实时荧光定量反转录PCR
Real-Time Reverse Transcription PCR(RT-PCR)
1 材料
1. 1 仪器
756型紫外分光光度计
国产上海
ABI 7300 Real-Time PCR System
美国ABI公司
RS-28高速低温离心机
德国贺利氏公司
超低温冰箱
德国贺利氏公司
UVP凝胶扫描系统
美国UVP 公司
微量移液器
德国Gilson公司
DYZ-22A型双恒定时电泳仪
北京市六一仪器厂
DYY-Ⅲ桥式电泳仪
北京市六一仪器厂
1. 2 试剂
RNA提取试剂Trizol Reagent为Invitrogen公司产品;
逆转录酶(M-MLV ),核糖核酸酶抑制剂(RNasin),dNTP,Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase),随机引物(Random primers),琼脂糖(agarose)均为美国Promega 公司产品;
荧光定量试剂盒:Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI公司
RNA提取:
取约100mg组织于冰浴匀浆器中,加入1ml Trizol (Invitrogen,USA),迅速研磨成匀浆液,加入200l氯仿,震荡30S,冰上放置5 min。4℃,12000 rpm,离心10 min,取上层水相转移至另一1.5ml离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置2h。然后4℃,12000 rpm,离心20 min,弃上清,加入1ml 75%乙醇,轻轻混匀,4℃,12000 rpm,离心10min,吸净上清液,于室温下晾干,加入20l DEPC处理的去离子水溶解沉淀,-80℃保存备用。
反转录(RT):
(试剂盒: Promega,USA)
反转录反应液组成如下表:
Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chain
Component
Volume(l)
Concentration
5×R.T.buffer*
5
1×
dNTP
2.5
10M/l
RNasin
2
20U/l
RNA
5.3
g
Random Primer
1
0.1ug/l
M-MLV
6
5 U/l
Nucleasr-Free Water
3.2
Total
25
42℃反转录50min,95℃ 5min灭活反转录酶。
Syber Green 荧光定量PCR检测:
(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI)
仪器型号:ABI 7300 Real-Time PCR System,美国ABI公司
PCR反应液组成如下表:
Table 2 Mixed components for polymerase chain reaction
Component
Volume (ul)
R.T.product
1
2×Master Mix
10
Primer
1+1
H2O
7
Total
20
PCR热循环参数:96℃ 4min,然后三步反应:94℃ 30S,58℃ 30s,72℃ 30s,进行40个循环,于每个循环的第三步即:72℃ 30s收集荧光信号。
实时荧光定量PCR结果分析:
扩增完毕后,进入结果分析界面,以GAPDH为内参照基因,与对照组相比,得到目的基因表达的相对定量值(RQ值),将RQ值用于统计分析。
引物序列:
GAPDH
上游引物:5’- TGAACGGGAAGCTCACTGG -3’
下游引物: 3’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC -3’
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