补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注模型神经细胞凋亡的影响

第 27卷 � 第 8期 2 0 0 9年 8月 中 � 华 � 中 � 医 � 药 � 学 � 刊 CH INESE� ARCH IVES� OF� TRAD IT IONAL� CH INESE� MED IC INE Vo.l 27 No. 8 Aug. 2 0 0 9 中华中医药 1660� 学刊 [ 6 ] � Tareq Ibrah im, M D, S tephan G. N ekolla, et a.l Quan titative m easurement of in farct size by con trast- enhancedmagnetic res� onance im aging early after acu tem yocard ial in farct ion [ J] . JAm Co llC ardio,l 2005, 45: 544- 552. [ 7] � Steven E, Anderson, DawnM, et a.l Acu te effects of 17�- estra� diol on m yocard ial pH, Na+ , and Ca2+ and ischem ia�rep erfu� sion in jury[ J] . Am J Physiol C ellPhysio,l 2005, 288: 57- 64. [ 8 ] � H assanM A, T alukder, Anuradh aK alyanasundaram, Xue Zhao, et 收稿日期: 2009- 03- 11 基金项目:河南省自然基金资助项目 ( 0611040400) ;河南省高校杰 出科研人才创新工程项目 ( 2007KYCX007 ) ;河南省杰出 青年 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助项目 ( 08100510015) 作者简介:张运克 ( 1966- ),男,河南平顶山人, 教授、主任医师, 博 士,主要从事中医药防治脑血管疾病的临床与实验研 究。 a.l E xpress ion of SERCA isoform w ith faster C a2+ transport p rop� erties im proves post ischem ic card iac function and Ca2+ hand ling and decreasesm yocard ial in farct ion [ J] . Am J Physio lH eart C irc Phys io,l 2007, 293: 2418- 242. [ 9] � Su fenW ang, Jeejab aiRadhak rishnan, IyadM. Ayoub, et a.l L im� iting sarcolemm alN a+ entry du ring resuscitat ion from ventricular fib rillat ion preven ts excess m itochondrial Ca2+ accumu lat ion and attenuatesm yocard ia l in jury[ J] . JApp l Physio,l 2007, 103: 55- 65. [ 10] � Fab rice Prun ierMD PhD, Yosh iak iKaw ase M D, Davide G iann i B S. 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106 /mL的密度接种于含 10%胎牛血清的 DMEM培养液中 ( T - 75培养瓶 ), 置于 37∀ 、体积分数为 5% CO2、饱和湿度的 CO 2孵箱培养。 5天后更换培养液,弃 去未贴壁细胞,以后每 3天全量换液, 同时观察记录倒置显 微镜下细胞的形态变化。待贴壁细胞完全融合后, 0�25% (质量体积比 )胰酶消化传代, 每 3天全量换液。经过不断 地传代使 M SCs扩增和纯化。 1�5� 实验用药 � 待大鼠苏醒, 不同组分别进行以上量灌 胃,待再灌注 24h后分别予以 MSC s组、补阳还五汤联合组 尾静脉注入 1 ! 106 个 /mL约 1mL的骨髓间质干细胞 (M SCs),而假手术组与模型组则注入相应量的生理盐水。 1�6� 神经功能评价 � 各组动物于脑缺血前、再灌注后 1、4 天及再灌注后 7天进行评分时进行神经功能评价。评分标 准 [ 11]为: 0分: 无明显神经损伤症状; 1分: 不能完全伸展左 侧前爪; 2分:向左侧划圈; 3分: 行走时向左侧倾倒; 4分: 不能自发行走,意识丧失。 神经功能评价在取材前进行。每次评分 3次, 取平均 值,分数越高, 说明动物行为障碍越严重。 1�7� 组织标本的获取和制备 � 苏木素 -伊红 ( HE )染色: 鼠脑缺血 24h, 再灌注 7天断头处死,取脑组织,经 4%甲醛 灌注固定,切取厚约 2mm 的脑组织, 常规石蜡包埋, H E染 色,光镜观察。TUNFL染色: 将石蜡包埋标本行冠状切片, 厚 3�m,按试剂盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行操作。光镜下凋亡细胞核呈 棕色。每张切片随机选取不重复 5个高倍 ( 400 ! )视野, 输入计算机进行图象分析,计算每个视野的凋亡细胞个数, 结果取均数。 1�8� 数据统计 � 采用国际通用统计分析系统 SPSS 13�0进 行数据分析 � 以均数 �标准差 ( x� s ) 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示,采用方差分析后最 小显著差 ( LSD) t检验, P < 0�05为差异有统计学意义。 2� 结 � 果 2�1� 大鼠局灶性脑缺血再灌注后的神经功能缺损评分 � 缺血再灌组神经功能障碍症状在再灌注 1天时最为明显, 再灌注 4、7天有不同程度的恢复。M SCs组与补阳还五汤 联合 M SCs组均可明显减轻再灌注 4、7天的神经功能障碍 症状。模型对照组、M SCs组与假手术组相比, 1、4、7天神 经功能评分有显著差异 (P < 0� 01); 补阳还五汤联合 M SCs 组与假手术组相比 1、4天神经功能评分有显著差异 (P < 0� 01), 而 7天两组之间无显著性差异 (P > 0�05); 与模型 组比较, M SCs组于 7天, 补阳还五汤联合 MSCs组于 4天、7 天均有显著差异 (P < 0� 01); 后两者之间于 7天有显著差 异 (P < 0� 01)。见表 1。 表 1� 各组大鼠 4个时间点的神经学评分情况 ( x � s) 组别 n 评分 术前 1天 4天 7天 假手术组 12 0 0. 67 � 0. 49 0. 17 � 0. 40 0. 17 � 0. 39 模型组 12 0 2. 50 � 0. 52# 2. 42 � 0. 51# 1. 67 � 0. 65# MSCs组 12 0 2. 25 � 0. 62# 2. 08 � 0. 67# 1. 00 � 0. 74# ∃ 补阳还五汤联合 MSCs组 12 0 2. 08 � 0. 67# 1. 75 � 0. 62# ∃ 0. 79 � 0. 82∃ % � � 注: 与假手术比较, #P < 0�01;与模型组比较 , ∃ P< 0�01; 与MSC s组比较, % P< 0�01。 2� 2� HE染色光镜下改变 � 假手术组脑组织神经细胞、海 马锥体细胞、胶质细胞形态正常,结构完整, 核呈圆形或椭 圆形,核和核仁明显, 胞浆无红染, 无细胞及间质水肿。模 型组光镜下可见神经细胞重度肿胀,胞核固缩或溶解, 部分 胞核偏向一侧甚至消失细胞周围间隙增大,缺血组织与正 常组织的界限清晰可辨, 白质疏松、有大量空泡形成, 而管 外间隙增宽,周围有淋巴细胞浸润。M SCs组及补阳还五汤 联合 MSC s组大鼠脑组织的神经元变性相对较轻, 细胞外 间隙较小,神经元胞浆、核膜相对清晰,血管外间隙较小, 多 数神经元结构较完整,形态相对正常, 细胞及间质水肿轻。 2� 3� 凋亡细胞计数 � 假手术组脑组织中见到较少细胞凋 亡,模型组、MSCs组和补阳还五汤联合 M SCs治疗组均可 见到细胞凋亡,主要见于损伤侧大脑皮层和海马。模型组 与假手术组比较 P < 0� 01, MSCS组与模型组比较 P < 0� 05,补阳还五汤联合 M SCs组与模型组比较 P < 0�01, 补 阳还五汤联合 M SCs组与 M SCs组比较 P < 0� 05。提示 MSCs组和补阳还五汤联合 MSCs组均有助于减少细胞凋 亡,以后者更为显著。见表 2。 表 2� 补阳还五汤诱导 MSCs对细胞凋亡的影响 ( x � s ) 组别 n 凋亡细胞数 假手术组 6 5. 00 � 1. 41 模型组 6 59. 50 � 2. 80% MSC s组 6 53. 50 � 4. 85%▼ 补阳还五汤与 MSCs组 6 49. 67 � 2. 58%▼# � � 注:与假手术比较, % P < 0�01;与模型组比较, ▼ P < 0�01;与 MSCs组比较, # P < 0�05。 3� 讨 � 论 脑缺血后,神经元的死亡是一个极其复杂的病理过程, 主要表现为坏死和凋亡两种形式, 分别涉及主动和被动细 胞死亡机制 [ 12- 13]。在脑缺血急性期, 神经元坏死与凋亡并 存,细胞坏死位于缺血中心区, 细胞凋亡主要出现在缺血半 暗带。而在脑缺血的迟发性神经元死亡期, 则以细胞凋亡 为主 [ 14]。 中医药复方补阳还五汤为清代医家王清任所创, 临床 上用于治疗缺血性脑血管疾病及其后遗症有着十分广泛的 应用, 现代研究发现补阳还五汤具有扩张脑血管、增加脑血 1661 第 27卷 � 第 8期 2 0 0 9年 8月 中 � 华 � 中 � 医 � 药 � 学 � 刊 CH INESE� ARCH IVES� OF� TRAD IT IONAL� CH INESE� MED IC INE Vo.l 27 No. 8 Aug. 2 0 0 9 中华中医药 1662� 学刊 流量的作用,能显著改善血液流变学各项指标,有降血脂作 用,有抗凝血及抑制血栓形成作用, 能抑制自由基反应,有 保护脑组织、抗脑水肿与脑缺血再灌注损伤的作用,及对神 经系统损伤后的修复作用等 [15]。近年来, 国内学者进行了 有关中医药单药对脑缺血再灌注细胞凋亡的研究, 取得了 一定的成果。如曲有直等 [ 16- 19]认为川芎嗪、黄芪均可减少 脑缺血再灌注后神经细胞凋亡, 大黄及其有效成分对脑缺 血损伤具有保护作用等。但有关中医药复方对脑缺血再灌 注细胞凋亡的研究较少, 对于中医药复方联合骨髓间充质 干细胞对脑缺血再灌注诱导脑神经细胞凋亡的研究更少。 骨髓间充质干细胞 (M esenchym a l S tem C ellS, MSCs)属 多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能,体内 移植后不良反应较弱。M SCs能够穿越血脑屏障 ,促进大小 胶质细胞的形成 [ 20], 其向神经细胞分化潜能为神经系统损 伤后的修复提供了一个新的干细胞来源。 本实验结果显示, MSCs组与补阳还五汤联合 MSC s组 均可明显减轻再灌注 4、7天的神经功能障碍症状。M SCs 组及补阳还五汤联合 M SCs组大鼠脑组织的神经元变性相 对较轻;模型组、MSCs组和补阳还五汤联合 MSCs治疗组 均可见到细胞凋亡, 主要见于损伤侧大脑皮层和海马。补 阳还五汤联合 M SC s组有助于减少细胞凋亡, 最为显著。 研究表明: MSCs组与补阳还五汤联合 M SCs组对大鼠脑缺 血再灌注损伤均有保护作用, 联合使用比单用骨髓间充质 干细胞减少神经细胞凋亡效果更显著。 近年来,国内外学者对骨髓间质干细胞 (M SCs)移植对 神经系统损伤的治疗作用进行了实验研究, 研究表明其作 用机制是多方面的。首先 M SCs移植后向病变部位的组织 渗透融合、替代或补充损伤神经细胞,从而达到恢复神经功 能的作用 [ 21], 其次, MSC s同宿主神经组织间的相互作用, 可导致一些细胞因子和营养因子的产生 [ 22] ,从而改善损伤 局部微环境,对神经功能的恢复发挥积极的作用。静脉注 射移植 M SCs, 对脑缺血再灌注损伤鼠神经功能恢复有治疗 作用。张运克等的实验研究已表明益气活血方补阳还五汤 诱导 M SCs向神经干细胞的分化, 通过神经干细胞的进一 步分化发挥脑保护作用 [ 23]。至于移植的 MSCs具体是如 何发挥作用还有待进一步研究。 参考文献 [ 1] � 楚冰,邵国富.脑缺血后迟发性神经元死亡及分了机制 [ J ]. 国外医学& 脑血管疾病分册, 1999, 7( 6 ): 330- 333. 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