IL-23 在小鼠乳腺癌中的抗肿瘤作用及其免疫机制

免疫学实验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 IL-23 在小鼠乳腺癌中的抗肿瘤作用及其免疫机制 [摘要] 目的: 研究白细胞介素23(IL-23)在小鼠乳腺癌中的抗肿瘤作用及其免疫功能变化。方法: 将逆转录病毒介导转染IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞( IL-23 /MA-891)、转染逆转录病毒空载体的小鼠乳腺癌细胞( LXSN / MA-891)及亲代小鼠乳腺癌细胞(MA-891) 分别接种于小鼠皮下, 观察小鼠成瘤及肿瘤生长情况； 30d时取3组小鼠脾脏和肿瘤组织,用ELISA 法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 3组小鼠脾细胞在MA-891诱导下IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-4的产生情况; 用流式细胞术( FCM ) 检测肿瘤组织细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面分子MHC-I、MHC-II、CD80、CD86的表达, 检测脾细胞中CD11c 阳性细胞的比率, 并对脾细胞中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞进行分选; 用免疫组织化学技术对3组肿瘤组织中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞浸润情况进行检测。 [关键词] 白细胞介素23 ；抗肿瘤；免疫机制; 在世界范围内乳腺癌的发病率逐年上升, 而且乳腺癌患者有年轻化趋势。目前的常规治疗手段对提高乳腺癌患者长期生存率仍不十分理想, 所以研究有效的治疗方法已迫在眉睫。乳腺肿瘤的发生和发展是多种因素作用的结果。机体免疫功能在控制乳腺肿瘤的发生和发展方面发挥着重要的作用[1] , 机体免疫监视功能的下降, 乳腺肿瘤细胞产生的免疫抑制因素以及乳腺肿瘤细胞的免疫逃逸作用等是乳腺肿瘤发生和发展的原因之一[2] ,因此, 提高机体的免疫功能, 就有可能起到抗肿瘤的作用。 白细胞介素23( IL-23)是2000年发现的一种由p19亚基和p40亚基共同构成的一种细胞因子[3] , 主要来源于活化的单核巨噬细胞和树突状细胞(DC),具有较强的免疫调节活性, 参与自身免疫性疾病、慢性炎症反应和某些感染性疾病的发病和调控过程[2]。IL-23具有与IL-12功能相近但更复杂的细胞因子。有报道提出,IL-23可通过诱导和增强小鼠脾细胞CTL活性和IFN-γ等细胞因子的产生而发挥抗肿瘤作用[3]，但与IL-12相比，不会诱导淋巴细胞产生高水平的γ干扰素( IFN-γ), 减少了毒副作用。因此，IL-23作为肿瘤基因治疗的候选因子越来越受到关注。本实验设计将转染有鼠IL-23 基因并能分泌IL-23 的小鼠乳腺癌细胞( IL-23/MA-891)接种于津白II号小鼠体内观察肿瘤生长情况, 研究IL-23体内抗肿瘤作用及其免疫机制。 1 材料和方法 1. 1􀀁 材料 逆转录病毒介导转染IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞( IL-23 /MA-891) 、转染逆转录病毒空载体的小鼠乳腺癌细胞( LXSN /MA-891)及亲代小鼠乳腺癌细胞(MA-891)。津白II号小鼠( 雌性, 6~ 8周龄)。IFN-γ、TNF-α和IL-4 ELISA 检测试剂盒; IL-12ELISA检测试剂盒; FITC 标记的抗小鼠CD11c、CD80、CD4、CD8 单克隆抗体( mAb) 及PE 标记的CD86 mAb ; FITC 标记的抗小鼠MHC-I类分子mAb和PE标记的抗小鼠MHC-II类分子mAb; 兔抗鼠CD4、CD8抗体、山羊抗兔IgG抗体及SP试剂。 1. 2􀀁 方法 1. 2. 1􀀁 小鼠荷瘤实验􀀁 将津白II号小鼠随机分为3组, 分别于右侧背部皮下注射0.1 mL(含5×105 个活细胞) 的IL-23 /MA-891、LXSN /MA-891 和MA-891细胞。观察小鼠成瘤及肿瘤生长情况, 各组小鼠每隔2 d用游标卡尺测量皮下肿瘤长径和短径, 用下列公式计算肿瘤体积: 肿瘤体积( cm3 ) = 长径×短径2 ×1/2。 1. 2. 2􀀁 脾细胞分泌细胞因子的检测􀀁 于接种IL-23 /MA-891、LXSN /MA-891 和MA-891细胞后30 d, 分别取3组各6只小鼠脾脏, 无菌制备脾细胞悬液, 按每孔0.1 mL脾细胞(含2 ×105 个)和0.1 mL丝裂霉素处理的MA-891细胞(含2 ×105 个) 加入到96孔板中, 再加入终浓度0.05 g /L ConA 刺激小鼠脾细胞, 48 h后用ELISA法检测各组脾细胞培养液中IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-4的含量。 1. 2. 3􀀁 脾细胞中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞的分选􀀁 同1. 2. 2方法取出3组小鼠脾脏, 制成单细胞悬液, 用PBS洗2次, 然后每组加入FITC 标记的抗小鼠CD4、CD8 mAb, 避光作用60 min, 采用流式细胞术( FCM )进行CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞的分选试验。 1. 2. 4􀀁 脾细胞CD11c分子表达的检测􀀁 同上将3组小鼠脾细胞制成单细胞悬液, 用PBS洗2次, 分别加入FITC标记抗小鼠CD11cmAb, 避光作用60 min, 用FCM 分析CD11 c阳性细胞的比率。 1. 2. 5􀀁 肿瘤组织细胞表面分子的检测􀀁 于注射IL-23 /MA-891、LXSN /MA-891 和MA-891细胞后30 d, 取出3组小鼠肿瘤组织制成单细胞悬液, 用PBS洗2次, 然后每组分别加入FITC标记抗小鼠MHC-I类分子、CD80 mAb及PE 标记抗小鼠MHC-II类分子、CD86 mAb, 避光作用60 min, 用FCM 分析细胞表面待测分子的表达情况。 1. 2. 6􀀁 肿瘤组织中CD4+ 、CD8+淋巴细胞浸润情况的检测􀀁 同上切取3组肿瘤组织, 100 g/L甲醛固定, 石蜡包埋组织做5 cm 厚切片, 常规脱蜡、水化, 加TritonX-100修复暴露抗原( 4.℃过夜)。以100 mL /L 山羊血清封闭非特异性结合位点( 37.℃30 min) 后, 分别滴加兔抗鼠CD4、CD8 抗体( 4.℃过夜), 山羊抗兔IgG和SABC( 37.℃各孵育1 h)。用DAB 显色后, 再以苏木素复染, 于显微镜下观察结果。 1. 2. 7􀀁 统计学分析􀀁 应用SPSS12.0软件对所有数据进行单因素方差分析( ONEWAY-ANOVA) 统计学处理。P < 0. 05为具有统计学意义。 2 预期结果 2.1 IL-23 基因转染组与空载体转染组及亲代细胞组在小鼠体内的成瘤率均为100%。但IL-23 基因转染组小鼠皮下结节生长速度明显慢于接种空载体转染组及亲代细胞组。 2.2 接种IL-23/MA-891 细胞的小鼠脾细胞可产生高水平的IFN-γTNF-α和IL-12等Th1类及相关细胞因子,与接种LXSN/MA-891细胞和MA-891 细胞2组小鼠的脾细胞相比明显增加；而Th2 类细胞因子IL-4的水平却无统计学意义。 2.3 IL-23/MA-891组CD4+ 淋巴细胞及CD8+淋巴细胞比率�均较LXSN /MA-891组明显增高。 2.4 接种IL-23/MA-891细胞组小鼠脾脏中, CD11c 阳性细胞比率与接种LXSN/MA-891和MA-891细胞组小鼠脾脏相比CD11c阳性细胞比率有明显增高；而接种LXSN /MA-891 和MA-891细胞组小鼠脾脏中CD11c 阳性细胞比率之间无统计学意义。 2.5 IL-23/MA-891组肿瘤组织细胞表面分子MHC-I、MHC-II、CD80、CD86表达与接种MA-891和LXSN/MA-891细胞组相比较有明显的提高； MA-891和LXSN/MA-891组小鼠的肿瘤组织细胞表面分子表达无统计学意义。 3 预期结果分析 3.1 IL-23基因转染组小鼠皮下结节生长速度明显慢于接种空载体转染组及未转染组, 表明IL-23基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著下降。说明导入IL-23 基因的小鼠乳腺癌细胞分泌的IL-23发挥了明显的抗肿瘤作用, 减低了肿瘤在活体内的侵袭能力, 降低了其生长速度。 3.2 接种IL-23/MA-891细胞的小鼠与分别接种MA-891细胞和LXSN /MA-891细胞的小鼠相比较, 其脾细胞经MA-891刺激后产生了较高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-12,而IL-4的水平无明显变化。机体免疫功能的平衡主要由两类辅助性T细胞亚群Th1 和Th2 产生的细胞因子决定的[4] 。IFN-γ和TNF-α是Th1细胞产生的细胞因子,IL-12可诱导Th1细胞产生Th1类细胞因子, 在胞免疫中发挥重要作用; 而IL-4为Th2细胞产生的细胞因子, 在体液免疫中发挥重要作用。大量的动物实验及临床实验已证实IFN-γ具有较强的抗肿瘤和免疫调节作用, TNF-α可直接造成肿瘤细胞的凋亡[5, 6] 。IFN-γ、TNF-α等在细胞因子如IL-12等的抗肿瘤效应中发挥着重要作用[7] 。 3.3 免疫组化结果显示,接种IL-23/MA-891 细胞小鼠肿瘤组织中CD4+和CD8+ 淋巴细胞浸润较接种MA-891 和LXSN /MA-891细胞小鼠明显增加; 接种IL-23/MA-891细胞小鼠脾细胞流式分选结果显示CD4+淋巴细胞及CD8+ 淋巴细胞比率较LXSN MA-891、MA-891组明显增高。说明IL-23可能主要通过诱导宿主淋巴细胞产生Th1类细胞因子, 增强CD8+ T淋巴细胞细胞毒作用而发挥抗肿瘤作用。 3.4 树突状细胞( DC )是最重要的抗原提呈细胞, 当与T细胞相遇时, 可将抗原提呈给T 细胞产生第一信号, 协同刺激分子为T 细胞的活化提供第二信号,使初始T细胞充分激活, 诱导CD4+T 和CD8+T 细胞免疫反应。IL-23可以与小鼠DC 结合, 诱导DC产生IFN-γ, 提高DC 的抗原提呈能力[ 8] 。 综上所述, 本研究结果提示, IL-23可通过增加肿瘤的抗原性及抗原提呈的协同刺激作用, 增强细胞免疫功能, 防止肿瘤逃逸, 发挥抗肿瘤作用。 参考文献: [ 1] Buben ik J. 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