首页 实时荧光定量RT-PCR实验流程

实时荧光定量RT-PCR实验流程

举报
开通vip

实时荧光定量RT-PCR实验流程实时荧光定量反转录PCR Real-Time Reverse Transcription PCR(RT-PCR) 1 材料 1. 1 仪器 756型紫外分光光度计 国产上海 ABI 7300 Real-Time PCR System 美国ABI公司 RS-28高速低温离心机 德国贺利氏公司 超低温冰箱 德国贺利氏公司 UVP凝胶扫描系统 美国UVP 公司 微量移液器 德国Gilson公司 DYZ-22A型双恒定时电泳仪 ...

实时荧光定量RT-PCR实验流程
实时荧光定量反转录PCR Real-Time Reverse Transcription PCR(RT-PCR) 1 材料 1. 1 仪器 756型紫外分光光度计 国产上海 ABI 7300 Real-Time PCR System 美国ABI公司 RS-28高速低温离心机 德国贺利氏公司 超低温冰箱 德国贺利氏公司 UVP凝胶扫描系统 美国UVP 公司 微量移液器 德国Gilson公司 DYZ-22A型双恒定时电泳仪 北京市六一仪器厂 DYY-Ⅲ桥式电泳仪 北京市六一仪器厂 1. 2 试剂 RNA提取试剂Trizol Reagent为Invitrogen公司产品; 逆转录酶(M-MLV ),核糖核酸酶抑制剂(RNasin),dNTP,Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase),随机引物(Random primers),琼脂糖(agarose)均为美国Promega 公司产品; 荧光定量试剂盒:Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI公司 RNA提取: 取约100mg组织于冰浴匀浆器中,加入1ml Trizol (Invitrogen,USA),迅速研磨成匀浆液,加入200l氯仿,震荡30S,冰上放置5 min。4℃,12000 rpm,离心10 min,取上层水相转移至另一1.5ml离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置2h。然后4℃,12000 rpm,离心20 min,弃上清,加入1ml 75%乙醇,轻轻混匀,4℃,12000 rpm,离心10min,吸净上清液,于室温下晾干,加入20l DEPC处理的去离子水溶解沉淀,-80℃保存备用。 反转录(RT): (试剂盒: Promega,USA) 反转录反应液组成如下表: Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chain Component Volume(l) Concentration 5×R.T.buffer* 5 1× dNTP 2.5 10M/l RNasin 2 20U/l RNA 5.3 g Random Primer 1 0.1ug/l M-MLV 6 5 U/l Nucleasr-Free Water 3.2 Total 25 42℃反转录50min,95℃ 5min灭活反转录酶。 Syber Green 荧光定量PCR检测: (Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI) 仪器型号:ABI 7300 Real-Time PCR System,美国ABI公司 PCR反应液组成如下表: Table 2 Mixed components for polymerase chain reaction Component Volume (ul) R.T.product 1 2×Master Mix 10 Primer 1+1 H2O 7 Total 20 PCR热循环参数:96℃ 4min,然后三步反应:94℃ 30S,58℃ 30s,72℃ 30s,进行40个循环,于每个循环的第三步即:72℃ 30s收集荧光信号。 实时荧光定量PCR结果分析: 扩增完毕后,进入结果分析界面,以GAPDH为内参照基因,与对照组相比,得到目的基因表达的相对定量值(RQ值),将RQ值用于统计分析。 引物序列: GAPDH 上游引物:5’- TGAACGGGAAGCTCACTGG -3’ 下游引物: 3’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC -3’
本文档为【实时荧光定量RT-PCR实验流程】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
该文档来自用户分享,如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服,我们会及时删除。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
下载需要: 免费 已有0 人下载
最新资料
资料动态
专题动态
is_197715
暂无简介~
格式:doc
大小:46KB
软件:Word
页数:3
分类:生产制造
上传时间:2011-12-22
浏览量:50