取材时间不确定,相关人员提前等待,耗时 耗神,效率低下。∀ 手术提前开颅,但是,若胚胎标本 质量、活性低下,则移植效果无保障。# 污染性检测 很难进行。∃细胞悬液成份复杂, 作用机理不明。 % 伦理学问题困扰。为了克服上述诸多缺点,我们设计 进行下一阶段的研究:神经元细胞,神经胶质细胞,神 经干细胞样细胞培养、动物移植试验。 2 � 神经元细胞, 神经胶质细胞,神经干 细胞样细胞培养、移植动物试验 � � 1995年后, 先后进行了胚胎组织来源和手术中 废弃脑组织来源的神经元和神经胶质细胞培养,结果 发现:无论胚胎组织或者成年脑组织来源的神经元培 养非常困难,成活率低,实用性不强;但神经胶质细胞 成活率比较高。动物试验结果基本上与脑组织细胞 悬液移植治疗脑脊髓损伤的动物试验结果类似,没有 明显提高。之后,参考国外文献的分离、培养方法,进 行胚胎组织神经干细胞培养, 得到类似神经干细胞样 的可传代、扩增细胞。同期, 进行了手术中废弃脑组 织中成体干细胞分离和培养, 结果发现,传代和细胞 扩增数量有限。所以,主要进行胚胎脑组织来源的神 经干细胞分离和培养研究。2000年, 我们完成神经 干细胞分离、培养和鉴定[ 1] 。之后,进行了系统科研 设计,以初期与临床应用密切相关的研究方向为主, 主要进行实用性为主的背景研究。动物试验为脑外 伤和脊髓损伤动物模型,研究方向为神经干细胞移植 治疗脑和脊髓损伤动物模型。 3 � 神经干细胞移植过程中必须研究的 密切课题 � � 神经干细胞研究的重要目标之一是通过移植治 疗现有的一些神经系统难治性疾病,提高其生活质量 尤为迫切。所以,基于动物试验资料和当时国内外临 床初步应用结果, 我们进行了如下的系列课题设 计[ 2- 11] : 3. 1 � 神经干细胞纯化 神经干细胞纯化,旨在探讨神经干细胞移植后修 复病变的机理及其量效关系。具体方法:取特定部位 胚胎脑组织, 制备细胞悬液, 用磁性微珠标记的 CD133单克隆抗体与细胞孵育, 通过磁分选器分离 出 CD133( + )和 CD133( - )细胞, 通过体外培养并 诱导分化,观察 CD133 阳性细胞和阴性细胞的增殖 情况及分化能力。结果显示:经免疫磁珠分选的细胞 悬液中, CD133 ( + )细胞量占 2%左右,该细胞体外 扩增能力强, 细胞呈球形生长, 并易聚集成团, 培养 5 d, 10 d, 15 d, 20 d进行活细胞计数,细胞增长率分 别为 1. 79% , 4. 82% , 7. 21% , 14. 66%。可见: 免 疫磁珠法简便、有效, 经免疫磁珠分离的神经干细胞 在体外能进一步培养扩增并分化。 3. 2 � 增殖与分化 神经干细胞在实验室中增殖数量与其以后的移 植效果密切相关, 干细胞的提前分化, 必将减少可用 性干细胞的数量,并且可能对正在增殖中的干细胞造 成影响, 因此,我们选择临床上常用的细胞因子 LIF 和神经节苷脂( GM- 1)进行研究, 结果发现: L IF 在 体外,能够促进神经干细胞的增殖并抑制其分化。 GM- 1能够维持神经干细胞的原始状态,促进干细 胞增殖, 而无诱导其分化作用。 3. 3 � 神经生长因子( NFG) NFG 在神经系统有着非常重要的作用,并且,目 前已经有多个商品化的产品在临床常规使用。所以, 深入研究神经生长因子对神经干细胞的作用,具有重 要的实用价值[ 12]。我们设计观察不同浓度 NGF 对 神经干细胞的作用, NGF 浓度范围: 2 �g/ L N GF, 5 �g/ L NGF, 10 �g/ L NGF, 20 �g/ L NGF, 50 �g / L NGF。结果发现: 10 d各组细胞在同一放大倍数下, 细胞球数不同, 统计分析: 10�g / L NGF 组与阳性对 照组比差异无显著性( P> 0. 05) , 与阴性对照组比差 异有显著性( P< 0. 05) , 2 �g/ L、5 �g/ L、20 �g / L、50 �g/ L NGF 组则相反, 与阳性对照组比较有显著性差 杨 波, 等:从脑细胞悬液到干细胞研究的 20 年历程 79��� 异,其中 2 �g / L、20 �g / L、50 �g/ L NGF 组与阴性对 照组比较差异无显著性, 见表 1。 细胞 MTT 测定统计分析: 培养 3 d 时 50 �g / L NGF 组增殖程度较其他各组低, P< 0. 01差异有显 著性;其余各组间增殖程度比较, P> 0. 05差异无显 著性。培养 10 d时细胞活力测定表明各组细胞均有 一定程度的增殖, 5 �g / L、10 �g / L NGF 组与阳性对 照组比较差异无显著性,与阴性对照组比较差异有显 著性; 2 �g/ L、20 �g/ L、50 �g/ L NGF 组及 NGF+ bFGF 组则相反, 与阳性对照组比较有显著性差异, 而与阴性对照组比较差异无显著性。见表 2 和图 1 ~ 4。 � � 表 1� 神经干细胞培养 10 d 各组细胞球数测定 组别 n 10 d 细胞球数 A 10 53. 60 & 2. 27 ∋ B 10 53. 40 & 5. 02 ∋ C 10 57. 60 & 4. 50 ( D 10 62. 40 & 2. 32 ) E 10 54. 10 & 2. 51 ∋ F 10 54. 20 & 4. 32 ∋ � � � F= 12. 97, P< 0. 05 ∋组和) 组之间比较有显著性差异, P < 0. 05; 而 2 组内比较 均无显著性差异, P > 0. 05 � � 表 2 � NGF 作用下细胞活力测定结果 组别 3 d MT T 值 10 d MTT 值 A 0. 098 & 0. 025∋ 0. 128& 0. 015∋ B 0. 102 & 0. 032∋ 0. 130& 0. 022∋ C 0. 105 & 0. 026∋ 0. 146& 0. 023( D 0. 088 & 0. 021∋ 0. 150& 0. 025) E 0. 086 & 0. 017∋ 0. 133& 0. 011∋ F 0. 067 & 0. 019) 0. 131& 0. 019∋ � � � F3 d= 3. 47, P 3 d< 0. 05, F10 d= 3. 47, P10 d< 0. 05 ∋组和) 组之间比较有显著性差异, P< 0. 05; 而 2 组内比较 均无显著性差异, P> 0. 05 图 1� 培养 3d 时数个细胞组成的团块 图 2 � 培养 7d 时见到的悬浮细胞球形克隆∗ 400 (细胞分裂相, ∗ 400) 图 3 � MT T 染色图片∗ 400 图 4 � 神经球细胞 Nestin 单抗免疫化学染色( + ) ∗ 400 � � 上述资料分析显示: 神经干细胞增殖的程度和 NGF 的浓度一定的量效关系。10 d各试验组间比较 显示:浓度 10�g / L NGF 促神经干细胞的增殖作用, 较其他实验组促神经干细胞增殖作用强。高浓度的 NGF 作用的细胞 MTT 活力测定较低, 间接说明神 经生长因子在促进细胞增殖的同时也可能对细胞有 分化作用,且随 NGF 浓度的增加而增强。 在原代细胞培养的最初, 由于生长环境的改变, 80��� 河南大学学报(医学版) , 2009 年, 第 28 卷第 2 期 细胞停止增值处于潜伏期,此时加入神经生长因子更 多的表现出促进神经干细胞分化的作用。所以加入 神经生长因子组 3 d MTT 检测值较低,特别是高浓 度神经生长因子组。经过一段时间培养后,细胞进入 增殖周期,故10 d细胞活力较3 d有明显提高。而低 神经生长因子组更多的表现为促细胞增殖作用。其 机制可能是 NGF 作用与细胞膜 NGF 受体, 通过多 种信号转导机制作用于核内调节神经干细胞基因的 表达,防止细胞程序性死亡, 并为细胞提供适合生长 的微环境,从而促进神经干细胞的存活。在神经干细 胞培养中,一部分细胞贴壁分化, 在传代过程中被去 除,或在神经干细胞培养环境中死亡,在神经系统中, 细胞分化意味着增殖的停止。故细胞分化比率大的 实验组( 20 �g / L、50 �g / L NGF 组)其 MTT 值相对 较低。2、5�g / L NGF 组因 NGF 浓度较低, 其增殖 作用较 10�g / L NGF 组低, 其 MTT 值相应的也较 10�g / L 组低。故对于体外培养的神经干细胞, 以 10�g / L N GF 为促细胞增殖的最佳浓度。 3. 4 � 免疫问题 如同器官抑制, 神经干细胞抑制后的免疫问题必 须面对。研究发现: 新分离和传代的神经干细胞均发 生 MHC- +, MHC- ,类分子 mRNA 转录, MHC - +类分子在神经干细胞表面表达百分率为( 5. 66 & 0. 37) %, 神经干细胞在体外能诱发淋巴细胞增殖反 应,但脑内移植后, 局部无淋巴细胞浸润和炎症。提 示:人胚胎组织源性神经干细胞具有免疫原性, 但直 接脑内接种未发现引起明显的移植排斥反应。 3. 5 � 冻存与复苏 对于临床择期进行的神经干细胞移植手术、特定 时间要求的移植手术和建立−神经干细胞库.具有重 要的意义。方法: 以冻存液 ( 体积分数为 70% DMEM / F12,体积分数为 20%胎牛血清,体积分数为 10% DMSO)将备用的神经干细胞进行冻存, 于 1 周、4周、8周、12 周、16周、20周, 24周分别复苏, 计 数活细胞比例并进行再培养。结果发现:复苏后神经 干细胞的成活比例分别为 68% , 65% , 65% , 62% , 61 % , 60% , 60%, 再培养条件下生长良好。 3. 6 � 进一步完善神经干细胞移植治疗脑外伤、脊髓 损伤动物试验 2003年~ 2004年间, 系列 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 发表[ 2- 12]。通过 上述研究,我们体会到神经干细胞移植治疗脑外伤和 脊髓损伤具有独特优势, 但是,取材困难, 来源有限, 面对庞大数量的患者, 其临床应用的− 瓶颈.显而易 见。为了突破这一瓶颈, 我们曾进行了自体骨髓间质 干细胞和骨髓动员外周血干细胞采集等方法,试图通 过增加干细胞来源途径而解决干细胞需用量大的问 题, 但是,自体骨髓干细胞或者骨髓动员后的外周干 细胞受最大影响的是患者本人自体骨髓生理或病理 状态,直接影响自体干细胞的数量和生物学活性(特 性)。笔者于 2004年访问了美国南佛州大学干细胞 中心。之后, 开始了脐带血间充质干细胞的研究。 2003年,国际上开始对脑胶质瘤肿瘤干细胞研究,我 们敏锐地意识到, 颅内肿瘤中最难治的胶质瘤,有望 进行治疗模式的全新变革,以脑肿瘤干细胞研究与应 用为切入点,有望提高患者的生活质量和延长生存 期。 (本刊第 3期将连载杨波教授在−脐血间质干细 胞; 羊膜间质干细胞与羊膜支架; 肿瘤干细胞.方面的 研究成果,敬请关注) 参考文献: [ 1] 杨波, 杜英, 张清勇, 等. 人胚神经干细胞的分离与培养 [ J] .河南医科大学学报, 2000, 35( 6) : 504- 505. 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