三种可聚合季铵盐单体对口腔病原菌的抗菌活性

基金项目 :国家自然科学基金 (编号 : 30772444) ;军队“十一五 ”科技攻 关计划 (编号 : 06MA222) ;第四军医大学博士学位论文课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 资助 (编号 : 2006. 12) 作者单位 :西安第四军医大学口腔医学院修复科 　710032 (肖玉鸿 　陈 吉华　沈丽娟　方明　王辉　王迎捷 ) 　北京清华大学化工 系高分子研究所 (邢晓东 ) 通讯作者 :陈吉华　E2mail: jhchen@ fmmu. edu. cn 三种可聚合季铵盐单体对口腔病原菌的抗菌活性 肖玉鸿 　陈吉华 　沈丽娟 　方明 　邢晓东 　王辉 　王迎捷 【摘要 】　目的 :比较自行合成的 3种可聚合季铵盐单体对口腔常见致病菌的抗菌活性及抗菌时效性。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 : 采用液体稀释法比较季铵盐单体对 4种口腔常见致病菌的抗菌活性 ,以抗菌性能最佳的单体进行杀菌动力 学研究。结果 : 3种季铵盐单体对 4种口腔致病菌均 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现出一定的抗菌活性 ,其中 DMAE2CB抗菌效果优于 另外 2种单体 ,该单体在浓度 19. 2μg/m l (4倍 MBC值 )时接触 5 m in, 99. 889%的变形链球菌被杀灭 ;接触 10 m in,即可杀灭所有细菌。结论 : 3种抗菌单体对口腔常见致病菌均具有不同程度的抗菌活性 , DMAE2CB 具有进一步应用于牙科抗菌修复 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 的前景。 【关键词 】　季铵盐 ; 口腔致病菌 ; 抗菌活性 ; 单体 The an tibacter ia l effects of three polym er izable qua ternary amm on ium sa lt m onom ers on o2 ra l pa thogen ic bacter ia X IAO Yuhong1 , CHEN J ihua1 , SHEN L ijuan1 , FANG M ing1 , X I N G X iaodong2 , WAN G Hui1 , WAN G Ying jie1. 1. D epartm en t of P rosthodon tics, School of S tom a tology, The Fourth M ilitary M ed i2 ca l U niversity, X i’an 710032, Ch ina; 2. D epartm en t of Chem ica l Eng ineering, Tsinghua U n iversity, B eijing 100084, Ch ina 【Abstract】O bjective: To compare the antibacterial activities of three polymerizable quaternary ammonium salt monomers on oral pathogenic bacteria, furthermore to investigate the time2kill kinetics of the monomer to S. m utans. M ethods: The antibacterial activities of the monomers were investigated by using the broth dilution test on oral path2 ogenic bacteria. The most effective monomer was further tested for time2kill kinetics. Results: The tested bacteria were all suscep tible to the three monomers. DMAE2CB exhibited the lowest M ICs ranging from 1. 2μg/m l to 4. 8 μg/m l. Time2kill curve showed that DMAE2CB gave 99. 44% killing rate at 19. 2μg/m l(43 MBC) against S. m u2 tans after 1 m in and 100% killing rate within 10 m in. Conclusion: Three quaternary ammonium salt monomers have different antibacterial activities on oral pathogenic bacteria. These data indicate that DMAE2CB may be a candidate antibacterial agent for oral infectious diseases. 【Key words】　Q ua ternary amm on ium sa lt; O ra l pa thogen ic bacteria; A n tibacteria l effect; M ono2 m er 中图分类号 : R783. 1　文献标识码 : A　文章编号 : 100123733 (2008) 20220189204 　　利用载银、铜、锌等无机抗菌剂研制的抗菌材料具 有抗菌谱广、毒性低、不产生耐药性、化学稳定性好等 优点 ,但银等易氧化、易变色、不宜用于浅色材料 ,且无 机抗菌剂在材料中混合难以均匀 ,与材料基质的结合 方式有待继续研究等问题而限制了它的研究发展 [ 1 ]。 为了克服上述缺点 ,人们尝试人工合成可聚合的 抗菌高分子单体 ,以期将抗菌功能基团通过化学键的 形式牢固键合在树脂基质中 ,从而赋予该类材料快速 持久杀菌、均匀分散、良好色泽等优点 [ 2 ]。同时因可 聚合抗菌单体与基质单体间为化学结合 ,因此克服了 普通有机抗菌剂热稳定性差、容易分解溶出、分解产物 有毒等缺点。 但是 ,国际上到目前为止该类单体的唯一成功报 道是 Imazato等 [ 3 - 5 ]合成的甲基丙烯酰氧十二烷基溴 吡啶 (MDPB )。因此 ,研发品种更多、选择多样、效能 ·981·实用口腔医学杂志 (J Pract Stomatol) 2008 Mar, 24 (2) 更优的牙科可聚合抗菌单体具有重要的理论与临床意 义。本文即比较了自行合成的 3种可聚合季铵盐单体 对常见口腔病原菌的抗菌活性 ,研究了抗菌性能最佳 的单体的杀菌效应 ,初步评估可聚合季铵盐单体应用 于牙科抗菌材料的前景。 1　材料与方法 1. 1　实验材料和仪器 1. 1. 1　季铵盐抗菌单体 　本实验采用的抗菌单体为 自行合成的 3种可聚合季铵盐单体 ,分别名为 :甲基丙 烯酰氧乙基 -苄基 -二甲基氯化铵 (methacryloxylethyl benzyl dimethyl ammonium chloride, DMAE2BC ) ,甲基 丙烯酰氧乙基 -正十六烷基 - 二甲基氯化铵 (methac2 ryloxylethyl cetyl dimethyl ammonium chloride, DMAE2 CB) , 甲基丙烯酰氧乙基 - 邻氯苄基 - 二甲基氯化铵 (methacryloxylethyl m2chloro benzyl dimethyl ammonium chloride, DMAE2m2CBC)。结构式如图 1,有关详细合 成方法及表征结果已另文报道 [ 6 ]。 　　　　　　　DMAE2BC　　　　　　　　　　　　　DMAE2CB　　　　　　　　　　　　　　DMAE2m2CBC 图 1　3种季铵盐抗菌单体的分子结构 Fig 1　Structures of three quaternary ammonium salt antibacterial monomers 1. 1. 2　实验菌株 　变形链球菌 ATCC 25175,黏性放 线菌 ATCC 15987,金黄色葡萄球菌 ATCC 29213,乳酸 杆菌 ATCC393,由第四军医大学口腔医院检验科提 供。 1. 1. 3　实验器材 　微量加样器 (N ichikyo,日本 ) ,超 净工作台 (上海净化设备厂 ) ,培养箱 (DY21型 ,浙江 义乌冷冻机械厂 ) , XW 280A漩涡混合器 (江苏海门市 麒麟医用仪器厂 ) , V itek细菌比浊仪 (法国生物梅里 埃公司 ) ,胎牛血清 ( Gibco, 美国 ) ,脑心浸液培养基 (BH I, D ifco, 美国 ) , BH I平板。 1. 2　实验方法 1. 2. 1　最低抑菌浓度 (m inimal inhibitory concentra2 tion, M IC)及最低杀菌浓度 (m inimal bactericidal con2 centration, MBC)测定 　以液体稀释法测定 3 种季铵 盐抗菌单体对 4种常见口腔致病菌的抗菌活性。根据 预实验结果 ,以 BH I液体培养基为溶剂 , DMAE2BC, DMAE2m2CBC和 DMAE2CB原液的初始浓度分别确定 为 100、100、5 mg/m l,连续倍比稀释备用。实验菌株 隔夜培养后用 V itek细菌比浊仪调整菌液浓度至 1 × 107 CFU /m l。每个试管中加入抗菌单体溶液 1 m l、菌 液 100μl。变形链球菌、粘性放线菌、乳酸杆菌培养管 置于 37 ℃、50 m l/L CO2、50 m l/L N2 培养箱中培养 24 ～48 h。金黄色葡萄球菌培养管置于 37 ℃空气培养 箱中培养 18～24 h。试管内培养液显清亮的抗菌单体 最低浓度为该抗菌单体的最低抑菌浓度 (M IC)。接种 环挑取清亮试管中的培养物 ,划线接种于 BH I琼脂平 板上 ,孵育 48 h,无细菌生长的最低抗菌单体浓度为该 抗菌单体的最低杀菌浓度 (MBC)。以上步骤重复 3 次。同时设立阴、阳性对照。阳性对照即不加各种抗 菌单体 ,只加入标化的菌悬液和等量 BH I液体培养 基。阴性对照即不加菌液 ,只加各种抗菌单体和等量 BH I液体培养基。 1. 2. 2　单体抗菌动力学 　以 1. 2. 1实验结果为依据 , 选择抗菌活性最强的 DMAE2CB 测定杀菌曲线。以 BH I液体培养基为溶剂配制浓度分别为 4. 8μg/m l (1 倍 MBC值 ) , 9. 6μg/m l (2 倍 MBC值 ) , 19. 2μg/m l (4倍 MBC值 )的 DMAE2CB溶液 ,变形链球菌 ATCC 25175隔夜培养后加入上述各浓度的抗菌单体溶液 中 ,调整菌液浓度为 1 ×107 CFU /m l。充分混合后于 37 ℃、160 r/m in条件下培养 ,于 1、5、10、30、60、90、 120、360 m in后取样并稀释 ,平板计数法计其活菌数 , 绘出该单体各浓度下的存活细菌的对数值 - 时间曲 线。无抗菌单体的 BH I液体培养基作为对照。上述 步骤重复 3次。 1. 3　统计分析 采用 SPSS11. 0统计软件对各抗菌单体的 M IC值 进行方差分析以及 LSD检验 (α = 0. 05)。 2　结 　果 2. 1　体外敏感实验 各抗菌单体对 4种口腔致病菌的 M IC /MBC值见 表 1。在 3种抗菌单体中 , DMAE2CB表现出最强的抗 ·091· 实用口腔医学杂志 (J Pract Stomatol) 2008 Mar, 24 (2) 菌活性 ,对 4 种口腔致病菌的 M IC值介于 1. 2～4. 8 μg/m l,而 DMAE2BC与 DMAE2m2CBC两者的 M IC值 之间没有显著性差异 ( P > 0. 05) ,两者的 M IC值显著大于 DMAE2CB的 M IC值 ( P < 0. 05)。 表 1　3种季铵盐抗菌单体对口腔病原菌的 M IC /MBC值 Tab 1　M IC and MBC values of quaternary ammonium salt monomers for oral pathogenic bacteria 实验菌株 M IC3 and MBC (μg/m l) DMAE2BC DMAE2mCBC DMAE2CB 变形链球菌 ATCC 25175 1562. 5a (6250. 0) 1562. 5a (3125. 0) 2. 4b (4. 8) 粘性放线菌 ATCC 15987 3125. 0a (3125. 0) 1562. 5a (1562. 5) 4. 8b (9. 6) 金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 1562. 5a (6250. 0) 1562. 5a (3125. 0) 1. 2b (2. 4) 乳酸杆菌 ATCC 393 1562. 5a (1562. 5) 3125. 0a (3125. 0) 2. 4b (9. 6)3 含相同小写字母的组间无显著性差异 ( P > 0. 05) ,括号内为 MBC值 2. 2　单体抗菌动力学 3种不同浓度的 DMAE2CB 溶液对变形链球菌 ATCC 25175的杀菌曲线如图 2。从图中可以看出 ,抗 菌单体溶液浓度为 19. 2μg/m l ( 4倍 MBC)时 ,接触 1 m in后存活的细菌数为 5. 6 ×104 CFU /m l,即杀灭了 99. 44% (5. 6 ×104 /1 ×107 )的细菌 ,而接触 5 m in后 , 仅有 1. 11 ×104 CFU /m l的细菌存活 ,即 99. 889% (1. 11 ×104 /1 ×107 )的细菌被杀灭 ,在 10 m in混合培 养后 ,未检测到存活细菌。较低浓度的单体溶液则表 现出相对缓慢的杀菌动力学 , 9. 6μg /m l的 DMAE2CB 即使在 60 m in的混合培养后 ,仍有 260 CFU /m l的细 菌存活 ,而浓度为 4. 8μg/m l时 , 360 m in以后存活细 菌数为 350 CFU /m l。 [ (13 MBC (●) , 23 MBC (■) , 43 MBC (▲)代表 DMAE2CB 溶液浓度分别为 1、2、4倍 MBC值 ] 图 2　3种不同浓度 DMAE2CB溶液对变形链球菌杀菌曲线 Fig 2　Time2kill curves of DMAE2CB at the concentrations of 13 MBC (●) , 23 MBC (■) , 43 MBC (▲) against S. m u2 tans 3　讨 　论 季铵类化合物被人们认识已经有 100 多年的历 史。早在 1915年 , Jacobs等就报道合成了季铵盐类消 毒剂 ,并作了杀菌的研究 ,指出该类消毒剂具有一定的 杀菌能力 ,翻开了铵盐类消毒的历史篇章 ,然而一直没 有被人们所重视。直到 1935年 ,德国 Domagk研究了 这类消毒剂的杀菌性能及化学结构与抑菌的关系 ,引 起人们极大的兴趣。同年 W etzel即用于临床消毒实 践 [ 7 ]。相比于其他抗菌剂而言 ,季铵盐渗透性良好、 低毒、性能稳定、皮肤刺激轻、低腐蚀以及具有长期的 生物学效应 ,从而被广泛应用于涂料、水处理、纺织以 及食品工业等 ,但在口腔生物材料的研究中却鲜见应 用季铵盐的研究报道。按照季铵盐类开发的历程 ,目 前已分成至少 7代产品 ,可聚合的季铵盐为第 6代季 铵盐 ,其主要特点为毒性更小 ,杀菌作用更为温和 ,比 上几代产品弱。主要体现其药用价值 ,如角膜接触镜 和个人护理用品的抗菌 [ 8 ]。 本研究中的 3种可聚合季铵盐单体分子结构一端 为可与牙科常用单体聚合的甲基丙烯酸酯基团 ,另一 端为可发挥抗菌作用的功能基团 ,包括荷正电的 N + 和位于侧链的苯环、间氯苯环或长链烷基等 2 部分。 研究发现 3种单体均表现出抗菌活性 ,其中以 DMAE2 CB的抗菌效果最好 ,其对 4 种口腔病原菌的 MBC值 介于 2. 4～9. 6μg/m l之间 ,远小于另外 2种季铵盐单 体的 MBC值 (1 562. 5～6 250. 0μg/m l)。导致上述单 体之间抗菌性能差异的原因可能在于它们之间不同的 分子结构以及烷基链长。有研究证实 ,随着两性化合 物中烷基链长的增加 ,如烷基链长增加到 14 个 C原 子时 ,其与细胞壁脂质双分子层的疏水性反应增加 ,从 而提高了化合物的抗菌活性 [ 7 ]。DMAE2BC与 DMAE2 m2CBC两者具有相同的碳链长度 ,分子结构中只是以 邻氯苯甲基取代了苯甲基 ,因此两者的抗菌活性没有 显著差异 ,而 DMAE2CB含有的碳链长度为 C16 ,所以 具有比前两者更强的抗菌活性。 ·191·实用口腔医学杂志 (J Pract Stomatol) 2008 Mar, 24 (2) 不同抗菌药物浓度的杀菌速度是药物杀菌作用的 一个重要参数。本研究中具有最小 MBC值的单体 DMAE2CB被进一步应用于杀菌动力学研究。结果表 明 : 3种不同浓度的 DMAE2CB溶液对变形链球菌均表 现出了快速的杀菌作用。浓度在 19. 2μg/m l ( 4 倍 MBC值 )时接触 5 m in, 99. 889%的细菌被杀灭 ;接触 10 m in,即可杀灭所有细菌。该结果与单体 MDPB的 杀菌动力学类似 , 250μg/m l ( 4 倍 MBC值 )的 MDPB 在 5 m in内即可杀灭 99. 999%的变形链球菌 [ 3 ]。如前 所述 , DMAE2CB含有 C16的烷基链 ,而 MDPB的烷基链 只含有 C12 ,因此 DMAE2CB在较低 MBC值时即可能 具有与 MDPB相似的杀菌动力学。 目前 ,季铵盐型抗菌单体的抗菌机制 ,即其抗菌作 用是基于杀菌还是抑菌 ,尚未有定论或直接的证据。 有学者认为高分子材料的抗菌作用基于阳离子固定机 制 [ 9 ] :细胞壁和细胞膜由磷脂双分子层组成 ,在中性 条件下带负电荷。因此 ,细菌容易被抗菌材料上的阳 离子 (如季铵盐基团 )所吸引 ,从而降低细菌的活动能 力 ,抑制其呼吸功能 ,使其发生“接触死亡 ”。另外 ,细 菌在电场引力的作用下 ,细胞壁和细胞膜上的负电荷 分布不均匀造成变形 ,发生物理性破裂 ,使胞内容物泄 漏 ,发生“溶菌 ”现象而死亡。 因此 ,尽管本研究证实了自行合成的 3 种季铵盐 单体对口腔常见致病菌具有良好的抗菌活性 ,但其抗 菌机制及基于此类单体的牙科抗菌修复材料的各项性 能仍有待进一步研究。 参 考 文 献 [ 1 ]　FangM , Chen JH, Xu XL, et al. 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