从6xHis标签蛋白表达纯化到结晶

CN20070726 06/2008 整合的蛋白质组解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 Ⅱ 从 6×His 标签蛋白表达纯化到结晶 从 6×His 标签蛋白表达纯化到结晶 整合的蛋白质组解决方案Ⅱ Tel: 021-38653865 Fax: 021-38653965 凯杰生物技术上海有限公司 Tel: 800 988 0325 Fax: 800 988 0327 技术支持热线 1 2Sample & Assay Technologies 克隆/载体 构建 表达筛选 大规模表达 蛋白纯化 标签去除 结构功能检测（蛋白结晶） EasyXtal and NeXtal Products TAGZyme Factor Xa System Products His-Tag Technology! Ni-NTA resins Anti-His Antibodies Easy-Xpress Mini / Maxi /NMR E. coli & insect Kit QIAgene Expression Kit EasyXpress Linear Template Kit pQE and pIX vectors Easy-Xpress Large Scale Kits (Mega) 实验 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 试剂/工具 针对功能蛋白质组学的研究，QIAGEN 提供完整的解决方案，从 6×His 标签蛋白的表达，纯化，检测，到蛋白晶体的 培养，QIAGEN 提供全套产品。 本 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 主要内容包括： ■ 6×His 标签蛋白表达系统 ...............................................P2-P6 □ QIAgene 预制蛋白载体 - QIAgene 表达载体结构 - QIAgene 表达载体有效提高蛋白产量 - 利用 Ni-NTA 纯化 QIAgene 蛋白 - QIAgene 蛋白载体订购 □ QIAexpress System 体内表达 □ EasyXpress System 体外表达 ■ 6×His 标签蛋白纯化系统 ...............................................P7-P11 □ Ni-NTA 纯化试剂特点 □ Ni-NTA 纯化 6xHis 标签蛋白的实验流程 □ Ni-NTA 纯化试剂结构 □ Ni-NTA 纯化试剂的兼容性 □ Ni-NTA 纯化试剂的结合能力 □ Ni-NTA 纯化 6×His 标签蛋白的纯度 □ Ni-NTA 纯化试剂规格及参数 ■ 6×His 标签去除系统......................................................P12 ■ 6×His 标签蛋白检测系统 ...............................................P12 ■ QIAGEN 蛋白结晶平台 ..................................................P13-P14 ■ 常见表达纯化问题及建议 ...............................................P15 ■ 产品订购信息 ................................................................P16-P17 ■ 最新文献摘选 ................................................................P18 6×His 标签蛋白表达系统 QIAgene 预制蛋白表达载体 QIAgene 预制蛋白表达载体是 QIAGEN 和 GENEART 合作推出，专门针对 35,000 个人类基因所设计，目的在于解决 人类蛋白表达瓶颈难题。采用最权威的 Gene OptimizerTM 软件，对 DNA 序列进行以下方面优化： ■ 消除稀有密码子而采用最佳密码子 ■ 调整编码序列 GC 含量 ■ 最小化 mRNA 二级结构影响 ■ 避免重复序列和内部核糖体结合位点等影响 经优化后的全长 cDNA 序列克隆到表达载体中，进一步经过序列验证，以确保序列的正确性。确保优化序列在 E.coli 体 内或体外，昆虫细胞（Coming soon), 哺乳动物细胞体系（Coming soon) 中高效表达。 QIAgene Expression Kit 提供整套解决方案，包括 QIAgenes Expression Construct E. coli, Positive Control, Penta·His Antibody 以及 Ni-NTA Spin Columns。 图1 QIAgenes表达载体结构 QIAgene 表达载体结构 ■ 含有 T7 启动子，可直接在 BL2I（DE3）等菌株或利用无细胞系统 进行表达（如 EasyXpress E.coli-based kits） ■ N 端带有 6×His 标签，在 Ni-NTA 上进行一步亲和纯化， 利用 TAGZyme™ 去除 6×His 标签 ■ His-tag 两端有 Nde I 酶切位点，可用于表达无标签蛋白 ■ C 端内置琥珀终止密码子，方便利用 EasyXpress Site-Specific Biotin Kit 进行生物素标记 ■ 卡那霉素抗性用于筛选 www.qiagen.com/protein 6×His 标签蛋白表达系统 QIAGEN 的蛋白表达产品主要围绕 6×His 标签所设计。目前 QIAGEN 提供 QIAexpress System 体内表达和 EasyXpress 体外表达产品用于获得 6×His 标签蛋白。并开发了 QIAgene 预制蛋白表达载体，专门解决人类蛋白的表达难题。 相比于其他常用标签（如 GST），6×His 标签具有以下独特优势： ■ 分子量小，只有 0.84 KDa ■ 在 pH8.0 时不带电，几乎没有免疫原性 ■ 不会影响蛋白的分泌、折叠和功能 ■ 可以放在 C 端或 N 端 ■ 下游可以利用金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 Ni-NTA 进行纯化 1 2Sample & Assay Technologies 克隆/载体 构建 表达筛选 大规模表达 蛋白纯化 标签去除 结构功能检测（蛋白结晶） EasyXtal and NeXtal Products TAGZyme Factor Xa System Products His-Tag Technology! Ni-NTA resins Anti-His Antibodies Easy-Xpress Mini / Maxi /NMR E. coli & insect Kit QIAgene Expression Kit EasyXpress Linear Template Kit pQE and pIX vectors Easy-Xpress Large Scale Kits (Mega) 实验流程 试剂/工具 针对功能蛋白质组学的研究，QIAGEN 提供完整的解决方案，从 6×His 标签蛋白的表达，纯化，检测，到蛋白晶体的 培养，QIAGEN 提供全套产品。 本手册主要内容包括： ■ 6×His 标签蛋白表达系统 ...............................................P2-P6 □ QIAgene 预制蛋白载体 - QIAgene 表达载体结构 - QIAgene 表达载体有效提高蛋白产量 - 利用 Ni-NTA 纯化 QIAgene 蛋白 - QIAgene 蛋白载体订购 □ QIAexpress System 体内表达 □ EasyXpress System 体外表达 ■ 6×His 标签蛋白纯化系统 ...............................................P7-P11 □ Ni-NTA 纯化试剂特点 □ Ni-NTA 纯化 6xHis 标签蛋白的实验流程 □ Ni-NTA 纯化试剂结构 □ Ni-NTA 纯化试剂的兼容性 □ Ni-NTA 纯化试剂的结合能力 □ Ni-NTA 纯化 6×His 标签蛋白的纯度 □ Ni-NTA 纯化试剂规格及参数 ■ 6×His 标签去除系统......................................................P12 ■ 6×His 标签蛋白检测系统 ...............................................P12 ■ QIAGEN 蛋白结晶平台 ..................................................P13-P14 ■ 常见表达纯化问题及建议 ...............................................P15 ■ 产品订购信息 ................................................................P16-P17 ■ 最新文献摘选 ................................................................P18 6×His 标签蛋白表达系统 QIAgene 预制蛋白表达载体 QIAgene 预制蛋白表达载体是 QIAGEN 和 GENEART 合作推出，专门针对 35,000 个人类基因所设计，目的在于解决 人类蛋白表达瓶颈难题。采用最权威的 Gene OptimizerTM 软件，对 DNA 序列进行以下方面优化： ■ 消除稀有密码子而采用最佳密码子 ■ 调整编码序列 GC 含量 ■ 最小化 mRNA 二级结构影响 ■ 避免重复序列和内部核糖体结合位点等影响 经优化后的全长 cDNA 序列克隆到表达载体中，进一步经过序列验证，以确保序列的正确性。确保优化序列在 E.coli 体 内或体外，昆虫细胞（Coming soon), 哺乳动物细胞体系（Coming soon) 中高效表达。 QIAgene Expression Kit 提供整套解决方案，包括 QIAgenes Expression Construct E. coli, Positive Control, Penta·His Antibody 以及 Ni-NTA Spin Columns。 图1 QIAgenes表达载体结构 QIAgene 表达载体结构 ■ 含有 T7 启动子，可直接在 BL2I（DE3）等菌株或利用无细胞系统 进行表达（如 EasyXpress E.coli-based kits） ■ N 端带有 6×His 标签，在 Ni-NTA 上进行一步亲和纯化， 利用 TAGZyme™ 去除 6×His 标签 ■ His-tag 两端有 Nde I 酶切位点，可用于表达无标签蛋白 ■ C 端内置琥珀终止密码子，方便利用 EasyXpress Site-Specific Biotin Kit 进行生物素标记 ■ 卡那霉素抗性用于筛选 www.qiagen.com/protein 6×His 标签蛋白表达系统 QIAGEN 的蛋白表达产品主要围绕 6×His 标签所设计。目前 QIAGEN 提供 QIAexpress System 体内表达和 EasyXpress 体外表达产品用于获得 6×His 标签蛋白。并开发了 QIAgene 预制蛋白表达载体，专门解决人类蛋白的表达难题。 相比于其他常用标签（如 GST），6×His 标签具有以下独特优势： ■ 分子量小，只有 0.84 KDa ■ 在 pH8.0 时不带电，几乎没有免疫原性 ■ 不会影响蛋白的分泌、折叠和功能 ■ 可以放在 C 端或 N 端 ■ 下游可以利用金标准 Ni-NTA 进行纯化 QIAexpress system体内表达 QIAexpress System 体内表达产品用于蛋白的大量表达。QIAexpress 系列采用 pQE 载体在大肠杆菌，哺乳动物细胞以及 杆状病毒中表达 6×His 标签蛋白。按照 6×His 标签加入的位置、种类可以将 pQE 载体分为以下几类： ■ N 末端标签载体 ■ C 末端标签载体 ■ 顺式抑制表达载体 ■ 多系统表达载体 ■ 含有切除标签蛋白酶切位点载体 ■ 双标签载体，pQE 载体详情见表 2 应用 载体 表达 N端带有 6×His标签的蛋白 标准表达标签 pQE-9, -30, and -80L series 直接克隆 PCR 产物 pQE-30 UA 高效去除 6×His 标签 TAGZyme™ pQE vectors, pQE-30 Xa 毒性相关蛋白表达 pQE-80L series 双标签载体 pQE-100 DoubleTag™ 小分子量蛋白和多肽表达 pQE-40 表达 C端带有 6×His标签的蛋白 标准表达标签 pQE-60, -70 多系统表达载体，平行在 E. coli, pQE-TriSystem Insect 和 Mammalian 细胞中表达 表达带有 His·Strep-tagged 或 pQE-TriSystem His·Strep 1 and 2 Strep-tagged 蛋白 小分子量蛋白和多肽表达 pQE-16 表达 C端带有 Strep标签的蛋白 标准表达标签 pQE-TriSystem Strep vector Vector preparation Protein expression Screening and selection Transformation bla bla Induction Cell lysis Centrifuge IPTG induction Colony blot QIAexpress System 内体表达产品获得的蛋白适用于多种应用，包括有： 1）活性功能蛋白制备 2）抗体制备 3）结晶实验 4）蛋白-蛋白和蛋白－DNA 相互作用 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 体内表达实验流程 表 2 pQE 载体选择表 QIAgene 表达载体订购 QIAgene 的订购也非常方便，点击 www.qiagen.com/PG/GeneGlobe/Default.aspx，输入所需基因即可。省去了传统 流程中的文库筛选，PCR 扩增，亚克隆，克隆筛选，测序等繁琐步骤。 6×His 标签蛋白表达系统 利用 Ni-NTA 纯化 QIAgene 蛋白 QIAgene 表达载体 N 端带有 His 标签，可以利用 Ni-NTA 一步纯化得到高纯度蛋白。如果实验需要得到无标签蛋白 , His 标签可以利用 TAGZyme system 去除（见图 3）。 3 4Sample & Assay Technologies 6×His 标签蛋白表达系统 www.qiagen.com/protein 图 3 利用 TAGZyme 高效去除 His 标签。His-tagged TNFα 利用 Ni-NTA 纯化后，与 DAPase 孵育 30 min. M: 分子量标准 CL：细 胞裂解物 FT：流出组分 W：洗涤组分 E：洗脱组分 kDa M CL FT FTW E 10‘ 30‘ FT DAPase pGAPase His-TNFa TNFa pG 72 55 43 34 26 17 11 QIAgene 表达载体有效提高蛋白产量 对表 1 中 100 种 DNA 序列优化前后的表达结果进行比较，结果表明，使用 QIAgene 大于 90% 的蛋白被成功表达（膜 蛋白占 60%） ，产量比未经优化序列提高 50 倍。且无论在 E.coli 体内，体外系统中均能得到最优表达 ( 见图 2)。 图 2 未优化序列与 QIAgene 优化序列表达水平比较。利用 EasyXpress 体外表达系统进行蛋白表达，Ni-NTA 纯化后，利用 Penta.His 抗体检测 表达水平 表 1 DNA 序列优化实验 QIAgene 预制表达载体用来提高人类蛋白在 E.coli 中的表达成功率和产量，获得的蛋白可用于以下领域 : 1）功能分析 2）结构分析 3）相互作用检测 QIAexpress system体内表达 QIAexpress System 体内表达产品用于蛋白的大量表达。QIAexpress 系列采用 pQE 载体在大肠杆菌，哺乳动物细胞以及 杆状病毒中表达 6×His 标签蛋白。按照 6×His 标签加入的位置、种类可以将 pQE 载体分为以下几类： ■ N 末端标签载体 ■ C 末端标签载体 ■ 顺式抑制表达载体 ■ 多系统表达载体 ■ 含有切除标签蛋白酶切位点载体 ■ 双标签载体，pQE 载体详情见表 2 应用 载体 表达 N端带有 6×His标签的蛋白 标准表达标签 pQE-9, -30, and -80L series 直接克隆 PCR 产物 pQE-30 UA 高效去除 6×His 标签 TAGZyme™ pQE vectors, pQE-30 Xa 毒性相关蛋白表达 pQE-80L series 双标签载体 pQE-100 DoubleTag™ 小分子量蛋白和多肽表达 pQE-40 表达 C端带有 6×His标签的蛋白 标准表达标签 pQE-60, -70 多系统表达载体，平行在 E. coli, pQE-TriSystem Insect 和 Mammalian 细胞中表达 表达带有 His·Strep-tagged 或 pQE-TriSystem His·Strep 1 and 2 Strep-tagged 蛋白 小分子量蛋白和多肽表达 pQE-16 表达 C端带有 Strep标签的蛋白 标准表达标签 pQE-TriSystem Strep vector Vector preparation Protein expression Screening and selection Transformation bla bla Induction Cell lysis Centrifuge IPTG induction Colony blot QIAexpress System 内体表达产品获得的蛋白适用于多种应用，包括有： 1）活性功能蛋白制备 2）抗体制备 3）结晶实验 4）蛋白-蛋白和蛋白－DNA 相互作用分析 体内表达实验流程 表 2 pQE 载体选择表 QIAgene 表达载体订购 QIAgene 的订购也非常方便，点击 www.qiagen.com/PG/GeneGlobe/Default.aspx，输入所需基因即可。省去了传统 流程中的文库筛选，PCR 扩增，亚克隆，克隆筛选，测序等繁琐步骤。 6×His 标签蛋白表达系统 利用 Ni-NTA 纯化 QIAgene 蛋白 QIAgene 表达载体 N 端带有 His 标签，可以利用 Ni-NTA 一步纯化得到高纯度蛋白。如果实验需要得到无标签蛋白 , His 标签可以利用 TAGZyme system 去除（见图 3）。 3 4Sample & Assay Technologies 6×His 标签蛋白表达系统 www.qiagen.com/protein 图 3 利用 TAGZyme 高效去除 His 标签。His-tagged TNFα 利用 Ni-NTA 纯化后，与 DAPase 孵育 30 min. M: 分子量标准 CL：细 胞裂解物 FT：流出组分 W：洗涤组分 E：洗脱组分 kDa M CL FT FTW E 10‘ 30‘ FT DAPase pGAPase His-TNFa TNFa pG 72 55 43 34 26 17 11 QIAgene 表达载体有效提高蛋白产量 对表 1 中 100 种 DNA 序列优化前后的表达结果进行比较，结果表明，使用 QIAgene 大于 90% 的蛋白被成功表达（膜 蛋白占 60%） ，产量比未经优化序列提高 50 倍。且无论在 E.coli 体内，体外系统中均能得到最优表达 ( 见图 2)。 图 2 未优化序列与 QIAgene 优化序列表达水平比较。利用 EasyXpress 体外表达系统进行蛋白表达，Ni-NTA 纯化后，利用 Penta.His 抗体检测 表达水平 表 1 DNA 序列优化实验 QIAgene 预制表达载体用来提高人类蛋白在 E.coli 中的表达成功率和产量，获得的蛋白可用于以下领域 : 1）功能分析 2）结构分析 3）相互作用检测 用 EasyXpress System 体外表达产品获得的蛋白适用于广泛的下游应用，包括： 1）活性分析 2）结构和突变分析 3）蛋白－蛋白相互作用研究 4）开放阅读框的表达和分析 } – Unglycosylated form with signal peptide Glycosylated forms 50 kDa – 30 kDa – MNTCORM1 15 kDa – 图5 EasyXpress Insect kit用于成功表达糖蛋白 ORM1，利用Penta His 抗体进行检测。NTC： 无模板对照，M: 6×His蛋白分子量标准 EasyXpress System 体外表达 EasyXpress System 体外表达用于快速筛选和表达多种蛋白产物。体 外表达产品线分为原核体外（E.coli）和真核体外（Insect）表达（见表 3）。 EasyXpress Protein Synthesis Kit 使用高质量的 E. coli 裂解液，该种裂解液 含有所有用于有效蛋白合成所需的转录和翻译机制的组分，可以获得 600 μg/ml（Mini和Maxi kit）或 5 mg/2×5 ml的蛋白产量（Mega和NMR Kit）。 应用 产品 2-step PCR 制备线形模板 EasyXpress Linear Temtplage Kit Plus 小到中量体外合成重组蛋白 EasyXpress Protein Synthesis Mini Kit EasyXpress Protein Synthesis Maxi Kit 对重组蛋白进行定点或随机性生物素标记 EasyXpress Site-Specific Biotin Kit EasyXpress Random Biotin Kit 大规模体外合成重组蛋白 EasyXpress Protein Synthesis Mega Kit EasyXpress NMR Protein Synthesis Kit 体外合成带有翻译后修饰的真核蛋白 EasyXpress Insect Kit II EasyXpress pIX4.0 Vector 蛋白种类 利用EasyXpress Insect System成功表达的蛋白 Kinases PKACβ, IRAK4, AKT1, MKK3, pKAα Membrane proteins Mitochondrial 2-oxoglutarate carrier protein (OGCP), Mtj1, TrpV4, CNR1 Blood coagulation factors Factor II, Factor VIII (B domain) Transcription/translation factors TFIIAαβ, TFIIAγ, eIF4E Cytokines and growth factors TNFα, TAU Glycoproteins EPO, alpha-1-acid glycoprotein 1 (ORM), gp67 Other enzymes Luciferase, CAT, Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase (IDI), β-glucuronidase, DHFR Other proteins GFP variants, FABP, Ubiquitin, Transthyretin 真核体外表达产品 EasyXpress Insect II 采用优化的昆虫细胞裂解液与兔网织红细胞等体系不同，无须添加其他成分就 可以真正实现翻译后修饰蛋白的快速表达 (见图 4，表 4)，已成功用于激酶、膜蛋白、糖蛋白、磷酸化蛋白等的体外表达 （见 图 5、表 5）。 体外表达实验流程 表 3 EasyXpress System 体外表达产品选择表 表 5 EasyXpress Insect kit 成功用于各类真核蛋白表达 6×His 标签蛋白表达系统 图 4 利用 EasyXpress Insect II Kit 与兔网织红细胞体系（RRL-based kit) 表达膜蛋白 OR5（odorant receptor 5) 对比图。NTC：无模板对照， M：分子量标准 www.qiagen.com/protein5 6Sample & Assay Technologies 6×His 标签蛋白表达系统 Prodein analysis/purification uing Ni-NTA or Strep-Tactin matrix EasyXpress Insect Kit II M MNTCkDa 120 NTC Supplier PII 100 80 60 50 40 30 20 OR5 对比标准 EasyXpress Insect Kit II RRL-based kit (Supplier P) 产量 40 µg/ml (全部活性蛋白) 3-6 µg/ml 翻译后修饰 糖基化，信号肽剪切,磷酸化 需要另外购买添加微粒体膜；产量减少50-80% 重现性 好，昆虫细胞系和裂解液的处理是连续的 差，混合体系(兔网织红细胞和微粒体膜)来自不同的 动物个体 裂解液中 固定浓度，便于在放射性标记实验中计算产量 不同氨基酸浓度差异大(1 µM - 1 mM) 氨基酸浓度 操作性 所有成分均为液体，加样精确度高 裂解液含有红色沉淀物，导致精确加样困难， 干扰光度检测 表 4 昆虫细胞 (EasyXpress Insect) 体系与兔网织红细胞 (RRL-based) 体系对比 用 EasyXpress System 体外表达产品获得的蛋白适用于广泛的下游应用，包括： 1）活性分析 2）结构和突变分析 3）蛋白－蛋白相互作用研究 4）开放阅读框的表达和分析 } – Unglycosylated form with signal peptide Glycosylated forms 50 kDa – 30 kDa – MNTCORM1 15 kDa – 图5 EasyXpress Insect kit用于成功表达糖蛋白 ORM1，利用Penta His 抗体进行检测。NTC： 无模板对照，M: 6×His蛋白分子量标准 EasyXpress System 体外表达 EasyXpress System 体外表达用于快速筛选和表达多种蛋白产物。体 外表达产品线分为原核体外（E.coli）和真核体外（Insect）表达（见表 3）。 EasyXpress Protein Synthesis Kit 使用高质量的 E. coli 裂解液，该种裂解液 含有所有用于有效蛋白合成所需的转录和翻译机制的组分，可以获得 600 μg/ml（Mini和Maxi kit）或 5 mg/2×5 ml的蛋白产量（Mega和NMR Kit）。 应用 产品 2-step PCR 制备线形模板 EasyXpress Linear Temtplage Kit Plus 小到中量体外合成重组蛋白 EasyXpress Protein Synthesis Mini Kit EasyXpress Protein Synthesis Maxi Kit 对重组蛋白进行定点或随机性生物素标记 EasyXpress Site-Specific Biotin Kit EasyXpress Random Biotin Kit 大规模体外合成重组蛋白 EasyXpress Protein Synthesis Mega Kit EasyXpress NMR Protein Synthesis Kit 体外合成带有翻译后修饰的真核蛋白 EasyXpress Insect Kit II EasyXpress pIX4.0 Vector 蛋白种类 利用EasyXpress Insect System成功表达的蛋白 Kinases PKACβ, IRAK4, AKT1, MKK3, pKAα Membrane proteins Mitochondrial 2-oxoglutarate carrier protein (OGCP), Mtj1, TrpV4, CNR1 Blood coagulation factors Factor II, Factor VIII (B domain) Transcription/translation factors TFIIAαβ, TFIIAγ, eIF4E Cytokines and growth factors TNFα, TAU Glycoproteins EPO, alpha-1-acid glycoprotein 1 (ORM), gp67 Other enzymes Luciferase, CAT, Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase (IDI), β-glucuronidase, DHFR Other proteins GFP variants, FABP, Ubiquitin, Transthyretin 真核体外表达产品 EasyXpress Insect II 采用优化的昆虫细胞裂解液与兔网织红细胞等体系不同，无须添加其他成分就 可以真正实现翻译后修饰蛋白的快速表达 (见图 4，表 4)，已成功用于激酶、膜蛋白、糖蛋白、磷酸化蛋白等的体外表达 （见 图 5、表 5）。 体外表达实验流程 表 3 EasyXpress System 体外表达产品选择表 表 5 EasyXpress Insect kit 成功用于各类真核蛋白表达 6×His 标签蛋白表达系统 图 4 利用 EasyXpress Insect II Kit 与兔网织红细胞体系（RRL-based kit) 表达膜蛋白 OR5（odorant receptor 5) 对比图。NTC：无模板对照， M：分子量标准 www.qiagen.com/protein5 6Sample & Assay Technologies 6×His 标签蛋白表达系统 Prodein analysis/purification uing Ni-NTA or Strep-Tactin matrix EasyXpress Insect Kit II M MNTCkDa 120 NTC Supplier PII 100 80 60 50 40 30 20 OR5 对比标准 EasyXpress Insect Kit II RRL-based kit (Supplier P) 产量 40 µg/ml (全部活性蛋白) 3-6 µg/ml 翻译后修饰 糖基化，信号肽剪切,磷酸化 需要另外购买添加微粒体膜；产量减少50-80% 重现性 好，昆虫细胞系和裂解液的处理是连续的 差，混合体系(兔网织红细胞和微粒体膜)来自不同的 动物个体 裂解液中 固定浓度，便于在放射性标记实验中计算产量 不同氨基酸浓度差异大(1 µM - 1 mM) 氨基酸浓度 操作性 所有成分均为液体，加样精确度高 裂解液含有红色沉淀物，导致精确加样困难， 干扰光度检测 表 4 昆虫细胞 (EasyXpress Insect) 体系与兔网织红细胞 (RRL-based) 体系对比 Ni-NTA 纯化试剂的结合能力 一般来讲，Ni-NTA 树脂的结合量为 20-40 mg/ml。由于 Ni-NTA 结合能力和蛋白的种类性质相关，对于某些蛋白如 6His-GFP 的结合量甚至大于 55mg/ml（见图 9）。 表 7 Ni-NTA 产品对不同种类蛋白的结合量 6×His标签蛋白 纯化条件 结合量 /ml 树脂 表6 与Ni-NTA可以兼容的常见试剂 6 M Gu·HCl 2% Triton X-100 20 mM β-ME 50% glycerol 4 M MgCl2 Up to 30% ethanol 8 M Urea 2% Tween 20 10 mM DTT 20% ethanol 5 mM CaCl2 or 100 mM NaOH 1% CHAPs 20 mM imidazole 2 M NaCl 变性剂 去污剂 还原剂 其他 盐 长期保存 hTNFa Native 16.7 GFP Native 25.4 CAT Native 31.3 T7 RNA Polymerase Native 33.3 GroES Native 25.3 Pyroglutamyl aminopeptidase Native 20.0 Thioredoxin Denaturing 20.3 HIV Protease Denaturing 20.2 Ni-NTA纯化试剂的兼容性 Ni-NTA 可以兼容各类变性剂，还原剂，去垢剂等。表 6 中列出了 Ni-NTA 可以兼容的各种常见试剂。值得一提的是在 10 mM DTT 的存在下利用 Ni-NTA 仍能纯化得到活性蛋白（见图 8） NTC0 mM 1 mM 5 mM 10 mM CM 0 mM 1 mM 5 mM 10 mM DTT 图 8 A 在不同浓度 DTT（0，1，5，10 mM）存在下，利用 Ni-NTA 纯化 6×His-Tagged HIV reverse transcriptase。结果表明，即使在 10 mM DDT 存在下仍能 纯化得到活性蛋白。 B 在不同浓度 DTT（0，1，5，10 mM）存在下，检测 6×His-Tagged HIV reverse transcriptase 的表达水平 Ni-NTA 纯化试剂结构 QIAGEN 专利的 Ni-NTA 纯化填料为 4 价螯合，即镍离子通过 4 价 键螯合在纯化树脂 ( 填料 ) 上，而 Ni-IDA 为 3 价螯合（见图 6）。对比 数据表明，在各种纯化条件下，Ni-NTA 树脂的金属镍离子脱落率最低 ( 见 图 7)。 CH2 O Ni2+ CO CH CO H2O Ni-NTA O OO N CO CH2 Ni 2+ H2O H2O H2O O O N CH2CO CO CH2 H2O Ni-IDA 图 6 Ni-NTA 与 Ni-IDA 结构比较图。Ni-NTA 为 4 价螯合， Ni-IDA 为 3 价螯合。 N ic ke l i n flo w -t hr ou gh (p pb ) Na tiv e bu ffe r De na tur ing bu ffe r, pH 8 De na tur ing bu ffe r, pH 4 .5 Na tiv e b uff er + 1 m M DT T Na tiv e b uff er + 2 m M DT T Na tiv e b uff er + 5 m M DT T 10,000 1000 100 10 1 QIAGEN Supplier G Supplier S Supplier I 图 7 各种纯化试剂的金属镍脱落率比较图。实验测试结果表明，在各种纯化条件下（天然，变性 以及不同浓度 DTT 存在时），QIAGEN 的 Ni-NTA 产品金属镍的脱落率最低。 6×His 标签蛋白表达系统 7 8Sample & Assay Technologies 6×His 标签蛋白表达系统 www.qiagen.com/protein Selected cells expressing protein Cell lysis Pure 6xHis-tagged protein Phosphate buffer, pH 8 300 mM NaCl 10 mM imidazole Ni-NTA resin Bind Wash20 mM imidazole Elute 100–250 mM imidazole 8 M urea or 6 M GuHCl, pH 8 Ni-NTA resin Bind pH 6.3Wash pH 5.9 or pH 4.5 Elute Centrifuge Ni-NTA纯化6×His标签蛋白的实验流程Ni-NTA 纯化 6×His 标签蛋白的实验流程 从 6×His 标签蛋白的纯化流程来看，首先镍离子被螯合到固相支持 物共价结合的反应性基团上，当 6×His 标签蛋白溶液流经亲和纯化介质 时，蛋白被特异亲和吸附，洗掉杂质后再洗脱目标蛋白。在天然条件下 利用 Ni-NTA 纯化 6×His 标签蛋白可以保持其天然结构和活性，获得的 蛋白可直接用于功能检测。在变性条件下进行纯化，蛋白会丧失天然结 构，获得的蛋白可以进行 Western blotting 分析和抗体制备，也可以通 过复性以获得功能蛋白。 6×His 标签蛋白纯化系统 利用 QIAexpress System 体内或 EasyXpress 体外表达 6×His 标签蛋白后，要想获得目标蛋白必须利用 Ni-NTA 纯化试 剂进行纯化，Ni-NTA 蛋白纯化试剂具有以下特点： ■ 灵活性好 — 蛋白可在变性 / 非变性条件下进行纯化 ■ 独特的 Ni-NTA 结构 — 极低的 Ni 离子脱落率 ■ 兼容性好 — 可兼容各类变性剂，还原剂等（如可兼容 10 mM DTT） ■ 纯度高 — 一步纯化即可以得到 95% 纯度的蛋白 ■ 结合能力强 — 蛋白结合量达到 20-40 mg/ml ■ 产品规格多 — 可纯化 ng 级至 kg 级 6×His 标签蛋白 图 9 利用 Ni-NTA Superflow 预装柱（1ml）纯化 6×His-GPF 蛋白。Bradford 测试结果表明 6×His-GPF 的结合量为 55 mg/ml。 M CL FT W E1-4 6×His-GPF Ni-NTA 纯化试剂的结合能力 一般来讲，Ni-NTA 树脂的结合量为 20-40 mg/ml。由于 Ni-NTA 结合能力和蛋白的种类性质相关，对于某些蛋白如 6His-GFP 的结合量甚至大于 55mg/ml（见图 9）。 表 7 Ni-NTA 产品对不同种类蛋白的结合量 6×His标签蛋白 纯化条件 结合量 /ml 树脂 表6 与Ni-NTA可以兼容的常见试剂 6 M Gu·HCl 2% Triton X-100 20 mM β-ME 50% glycerol 4 M MgCl2 Up to 30% ethanol 8 M Urea 2% Tween 20 10 mM DTT 20% ethanol 5 mM CaCl2 or 100 mM NaOH 1% CHAPs 20 mM imidazole 2 M NaCl 变性剂 去污剂 还原剂 其他 盐 长期保存 hTNFa Native 16.7 GFP Native 25.4 CAT Native 31.3 T7 RNA Polymerase Native 33.3 GroES Native 25.3 Pyroglutamyl aminopeptidase Native 20.0 Thioredoxin Denaturing 20.3 HIV Protease Denaturing 20.2 Ni-NTA纯化试剂的兼容性 Ni-NTA 可以兼容各类变性剂，还原剂，去垢剂等。表 6 中列出了 Ni-NTA 可以兼容的各种常见试剂。值得一提的是在 10 mM DTT 的存在下利用 Ni-NTA 仍能纯化得到活性蛋白（见图 8） NTC0 mM 1 mM 5 mM 10 mM CM 0 mM 1 mM 5 mM 10 mM DTT 图 8 A 在不同浓度 DTT（0，1，5，10 mM）存在下，利用 Ni-NTA 纯化 6×His-Tagged HIV reverse transcriptase。结果表明，即使在 10 mM DDT 存在下仍能 纯化得到活性蛋白。 B 在不同浓度 DTT（0，1，5，10 mM）存在下，检测 6×His-Tagged HIV reverse transcriptase 的表达水平 Ni-NTA 纯化试剂结构 QIAGEN 专利的 Ni-NTA 纯化填料为 4 价螯合，即镍离子通过 4 价 键螯合在纯化树脂 ( 填料 ) 上，而 Ni-IDA 为 3 价螯合（见图 6）。对比 数据表明，在各种纯化条件下，Ni-NTA 树脂的金属镍离子脱落率最低 ( 见 图 7)。 CH2 O Ni2+ CO CH CO H2O Ni-NTA O OO N CO CH2 Ni 2+ H2O H2O H2O O O N CH2CO CO CH2 H2O Ni-IDA 图 6 Ni-NTA 与 Ni-IDA 结构比较图。Ni-NTA 为 4 价螯合， Ni-IDA 为 3 价螯合。 N ic ke l i n flo w -t hr ou gh (p pb ) Na tiv e bu ffe r De na tur ing bu ffe r, pH 8 De na tur ing bu ffe r, pH 4 .5 Na tiv e b uff er + 1 m M DT T Na tiv e b uff er + 2 m M DT T Na tiv e b uff er + 5 m M DT T 10,000 1000 100 10 1 QIAGEN Supplier G Supplier S Supplier I 图 7 各种纯化试剂的金属镍脱落率比较图。实验测试结果表明，在各种纯化条件下（天然，变性 以及不同浓度 DTT 存在时），QIAGEN 的 Ni-NTA 产品金属镍的脱落率最低。 6×His 标签蛋白表达系统 7 8Sample & Assay Technologies 6×His 标签蛋白表达系统 www.qiagen.com/protein Selected cells expressing protein Cell lysis Pure 6xHis-tagged protein Phosphate buffer, pH 8 300 mM NaCl 10 mM imidazole Ni-NTA resin Bind Wash20 mM imidazole Elute 100–250 mM imidazole 8 M urea or 6 M GuHCl, pH 8 Ni-NTA resin Bind pH 6.3Wash pH 5.9 or pH 4.5 Elute Centrifuge Ni-NTA纯化6×His标签蛋白的实验流程Ni-NTA 纯化 6×His 标签蛋白的实验流程 从 6×His 标签蛋白的纯化流程来看，首先镍离子被螯合到固相支持 物共价结合的反应性基团上，当 6×His 标签蛋白溶液流经亲和纯化介质 时，蛋白被特异亲和吸附，洗掉杂质后再洗脱目标蛋白。在天然条件下 利用 Ni-NTA 纯化 6×His 标签蛋白可以保持其天然结构和活性，获得的 蛋白可直接用于功能检测。在变性条件下进行纯化，蛋白会丧失天然结 构，获得的蛋白可以进行 Western blotting 分析和抗体制备，也可以通 过复性以获得功能蛋白。 6×His 标签蛋白纯化系统 利用 QIAexpress System 体内或 EasyXpress 体外表达 6×His 标签蛋白后，要想获得目标蛋白必须利用 Ni-NTA 纯化试 剂进行纯化，Ni-NTA 蛋白纯化试剂具有以下特点： ■ 灵活性好 — 蛋白可在变性 / 非变性条件下进行纯化 ■ 独特的 Ni-NTA 结构 — 极低的 Ni 离子脱落率 ■ 兼容性好 — 可兼容各类变性剂，还原剂等（如可兼容 10 mM DTT） ■ 纯度高 — 一步纯化即可以得到 95% 纯度的蛋白 ■ 结合能力强 — 蛋白结合量达到 20-40 mg/ml ■ 产品规格多 — 可纯化 ng 级至 kg 级 6×His 标签蛋白 图 9 利用 Ni-NTA Superflow 预装柱（1ml）纯化 6×His-GPF 蛋白。Bradford 测试结果表明 6×His-GPF 的结合量为 55 mg/ml。 M CL FT W E1-4 6×His-GPF Ni-NTA纯化6×His标签蛋白的纯度 Ni-NTA 带来的高纯度蛋白基于两大技术优势： ■ 对 Ni-NTA 与基质之间的结合距离进行优化，减少了非特异性蛋白的结合 ■ 独特的 4 价螯合最大程度防止镍离子的脱落，降低了由此带来的空位点与污染蛋白的结合 基于上述优势， Ni-NTA 高特异性的结合 6×His 标签蛋白（见图 10），并且实际应用中一步纯化获得的蛋白纯度一般在 95% 以上（见表 8）。 更多对比数据，请参见 http://www1.qiagen.