Bcl_2基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的实验研究

作者单位: 442000 � 湖北省十堰市郧阳医学院附属太和 医院干部科(张小乔 ) ; 华中科技大学同济医学院附属协和医 院神经内科(梅元武 � 郑丽芳 � 张 � 红 � 郭远瑾 � 徐江华) Bcl�2基因修饰的骨髓间充质干细胞移植 治疗脑缺血的实验研究 张小乔 � 梅元武 � 郑丽芳 � 张 � 红 � 郭远瑾 � 徐江华 � � �摘要 � 目的 � 观察 Bcl�2 基因修饰的骨髓间充质干细胞( MSCs)移植对大鼠脑缺血性损伤的治疗作用 及对移植的 MSCs 保护性作用。方法 � 将 114 只 SD 大鼠随机分为假手术组、Model组、MSCs 组和 Bcl�2� MSCs 组;线栓法制作大鼠一侧大脑中动脉缺血再灌注模型, M SCs 组及 Bcl�2�MSCs 组在缺血 24h 后经尾静 脉注射方式移植 BrdU 标记的 MSCs 及人 Bcl�2 基因修饰的 M SCs;分别于术后 1、7、14、28 d 对各组大鼠进行 神经功能缺损评分( NSS) ;在脑缺血 14 d 应用 T TC 法观察梗死灶体积; BrdU 和 TUNEL 免疫荧光双重标记 检测移植的 M SCs 凋亡情况; Western blot 检测大鼠脑梗死周边区 Bcl�2 蛋白的表达; H E 染色观察脑组织病 理形态。结果 � MSCs�Bcl�2 组和 MSCs 组 NSS 评分、脑梗死体积百分比、TU NEL 阳性细胞数较 Model组低 (P< 0. 05 ) , 且 MSCs�Bcl�2 组比 MSCs 组更低, BrdU 阳性细胞数较多 ( P< 0. 05 ) ; MSCs�Bcl�2 组 BrdU 和 TU NEL 免疫荧光双标细胞数稍多,但差异不显著( P> 0. 05 ) , 而 MSCs�Bcl�2 组 BrdU 和 TUNEL 免疫荧光 双标细胞占 BrdU 阳性细胞百分比明显较低( P< 0. 05 )。M SCs�Bcl�2 组 Bcl�2 蛋白呈持续较高水平的表达, 和 MSCs 组同时间点相比差异有统计学意义( P< 0. 05 )。HE 染色示 M SCs 组和 M SCs�Bcl�2 组脑组织损伤 及细胞丢失较轻, MSCs�Bcl�2 组更明显, 脑梗死周边区均未见到核大、浓染的异形细胞。结论 � Bcl�2 基因修 饰的 MSCs 移植较 MSCs 移植能进一步改善脑缺血大鼠的神经功能,减少脑梗死体积; 其机制为 Bcl�2 基因修 饰使 MSCs 持续、稳定表达一定量的 Bcl�2蛋白, 从而能保护移植的 M SCs,减少其凋亡, 增加其存活。 �关键词 � Bcl�2 � 基因修饰 � 骨髓间充质干细胞 � 移植 � 脑缺血 �中图分类号 � R743 � �文献标识码 � A � �文章编号 � 1007�0478( 2009 ) 05�0270�06 Therapeutic benef it of intravenous transplantation of Bcl�2 gene� modif ied MSCs af ter cerebral ischemia in rats� Zhang X iaoq iao * , M ei Yuanw u, Zheng L if ang , et al . * Depar tment o f cadr e 's ward , T aihe H osp i� tal, Yunyang Medical College , S hiyan 442000 �Abstract � Objective � To surv ey the ther apeutic benefit of intr avenous t ransplantation of Bcl�2 gene� modified MSCs after ischemia in rats and the pro tect ive effect of Bcl�2 gene� modification to transplanted MSCs.Methods� The rat model of focal cerebral ischemia was established w ith unilateral middle cer ebr al arter y sut ur e occlusion method and reperfused 2h later w ith suture ex tracted. Rats in MSCs g roup and Bcl�2�MSCs g roup were transplanted MSCs and human Bcl�2 gene�modified MSCs labeled with 5�bromodeoxy�uridine ( Br� dU ) respectively thr ough tail vein intrav enous injection. Neurolog ical function of rats was evaluated w ith modi� fied Neurolog ical Severity Scores ( NSS) aft er ischemia. Cer ebr al infarction volume of rat s w as observ ed through tetrazolium chlor ide ( TT C) staining. BrdU and term ina l deoxynucleotide tr ansfer ase�mediated dUT P nick end�labeling ( T UNEL ) immunofluorescence double labeling technique w as used to detect apopto sis of tr ansplanted MSCs. Patholo gic morphous of brain issue after ischemia was surv ey thr ough H E staining . T he expression of Bcl�2 pro tein in co rtex ar ound cer ebr al infarction w as detected through Western blo t. Results � The NSS sco re, the percentage of cerebral infar ct ion volume, the number o f T UNEL positiv e cell in MSCs g roup and Bcl�2�MSCs g roup w ere lower than t ho se o f model g roup ( P< 0 . 05 ) . T o compare w ith MSCs g roup, those indexes of Bcl�2�MSCs g roup were more low er ( P< 0. 05 ) . The number of BrdU positiv e cell in Bcl�2�MSCs group w as more than that of M SCs g roup (P< 0 . 05) . T he number of BrdU and TUNEL double labeling positive cell in Bcl�2�MSCs g roup w as mo re than that o f MSCs g roup but the difference w as not signif� icant( P> 0 . 05 ) . On differ ent time point after ischem ia, the expression level o f Bcl�2 pro tein w as higher continuously in Bcl�2�MSCs g roup than that of MSCs !270! Str oke and Nervous D iseases, Oct 2009 , V ol. 16, No . 5 g roup (P< 0 . 05) . H E stain showed that the br ain t issue damage w as milder, the number of lost cell w as fe� wer in Bcl�2�MSCs g roup and MSCs g roup than t hat o f model gr oup. There w ere not kary omegaly and hyper� chr omic cells in cor tex around cerebral infar ction in both M SCs gr oup and Bcl�2�MSCs group. Conclusions� Bcl� 2 gene modification can promote ameliorat ion of neur olo gica l deficit and reduction o f cer ebr al infarction volume in r at s int ravenously tr ansplanted w ith M SCs aft er ischemia. T he mechanism was asso ciated w ith that Bcl�2 gene modified MSCs can produce Bcl�2 prot ein continuously and steadily, the produced protein pro tect neur al cells and itself in ischemia environment . �Key words � Bcl�2 � Gene modification� M esenchymal stem cells� T ransplantation � Cerebral ischemia � � 骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cel ls, MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类组织 干细胞,具有自我更新能力及多向分化潜能。除能 分化为结缔组织细胞如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细 胞和支持造血的基质细胞外, 还能在体外及体内分 化为非中胚层来源的细胞如神经元和神经胶质细 胞[ 1]。同时,由于 MSCs 具有来源广泛、取材容易、 低免疫源性的优势,因此是细胞移植及基因转染治 疗神经系统损伤及变性疾病理想的候选细胞。众多 实验研究的结果显示, MSCs 移植对脑缺血具有治 疗作用[ 2]。无可否认, 移植后 MSCs 的存活是细胞 移植治疗能否成功及发挥最大治疗效应的关键环 节。在诱发神经细胞大量凋亡和坏死的恶劣的脑缺 血病理生理环境中担负修复重任的移植细胞也必然 面临着与神经细胞同样的生存压力,因此如何保护 移植的 MSCs、提高其生存率必然成为研究的一大 热点。Bcl�2是调节细胞凋亡的基本成员,能对抗多 种原因引起的细胞凋亡, 被认为是能够抑制细胞凋 亡发生的∀抗凋亡基因#。我们在体外研究发现人 Bcl�2( hBcl�2)基因转染可提高 MSCs在缺氧和血清 剥夺环境中的耐受力, 降低其受损伤后凋亡的发 生[ 3]。本研究将 hBcl�2 基因修饰的 MSCs 通过静 脉注射的方式移植到脑缺血大鼠体内, 观察 hBcl�2 基因修饰是否确实能进一步提高 MSCs 的存活率, 从而在治疗脑缺血过程中发挥更大的效果。 1 � 材料与方法 1. 1 � 实验动物及分组 清结级 Sprague�Daw ley( SD)大鼠, 4~ 6 周龄, 体重 100~ 150 g,雌雄不拘, 用于 MSCs 取材; 清洁 级雄性SD大鼠, 8~ 10周龄,体重 200~ 250 g,用于 制作大鼠大脑中动脉 ( MCA) 缺血再灌注( I/ R)模 型,均由华中科技大学同济医学院实验动物中心提 供。实验共分 5组, 即( 1 ) 假手术组( Sham 组, n= 6) ; ( 2) 脑缺血组( Model组, n= 36) :再按不同的时 间点分为缺血/再灌注( ischem ia/ r eper fusion, I/ R) 后 1 d ( n= 6)、7 d ( n= 6 )、14 d ( n= 12)、28 d ( n= 12 ) 4 个亚组; ( 3 ) 脑缺血+ MSCs 移植组 ( M SCs 组, n= 36) :同上; ( 4 ) 脑缺血+ MSCs�Bcl�2 移植组 ( M SCs�Bcl�2组, n= 36 ) :同上。 1. 2 � 实验材料 L�DMEM 培养基( Hyclone 公司) , 淋巴细胞分 离液、优级胎牛血清( FBS) (天津灏洋生物技术有限 公司) , 质粒 pcDNA3�hBcl�2 (美国 Buck 老年研究 中心 Karen S. Poksay 教授惠赠) , L ipofect 转染试 剂(北京 TIANGEN 公司) , 红四氮唑 ( T TC ) ( Am� resco 公司) , Br dU ( Sigma 公司) , G418 ( Gibco 公 司) ,兔抗 BrdU 单克隆抗体( Sigma公司) , FIT C标 记的山羊抗兔 IgG(北京中衫金桥生物技术有限公 司) , CY3标记的 T UNEL 凋亡检测试剂盒 (美国 promega公司) ,兔抗 Bcl�2 IgG(美国 Santa Cr uz公 司) ,蛋白质 marker ( Promega 公司) , Western blot 检测试剂盒( Amersham 公司)。 1. 3 � 大鼠 MSCs 的分离、培养及 pcDNA3�hBcl�2 质粒转染和筛选 参照张本斯等联合采用密度梯度离心及贴壁法 分离培养大鼠 MSCs[ 4]。将传代培养至第 5 代的 MSCs按照北京 TIANGEN 公司Lipo fect 转染试剂 说明书上的转染步骤进行转染。根据细胞的量及细 胞培养器皿的表面积大小加入不同量的无血清培养 基稀释的质粒 DNA 和无血清培养基稀释的 Lipo� fect复合物, 置 CO2恒温培养箱中转染 48 h 后更换 培养基,加入 G418进行筛选, 筛选浓度为 600 �g/ m l,每 3~ 4 d更换 1次培养基, 每次更换培养基时 均加入相同浓度的 G418进行筛选, 所需筛选时间 约 2周。 1. 4 � 大鼠脑缺血再灌注模型制作 参照 Zea Longa线栓法制作大鼠右侧大脑中动 !271!卒中与神经疾病 2009 年 10月第 16 卷第 5 期 脉( m iddle cerebral artery , M CA)缺血模型, 缺血 2 h后拔出线栓实现再灌注 [ 5]。假手术组仅分离、暴 露血管,不插线栓。大鼠 I/ R 24 h 后按 Zea Longa 等人创立的 5级神经功能缺陷评分方法对大鼠进行 神经功能评分[ 5] ,选择神经功能评分在∃�%级的大 鼠纳入实验对象,剔除神经功能评分在 0级和&级 的大鼠,并分别予以补充。 1. 5 � MSCs标记及细胞移植 BrdU1 mg: 1 . 5 ml溶于重蒸 H 2O 中,过滤器过 滤除菌。于移植前 48 h取 50 �l溶液加入 5 ml细 胞培养液中, 避光培养 MSCs [ 6]。移植前用 PBS 洗 涤 2次,调整细胞浓度为 3 ∋ 103 /�l备用。MSCs组 及 MSCs�Bcl�2组大鼠 I/ R 24 h 后经尾静脉分别注 入 3 ∋ 103 /�l M SCs和 hBcl�2基因转染的 MSCs 悬 液 1 ml。 1. 6 � 大鼠神经功能评估 各组大鼠在相应的时间点应用修正神经功能缺 损评分 ( modified Neur olog ical Severity Sco res, NSS)方法进行神经功能评估 [ 7]。神经功能按受损 严重程度分为 0~ 18分, 0分为正常, 18分为最严重 神经功能缺失。NSS 根据一系列的运动、感觉、反 射和平衡试验进行评分。每给 1分表明大鼠不能完 成规定的试验或反射,因此评分越高,表明神经功能 损害越严重。 1. 7 � 脑梗死体积测定 TT C染色法测定脑梗死灶的体积。I/ R 后 14 d每组各取 6 只大鼠过量麻醉后处死, 迅速断头取 脑,去掉嗅球及后脑, 置于- 20 ( 冰箱中冷冻 10 min, 从额极开始切取 2 mm 厚的连续冠状位切片 5 张,置于 2%的 TT C溶液中孵育, 37 ( 避光水浴 30 min, 正常脑组织呈深红色,梗死灶呈白色。数码照 像机拍照,应用 Champion Image HPIAS�1000高清 晰度彩色病理图文报告 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 系统测出各区脑梗死面 积,根据公式 V= t ( A1+ )An) - ( A1+ An) / 2 算 出脑梗死体积, 其中 t 为切片厚度, A 为梗死面积。 用同样的方法计算梗死对侧大脑的体积, 然后以脑 梗死体积除以对侧大脑体积显示结果。 1. 8 � Br dU 和 T UNEL 免疫荧光双重标记检测 Model组、MSCs组及 MSCs�Bcl�2组在 I/ R 后 14 d各取 6只大鼠先行麻醉后灌注固定,然后将大 鼠断头取脑,置 4%多聚甲醛 PB 中后固定过夜, 之 后石蜡包埋,行连续冠状位切片;取相同层面的切片 行免疫荧光双重标记检测 BrdU 和 TU NEL 阳性细 胞,荧光显微镜下观察、拍照, 发绿色荧光者为 Br� dU 阳性细胞,红色荧光者为 TU NEL 阳性细胞,双 标阳性细胞重叠后发黄色荧光; 每张切片在放大 200倍荧光显微镜选取不同的 10个视野, 分别计数 BrdU 阳性细胞、T UNEL 阳性细胞及 BrdU 和 T UNEL 双标阳性细胞, 计算 BrdU 和 T UNEL 双 标阳性细胞占 BrdU 阳性细胞的百分比。 1. 9 � Western blot检测脑梗死周边区 Bcl�2表达水平 Model组、MSCs组及 MSCs�Bcl�2组在 I/ R后 7、14、28 d各取 6只大鼠用过量的水合氯醛麻醉,快 速断头取脑,用锋利的刀片切取脑梗死周边区少许 脑组织, 制备蛋白质样品及行 Western blot 检测 Bcl�2表达水平; 然后用凝胶图像成像系统进行扫描 拍照,用凝胶图像分析软件 BandScan V5. 0分析各 目标带的灰度值( A值) ,以 Bcl�2/ ��act in表示 Bcl�2 的相对表达水平。 1. 10 � 脑组织病理学观察 各组大鼠在 I/ R后 28 d时麻醉后灌注固定,取 大脑于相同固定液中外固定, 常规脱水、石蜡包埋、 取前囟前 2 mm 至前囟处脑组织作冠状位切片, HE 染色,于光镜下观察脑损伤程度及脑组织细胞形态。 1. 11 � 统计学处理 所有计量资料数据用 �x ∗ s 表示, 采用 SPSS 11 . 5统计软件,多组样本均数之间的比较用方差分 析和 q检验,检验水平 = 0. 05。 2 � 结 � 果 2. 1 � 各组大鼠 NSS神经功能评分 在 I/ R后 1 d 3 组大鼠 NSS 评分无显著性差 异;在 I/ R后 7、14、28 d MSCs�Bcl�2组和 MSCs组 大鼠 NSS 评分较 Model 组低 ( P < 0 . 05 ) , 并且 MSCs�Bcl�2 组 NSS 评分比 MSCs 组更低 ( P < 0. 05) , 表明 MSCs�Bcl�2 组大鼠神经功能恢复较 MSCs组更明显(图 1)。 2. 2 � 各组大鼠脑梗死体积百分比 MSCs组和 MSCs�Bcl�2 组脑梗死体积百分比 明显低于 Model组( P< 0 . 05 ) ; M SCs�Bcl�2组脑梗 死体积百分比较 MSCs 组低 ( P< 0 . 05 ) (表 1及图 2)。 2. 3 � BrdU 和 TU NEL 免疫荧光检测 MSCs组和 MSCs�Bcl�2组 TUN EL 阳性细胞 数较 Model 组少 ( P < 0. 05 ) ; M SCs�Bcl�2 组 T UNEL 阳性细胞数较 MSCs 组更少( P< 0. 05 )。 !272! Str oke and Nervous D iseases, Oct 2009 , V ol. 16, No . 5 MSCs�Bcl�2组 BrdU 阳性细胞数较 MSCs 组多( P < 0. 05) ;虽然 MSCs�Bcl�2组 BrdU 和 TU NEL 免 疫荧光双标细胞数稍多, 但差异不显著( P> 0. 05 ) , 而 MSCs�Bcl�2组 BrdU 和 T UNEL 免疫荧光双标 细胞占 BrdU 阳性细胞百分比明显较低, 差异具有 统计学意义( P< 0 . 05) (表 2及图 3)。 表 1� 各组大鼠脑梗死体积百分比( �x ∗ s, % ) 组别 n 梗死体积百分比( % ) S ham 组 1 0 Model组 6 36. 4 ∗ 2. 78 M SCs组 6 27. 1 ∗ 2. 63* MSCs�Bcl�2组 6 15. 5 ∗ 2. 52* + 注:与 M odel组比较, * P< 0. 05;与 M SCs组比较, + P< 0. 05 表 2� 各组 BrdU 和 TUNEL 阳性细胞数及 TU NEL 阳性 细胞的百分比( �x ∗ s, 个或% ) 组别 n TU NEL 阳性细胞数 BrdU 阳性 细胞数 BrdU& TUN EL 阳性 细胞数(占 BrdU 阳性 细胞百分比) Model组 6 34. 0∗ 3 . 58 - - M SCs组 6 23. 8∗ 2 . 40* 9. 5∗ 3 . 08 4 . 8 ∗ 1. 47 ( 51. 47 ∗ 6. 425% ) MSCs�Bcl�2组 6 15. 2∗ 2 . 04* , 22 . 0 ∗ 2. 61 , 5 . 3 ∗ 1. 21 ( 24. 05 ∗ 3. 546% , ) 注:与 Model 组比较, * P< 0. 05;与 MSCs 组比较, , P< 0. 05 2. 4 � Western blot 检测脑梗死周边区 Bcl�2表达水 平 在脑缺血后 7、14、28 d M SCs组 Bcl�2蛋白的 表达水平很低, 而 MSCs�Bcl�2组 Bcl�2蛋白呈持续 较高水平的表达, 和 MSCs组同时间点相比差异具 有统计学意义( P< 0 . 05) (表 3)。 表 3� 各组脑梗死周边区 Bcl�2 蛋白的相对 表达量( �x ∗ s, Bcl�2/��actin) 组别 n 不同时间点 Bcl�2的表达水平 7 d 14 d 28 d Model 组 6 0. 11 ∗ 0. 038 0. 06 ∗ 0. 012 0. 08 ∗ 0.014 M SCs组 6 0. 12 ∗ 0. 045 0. 08 ∗ 0. 013 0. 07 ∗ 0.011 MSCs�Bcl�2组 6 0. 82 ∗ 0. 145* 0. 79 ∗ 0.132* 0. 66 ∗ 0. 114* 注: 与M odel组和 MSC s组比较, * P< 0. 05 2. 5 � 脑组织病理学观察 HE 染色光镜下观察发现 3组大鼠脑缺血区均 见囊状坏死、大量神经元缺失,有较多的格子细胞及 少量的中性粒细胞;坏死周边区可见细胞核固缩、裂 解,胶质细胞增生及白细胞浸润不明显。MSCs组 和 MSCs�Bcl�2组神经细胞的损伤及丢失相对较轻, 脑梗死周边区均未见到核大、浓染的异形细胞。 3 � 讨 � 论 干细胞研究的兴起及在神经科学方面的研究进 展为包括脑缺血在内的中枢神经系统神经损伤性疾 病的修复带来了希望。在用于移植的候选细胞中 MSCs具有很大的优势及应用前景。MSCs移植治 疗脑缺血的众多研究已经表明其能够促进脑缺血大 鼠神经功能恢复 [ 2, 8]。其治疗的机制包括 ( 1 ) M SCs分化为神经细胞,替代死亡或变性的神经元, 从而可能在神经环路重建中发挥作用 [ 2, 9] ; ( 2 ) M SCs分泌多种神经营养因子, 发挥神经营养效 应[ 1 0] ; ( 3) MSCs促经内源性神经干细胞的增殖, !273!卒中与神经疾病 2009 年 10月第 16 卷第 5 期 图 3� 各组大鼠脑组织 TUNEL 和 BrdU 免疫荧光检测 ( ∋ 400 倍 ) � A 为 Model 组 TUNEL 荧光; B 为 MSCs 组 TUNEL 荧光; C 为 MSCs 组 BrdU 免疫荧光; D 为 MSCs 组 BrdU 及 TUNEL 荧光双标; E 为 MSCs�Bcl�2 组 TUNEL 荧 光; F 为 MSCs�Bcl�2 组 BrdU 免疫荧光; G 为 MSCs�Bcl�2 组 BrdU 及 TUNEL 荧光双标 激活细胞的自我修复[ 11]。尽管在治疗机制方面已 经存在众多的研究结果及推测,目前尚未完全明确, 但有一点是可以肯定的, 即移植细胞的数量及在脑 内的存活是其发挥作用的根本所在。 脑缺血性损伤是一个复杂的病理生理过程, 缺 血性脑卒中时缺血中心的细胞很快死亡, 而周边区 尤其是半暗带的一些神经元呈现为凋亡的形态学改 变。脑缺血后凋亡的发生既是凋亡相关基因表达的 结果, 又受许多内外因素的调节。氧和营养物质的 匮乏、兴奋性氨基酸和自由基的毒性作用、细胞内钙 超载等是导致神经细胞死亡的重要的病理生理基 础[ 12]。缺血反应对于移植后的 MSCs透过血脑屏 障、归巢定位于脑缺血周边区从而发挥其治疗作用 是有利的,但是我们不能忽视脑缺血损伤的局部病 理性的微环境对 MSCs存活的威胁。为此, 本研究 探索建立了 Bcl�2修饰的基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 化 MSCs,并将其 移植,研究结果表明 Bcl�2 修饰的 MSCs能进一步 提高治疗效果, 改善大鼠神经功能缺失,神经细胞的 损伤进一步减轻, 脑梗死体积进一步缩小。 Bcl�2是 T sujimoto 等从滤泡性淋巴瘤中分离 出来的一种原癌基因, 后来的研究发现 Bcl�2 是调 节细胞凋亡的基本成员, 能对抗多种原因引起的细 胞凋亡,被认为是能够抑制细胞凋亡发生的∀抗凋亡 基因#。Bcl�2抗细胞凋亡的机制可能在于( 1 ) Bcl�2 与凋亡促进基因 Bax 形成二聚体,抑制其促凋亡作 用[ 1 3] ; ( 2 ) 通过直接或间接的方式调节线粒体膜的 通透性,抑制细胞色素 C 自线粒体释放至细胞浆, 阻止胞浆内细胞色素 C对 Caspases蛋白酶的激活, 从而抑制凋亡[ 14] ; ( 3) 通过直接或间接地影响内质 网中 Ca2+ 的释放, 从而实现抑制或调节细胞凋亡的 发生[ 15] ; ( 4) Bcl�2还可作为一种抗氧化剂调节细胞 的氧化还原状态而抑制细胞凋亡的发生[ 16]。研究 表明 Bcl�2与脑缺血的严重程度密切相关, 其表达 可提高脑组织缺血耐受力, 从而减轻损伤程度[ 17]。 将 Bcl�2基因转入脑内, 可抑制和减少脑缺血导致 的神经细胞凋亡的发生[ 18] 。hBcl�2 基因转染的 MSCs移植入脑内后,持续稳定表达的 Bcl�2可能也 是通过上述机制发挥作用,提高 MSCs 在脑缺血环 境中的耐受力,降低其受损伤后凋亡的发生,从而增 强治疗效果。值得注意的是,本研究是把基因治疗 和干细胞移植相结合。MSCs合成、分泌的 Bcl�2本 身能够抑制和减少脑缺血导致的神经细胞凋亡的发 生,同时又能提高 MSCs的耐受力,从而更强地通过 神经营养效应或其他治疗机制而发挥治疗作用, 因 此治疗的作用得到了双重放大。本研究结果也证 实, Bcl�2基因修饰的 MSCs移植可进一步减少脑缺 血大鼠神经细胞凋亡; Bcl�2基因修饰的 MSCs 移植 到脑缺血大鼠体内∀归巢#后存活细胞增多,凋亡细 胞减少。 MSCs移植治疗的途经可选择立体定位局部脑 组织或脑室内注射、静脉或动脉注射。静脉注射方 式需要的细胞数相对较多, 但方便、创伤小,从应用 的角度来讲具有明显的优势,由此本实验选择了这 种移植方式。 MSCs移植治疗的安全性是众多学者考虑的问 题之一。干细胞具有自我增殖及多向分化潜能, 因 此在用于移植时必须考虑到其恶性增生及向肿瘤转 化的可能, 进行基因修饰后更应提高警惕。尽管 Bcl�2最初是作为一种原癌基因被认识的,但它对正 常细胞的增殖和分化没有影响, 不会导致细胞的恶 性转化而发生癌变。本实验观察被移植大鼠在移植 !274! Str oke and Nervous D iseases, Oct 2009 , V ol. 16, No . 5 后 28 d脑组织内未见到核大、浓染的异形细胞, 但 其长期安全性还有待进一步研究。 参 考 文 献 1 � Wis let Gendebien S , Waut ier F, L eprince P, et al. Ast rocyt ic and neuronal fate of m esench ymal stem cells expr ess ing nest in. Brain Res Bull , 2005, 68 ( 1�2) : 95�102. 2 � Zhao LR, Duan WM, Reyes M , et al. H uman bone m arrow stem cell s ex hibit neu ral phen otypes and am eliorate neurological def icit s after graft ing into the ischemic brain s of rat s. Exp Neu� rol, 2002, 174 ( 1) : 11� 20. 3 � 张小乔,梅元武,张 � 红,等. Bcl�2基因转染对骨髓间充质干细 胞体外模拟缺血性损伤保护作用的实验研究. 卒中与神经疾病, 2008, 15 ( 3) : 170�174. 4 � 张本斯, 王 � 凡, 邓 � 力, 等. 大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯 化与初步鉴定. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2003, 12( 2) : 161�165. 5 � Longa EZ, Weinstein PR, Carl son S , et al . Rever sible middle cerebral artery occlus ion with ou t cran iectomy in rat s. S tr ok e, 1989, 20 ( 1) : 84�91. 6 � 冯善伟, 姚晓黎,李 � 中,等. BrdU 体外标记大鼠骨髓间充质干 细胞的研究. 第一军医大学学报, 2005, 25( 2) : 184�186. 7 � Borlongan CV, Randall T S, Cahill DW, et al. 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