脓毒症的分子机制

2002年第29卷第1期 ·1· 脓毒症的分子机制 (文献综述) (南京军区南京总医院普通外科研究所，南京大学医学院临床学院， 南京 210002张佃良综述黎介寿 江志伟审校) 提要 内毒素是引起脓毒症的主要触发剂。脓毒症的本质是机体对细菌感染做出的过度反应，牵涉到大 量细胞因子及化学趋化因子的释放，在机体启动致炎反应的同时也启动了抗炎反应。 关键词脓毒症 内毒素细胞因子 中图分类号：R4，Q753文献标识码：A文章编号：looo一6877(2002)01—0001—04 脓毒症是外科ICU所面临的棘手问题，由其导致 的脓毒症性休克已经成为外科危重病人的主要死亡原 因。据报道，ICU病人中约有25％发展为脓毒症。10％ ～15％发展为严重脓毒症或脓毒症性休克“’。其机制 仍不清楚，可能牵涉到数十种甚至上百种基因的调控 改变，并有大量细胞因子和趋化因子的表达，引起机体 多方面的紊乱。 脓毒症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征 (SystemicInflammatoryResponseSyndrome，SIRS)， 并证实有细菌存在或高度可疑感染病灶者。SIRS是 1991年美国胸科医师学会(ACCP)和危重病学会(SC— CM)提出的概念他’，它可由感染或非感染因素如创伤 和化学物质引起，是指一种SIRS。严重脓毒症指脓毒 症伴有器官功能障碍，低灌注或低血压。低灌注和灌注 异常常表现为乳酸过多、少尿和急性神智改变等。脓毒 症性休克，是指补足盘容量后患者仍然低血压，同时有 乳酸过多、少尿和急性神智改变等。有些病人由于使用 血管收缩剂或心肌变应力的药物，在有灌注异常和器 官功能障碍时可以无低血压，此时仍定为脓毒症性休 克。 1．脓毒症的分子机制 细菌侵入机体后，首先被宿主免疫系统所识别。尽 管细菌种类极其庞大，但它们具有共同的或相似的结 收稿日期：2001—06—23 构特点。革兰阳性菌都具有脂多糖(LPS)结构，革兰阴 性菌都具有肽聚糖(PGN)、脂磷酸(LAT)。另外革兰 阳性菌和革兰阴性菌都具有未甲基化的DNA及脂蛋 白。它们可刺激单核细胞表面的CDl4等受体，经过 TLRs将信号传人细胞内，启动相关基因的转录。 内毒素是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，大约 50％的脓毒症休克是由它引起的。’。目前研究认为，细 菌因子在脓毒症的致病过程中起了非常重要的作用， SIRS和代偿性抗炎反应综合征(CARS)是脓毒症的重 要病理生理变化“’。 1．1内毒素与免疫细胞的结合 内毒素，其主要 化学成分是LPS，是革兰阴性菌细胞壁外层结构的主 要成分。目前已知道，只有单体的LPS才有刺激免疫 细胞的功能，CDl4是LPS的受体。人的CDl4是含 356个氨基酸的糖蛋白，其基因位于第5号染色体长 臂2区3带(5q23～31)，此区还有编码IL一3、粒细胞／ 巨噬细胞集落刺激因子和PGF受体等基因。CDl4以 两种形式存在，即mCDl4和sCDl4。mCDl4是分子量 为55kDa的糖蛋白，通过在内质网中装配的GPI锚在 髓原细胞膜的表面。sCDl4即可溶性CDl4包括2种， 分子量分别为55kDa和49kDa，前者是mCDl4脱离 GPI而来，后者是mCDl4在丝氨酸蛋白酶作用下水解 形成。1986年，人类CDl4基因序列被克隆出来，但其 确切功能仍不清楚。直到1990年，Wright等“’通过抗 体阻断实验才认识到CDl4是LPS的受体。有人认为， 万方数据 ·2· 国外医学外科学分册 在高浓度的LPS时存在时，不依赖于CDl4的通路也 可发挥作用“’。然而，单体LPS结构是两种激活通路 所必须的。 LPS与CDl4的结合由LBP介导。当血循环中 出现LPS时，LBP快速地与其结合形成LPSLBP 复合体，然后与巨噬细胞表面的CDl4结合。LBP是分 子量为58～60kd的糖蛋白，人LBP基因定位于第20 号染色体。肝脏合成其前体形式，分子量为50kd，分泌 到血液中后成为60kd的糖蛋白，即LBP。在正常人血 清中其浓度报道差异很大，约在0．5～10t-g／ml之间。 有文献报道，在急性反应时LBP浓度由5～10tlg／ml 上升到200pg／ml¨’，在肝LBPmRNA表达上调的同 时，肠、肺和肾等的表达也上升。体外实验发现，给大鼠 肺动脉平滑肌细胞的培养夜中加入TNFa、IL一1B、 IFN一7和LPS等都能诱导LBPmRNA的表达增加。 Gallay等@’发现，LBP抗体可以保护小鼠免遭内毒素 引起的休克，LBP缺乏的小鼠显示出对LPS有更强的 抵抗力。’，说明LBP对于LPS发挥毒性效应是必须 的。另一方面，LBP也能致进LPS转化成高密度脂蛋 白(HDL)导致其毒性的失活。“⋯。因此，LBP在内毒 素血症和脓毒症不同阶段显示不同的作用，在某种阶 段究竟哪种作用占优势尚需进一步探索。除mCDl4 外，连续产生的可溶性CDl4即sCDl4可与LPS结合 形成LPS／sCDl4复合体，能刺激rnCDl4阴性的细 胞，如内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞等。 值得注意的是，在脓毒症和创伤等严重的急性全 身性疾病时，mCDl4在单核细胞上的表达是下降的， 而血清中的sCDl4呈2倍或3倍的升高。在慢性炎性 疾病时，两者都是升高的n”。因此，对mCDl4及 sCDl4的动态检测，可以对SIRS甚至脓毒症的预后 提供帮助。 1．2内毒素的生物学活性内毒素的生物学效应主要 表现为介导作用，它可在细菌繁殖过程中或菌体破裂 后分泌出来，其方式有自分泌、旁分泌和内分泌。巨噬 细胞、内皮细胞、单核细胞、平滑肌细胞和嗜中性白细 胞等都是内毒素的靶细胞，在被激活后释放内源性介 质如细胞因子等。细胞因子在细胞内的主要功能是改 变基因表达，其方式不外乎以下4种形式：激活“沉默” 基因、上调基因表达、下调基因表达和关闭基因表达， 从而调节炎性反应。LPS激活巨噬细胞后，释放三种 介质，即蛋白质、反应性氧基和脂质。蛋白质包括 TNFa、IFN、IL一1、IL一6、IL一8、IL一12和蛋白酶如弹性蛋 白酶及组织蛋白酶B。LPS的生物效应能被重组 TNFa所模拟，可认为TNFe是内毒素血症的主要细 胞因子。在低浓度时，TNFa具有防御感染的作用，是 白细胞和内皮细胞活性和功能的调节者；高浓度时，如 在SIRS和脓毒血症病人，起有害作用可引起脓毒症 性休克“’。TNFa受体的表达非常广泛，几乎出现于所 有的细胞上。IL一1和IL一6也可由TNFa诱导产生，是 强有力的内源性致热源。内毒素引起的Oj、OH和ON 能提高巨噬细胞和中性白细胞的杀菌能力，但也引起 过度的炎性反应。内皮细胞来源的ON是强有力的血 管扩张剂，当产生过量时会导致休克的发生和发展。巨 噬细胞受LPS刺激时，多种脂类介质释放出来，例如， 血小板激活因子(PAF)、PGE。、白三烯C4等。这些脂 类介质参与了ARDS的形成，而后者经常伴有脓毒症 的发生。革兰阳性菌的超级抗原能使动物对内毒素达 致死性敏感，而这同等剂量的内毒素在无超级抗原存 在时对机体是无害的n”，其分子机制为INFY介导的 LPS靶细胞表面CDl4受体表达上调有关。 1．3Toll样受体一细胞内信号传导的媒介CDl4与 LPS结合后不可能把信号传人胞内，因为它以GPI的 形式锚在细胞膜上并缺乏横跨膜功能区“”。1997年， 人类的Toll受体，即Toll样受体(tolllikereceptors， TLRs)被发现‘1”。TLR家族有12个成员，其共同特点 为在细胞外都有LRR(1eucine—richrepeat)表位，细胞 质内都有TIR(Toll／IL一1Receptor)功能区。最初发 现，TIR可表达于所有的淋巴组织，其中外周血淋巴细 胞的表达最为丰富。现已用单克隆抗体证实，它可表达 于单核细胞、B细胞和树突状细胞n6“”。也有报道， TLRs存在于脂肪细胞、小肠粘膜上皮细胞及T细胞 等。目前认为，TLRs是PLS的信号传导受体。最初认 为，TLR2是单核细胞的LPS信号传导受体，但后来 的实验不支持此观点。在实验中发现，C3H／HeJ和 C57BL／10ScCr小鼠对LPS的低反应性是由于TLR4 基因突变引起的“8’1”。采用重组技术靶相阻断TLR4 基因可导致巨噬细胞及B淋巴细胞对LPS无反应 性‘2”，而TLR4基因缺乏的小鼠能高度抵抗LPS作为 引起的休克。所以，一般认为TLR4起到LPS跨膜信 号传导的作用。除LPS外，LTA和Taxol也可被 TLR4所识别。TLR4介导的LPS识别需要依靠MD2 的参与，后者缺乏跨膜蛋白，只有两者形成TLR4一 MD2复合体时才能作为巨噬细胞的LPS信号受体。 可用下面模式说明LPS信号在巨噬细胞内的传导途 径。”：当LPS信号进入细胞浆后，激活不同的MAPK 通路，包括ERL，JNK和p38。通过这些通路直接或间 接地激活不同的转录因子，如Elk、SRF、C—Jun、c—Fos、 ATF一2和CREB而启动基因的转录或翻译。另外， 万方数据 2002年第29卷第1期 ·3‘ LPS通过MyD88、IL一1受体相关激酶(IL一1receptor— associatedkinase，IRAK)和TNFa受体相关因子6 (TNFareceptor—associatedfactor6，TRAF6)激活 IkB激酶(IkappaBkinase，IKK)而使IKKl3磷酸化，后 者又使IkB磷酸化而降解。IkB降解后允许NF～xB复 合体进入细胞核，从而启动基因的转录。 与TLR4介导革兰阴性菌的信号传导相比， TLR2可能是革兰阳性菌的信号传导受体，它能识别 PGN、脂蛋白、LAM和酵母聚糖他”。 2．细胞内的抗炎反应 在SIRS病人，致炎因子和抗炎介质共同出现于 血循环且浓度显著升高‘2”。大量的外源性刺激物如内 毒素、外毒素。内源性刺激物如激活的补体(C5a)、 Hageman因子(FXⅡa)和细胞损伤的产物，都刺激单 核细胞及巨噬细胞合成TNFa和IL—lp等而引起炎症 反应。有证据表明机体也启动了抗炎反应，抗炎介质主 要包括转移生长因子一13(TGF～8)、IL一4、IL一10、IL～11、 IL一13可溶性TNF受体和IL一1受体拮抗剂娌”。另外， 这些介质还可以下调它们自己的合成，使致炎反应和 抗炎反应达到平衡，以维护内环境的稳定啦”。此外，巨 噬细胞的一些产物PGE：等有抑制过度炎性反应的功 能。 在细胞培养和动物模型中，经过8小时小剂量的 内毒素可以导致内毒素耐受状态，然后再给予致死剂 量的内毒素却不能导致致死性的致炎状态。此时脱离 IkB的NF—KB仍然形成，但其功能不良。NF—JcB单体 有两种形式存在，p50’和p65。p65亚单位有一功能区， 一旦结合到染色体的启动区，就会允许致炎基因的表 达，而p50亚单位没有此功能区，是一种无活性的亚单 位。NF—KB二聚体有两种形式存在：有活性的p50、p65 单体和无活性的两个p50单体。尽管超活性的p65同 性二聚体也能形成，但出现的量很小。有研究表明，由 于内毒素耐受所导致的NF—xB功能不良，反应了无转 录活性的p50同性二聚体过量产生，也反应了NF—xB 抑制部分IkB的过量合成，或I．cB激酶的缺乏。IKB激 酶的功能是导致IxB磷酸化，引起IxB的降解。此外， I*B启动子能够被NF—KB上调，这就形成了一个负反 馈：NF一曲．引起IkB表达增加，而后都又降低NF一出 的连续激活。别的机制也可能存在，如活性的p50～65 和无活性的p5065之间的比例。当此比例为0．8± 0．i或更小时，NF一．cB活性受到抑制，机体处于抗炎状 态‘”。 如上所述，NF—xB功能不良或IkB过量表达可以 降低致炎因子TNF屯IL一1B的释放，但这对细胞粘附 分子的表达影响很小，因为后者无mRNA的转录“’。 机体细胞有一比较完善的抗炎系统一热休克蛋白 (HSP)系统，以维持细胞的防御功能。HSP，也称分子 伴侣(molecularchaperones)，在应激状态下，可防止蛋 白质发生变形或解聚。在动物实验中，它能够减轻小鼠 因CLP所导致的死亡率，并能降低脓毒症引起的肺损 伤。HSP产生是不特异的，它可在许多氧应激中形成， 同时NF—KB也受到激活。大量表达的HSP给予细胞 非特异性保护，免遭氧应激的伤害，也能降低细胞对致 炎因子的反应。有文献报道，脓毒症病人外周血单核细 胞产生大量的HSP一70。HSPT0是主要的分子伴侣，氧 应激反应激活了热休克因子，后者进入细胞核，致进编 码HSP一70基因的转录。HSP一70通过抑制IkB磷酸化 等途径下调NF—KB的激活。 尽管脓毒症的研究已经取得了很大的进展，但其 根本的分子机制还仍不清楚。在机体内既存在着致炎 反应，又存在着抗炎反应，细胞因子和趋化因子以及神 经内分泌因素等形成了一个复杂的网络。单纯用促进 或抑制一种或几种细胞因子的治疗是无效的，动物实 验和临床应用不相符甚至矛盾的现象已清楚地说明了 这一点。所以应从临床及分子生物学角度等全面地研 究其分子机制。 参考 文 献 1．Brun—BuissonC．IntensCareMed2000(Suppl 1)；26：$64．2．MembersoftheAmericanCollege ofChestPhysicians／SocietyofCriticalCareMedicine ConsensusConferenceCommittee．CritCareMed 1992；20：864—874．3．JonesGR，eta1．QJMed 1997；89：515—522．4．AdrieC，eta1．IntensCare Med2000；26：364—374．5．WrightSD，eta1．Sci— ence1990；249：1431—1433．6．WoltmannA，et a1．ArchSurg1998；383：2—10．7．SchumannRR， eta1．Science1990；249：1429—1431．8．GallayP， eta1．ProcNatlAcadSci(USA)1994；91：7922— 7926．9．JackRS，eta1．Nature1997；389：742—— 745． 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免疫，尤其是细胞免疫，在抗肿瘤免疫中起关键作用， 并且应用简便，可直接注射质粒至肌肉，通过肌细胞的 MHCI、MHCⅡ传递抗原信息，不必考虑个体间的 MHC限制性。但研究发现大多数肿瘤相关抗原的免 疫原性较弱，容易逃避机体免疫系统对它的监视，故为 免疫系统提供适当的生物佐剂以增强抗原的提呈，成 了构建核酸疫苗成败的关键。近年来，对肿瘤核酸疫苗 免疫佐剂的实验研究取得了令人瞩目的成绩，现综述 如下： 免疫佐剂是指与抗原同时／或预先应用时，能增强 机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型 的一些物质，包括无机佐剂如氢氧化铝，有机佐剂如脂 多糖、分枝杆菌等及合成佐剂如双链多聚肌苷酸：胞苷 酸(polyI：c)等。近年来，随着细胞因子研究的进展， 发现许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效应，能增 强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性， 这些细胞因子包括IL一1、IL一2、IFN一7、GM—CSF、IL一6、 IL一12等。它们能作用在免疫反应的某个环节，增强肿 收稿日期：2001—04—08 瘤抗原所诱发的抗肿瘤免疫。 1．细胞因子的免疫佐剂效应 白介素1(IL1)可增强小鼠对牛血清白蛋白的二 次抗体反应，促进小鼠对绵羊红血球(SRBC)的溶血空 斑反应，增强小鼠肺癌的特异性免疫治疗效果，即增强 肿瘤抗原的免疫原性。其他细胞因子如IL一2、IL一3、IL一 4、IL一6、IL一10和肿瘤坏死因子(TNF)也具有明显的佐 剂效应，它们可增强肿瘤抗原的免疫应答性。进一步证 实，细胞因子也能影响DNA疫苗的免疫效果。为了增 强DNA疫苗激活免疫应答的效果，研究者将一系列 的细胞因子作为佐剂在DNA接种后用于小鼠。结果 发现，重组IL一2、IL一6、IL一7、IL一12使用组比仅用DNA 的对照组显著降低荷瘤(CT26)小鼠的转移瘤数。其中 IL一12的效果最强。此结果表明，细胞因子佐剂能激活 并扩增淋巴细胞群，加强DNA免疫的治疗效果。 将多种细胞因子基因联合或组合应用后，能通过 对CTL及Ab产生的影响进而调节针对疫苗的免疫 应答。有报道用基因枪将IL一6基因导入荷瘤小鼠，可 使甲基胆蒽诱发的纤维肉瘤消退，若联合导入INF、a 和TNF一7基因则能抑制肾肿瘤模型(Renca)的生长。 将IL一2和IFN一7基因导入能延长Renea肿瘤耐受小 鼠的存活期，并有25％的实验鼠肿瘤消退。 IL一2或许是所有细胞因子佐剂中被最广泛研究 的细胞因子，抗原接种后多次给予IL一2能增强抵抗感 染源的能力。IL一2还能扭转与MHC相关的对多肽抗 万方数据