几种季铵盐阳离子表面活性剂对核盘菌的抗菌活性

农药学学报 � 2008, 10( 1): 99�104 C hine se Journa l o f P esticide Sc ience �研究论文 � 几种季铵盐阳离子表面活性剂对核盘菌的抗菌活性 于 � 婷, � 尚玉珂, � 石怀兴, � 慕 � 卫, � 刘 � 峰* (山东农业大学 植物保护学院,山东 泰安 271018) 摘 � 要:采用菌丝生长速率法测定了 5种阳离子表面活性剂对从染病黄瓜植株上分离的核盘菌 Sc lero tin ia sclero tio rum 菌丝生长的毒力,及其对菌丝形态、生物量、菌核形成及萌发和菌体细胞膜 透性的影响。结果表明, 十二烷基苄基二甲基氯化铵抑制菌丝生长的毒力较高, EC50值为 3. 92 �g /mL, 与杀菌剂乙霉威毒力相当;经阳离子表面活性剂处理后, 菌丝粗壮且呈念珠状;随药 剂浓度的增大,菌丝生长受抑制的程度增加,菌丝生物量降低率可达 90%以上;在阳离子表面活性 剂的作用下,菌核的数量与空白对照相比有所减少,但质量略有增加,而腐霉利处理菌核数量无明 显变化,但质量明显减少; 5种阳离子表面活性剂在 10 000 �g /mL浓度下均不能完全抑制菌核萌 发,而对照药剂腐霉利和嘧霉胺在 200 �g /mL即可完全抑制菌核萌发。 关键词:阳离子表面活性剂;核盘菌; 菌丝生长;毒力;菌核萌发;细胞膜透性 中图分类号: S482. 2; TQ 423. 121� � � � 文献标志码: A � � � � 文章编号: 1008�7303( 2008) 01�0099�06 AntifungalActivity of Cationic Surfactants Quarternary Ammonium Salt on Sclerotinia sclerotiorum YU T ing, � SHANG Y u�ke, � SH IHua i�x ing, � MU W e,i � L IU Feng* (Co llege o f P lant P ro tection, Shandong Ag r icultura l Univer sity, T a i an 271018, Shandong P rovince, Ch ina ) Abstract: The inhibition act iv ity onm ycelium grow th o f 5 cation ic surfactan ts and 3 fung ic ides aga in st Sc lero tin ia sclero tio rum ( L ib. ) de B ary w ere de term ined by m ycelium grow th ra te me thod in lab. And their ef fec ts on the pathogen s m yce lium shape, sc lero tium fo rm at ion, sc lero t ium germ ination, dry w e ight o f myce lium andm em brane o smo tic po tent ia lw ere a lso stud ied. The results show ed tha t dodecy l d im ethy l benzy l amm onium ch lo ride had the strongest inhibitory effect on myce lia g row th, its EC50 va lue w as 3. 92 �g /mL, w h ich w as sim ilar w ith fung icide d ietho fencarb. A fter treated w ith cationic surfactants, the myce lia became stout and had m onilifo rm appearance. A s the concentration of the ca tion ic surfactan ts increased, the inhibito ry effect on the g row th and the dry w e ight o f m yce lium becam e stronger, and the m yce lium s dry w e ight reduced mo re than 90%. And the sc lero t ium numbers decreased compared w ith that of the contro ,l how ever the w eight increa sed slightly. In con tras,t af ter treatm ent w ith pro cym idone, the sclero tium num bers had no v isible change but the w e ight decrea sed greatly. The 5 cationic surfactants ev en at the concentration o f 10 000 �g /mL cou ld no t restra in the sclero tium germ ination comp lete ly, but the fung icides of pro cym idone and py rime tham l cou ld restra in it at the concentration of 200 �g /mL. Key words: cationic surfactants; Sclero tin ia sclero tio rum ( L ib ) de B ary; m ycelium g row th; b ioactiv ity; sc lero tium germ ination; mem brane o smo t ic po tentia l � 收稿日期: 2007�10�22;修回日期: 2008�01�16. � 作者简介:于婷 ( 1982�) ,女,山东潍坊人,硕士研究生, * 通讯作者 ( Au thor for correspond ence) :刘峰 ( 1970�), 男,山东沂水人, 博士,副教授, 主要从事农药制剂学和农药毒理学研究.联系电话: 0538�8242611; E�m ai:l f liu@ sdau. edu. cn � 基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD 08A03 ). � � 黄瓜菌核病由与油菜菌核病菌同属的 Sclero tinia sclero tio rum 引起 [ 1 ]。其致病菌核盘菌 S. sc lero tio rum ( L ib) de B ary先在寄主表面或内部 生长白色菌丝体,然后形成许多黑色、鼠粪状的菌 核, 可在土壤中长期休眠, 当条件 (温度、湿度 )适 宜时每个菌核能长出一个或多个有柄的子囊盘, 散发的子囊孢子由气流传播构成初侵染和再侵 染, 造成茎腐、叶腐、花腐、果腐等症状 [ 2]。目前生 产上尚缺乏抗病的黄瓜品种, 一旦发病, 用常规杀 菌剂防治效果也不理想,一般会减产 50% ~ 60%, 甚至绝收, 因此迫切需要开发新的药剂及防治手 段。 季铵盐阳离子表面活性剂目前在我国主要用 于工业杀菌、灭藻及卫生消毒 [ 3, 4] , 其防治对象主 要为细菌, 而在防治植物病害方面的应用尚不多 见。在国外, 此类表面活性剂主要用于农业操作 器械、运输工具、工装的表面消毒, 以减少病菌扩 散和传播, 如澳大利亚和南非使用 ! farm cleanse∀ (有效成分为季铵盐阳离子化合物 )消毒器具有效 降低了香蕉枯萎病的传播 [ 5, 6 ] ; 国内登记使用十二 烷基苄基二甲基氯化铵防治果树叶部病害 [ 7] , 陈 召亮等报道了季铵盐阳离子表面活性剂对番茄灰 霉病菌 Bo trytis cinerea 的抗菌活性 [ 8 ]。由于阳离 子表面活性剂对人畜毒性低, 环境相容性好, 因此 有必要开展其防治植物病害的研究。笔者以常规 杀菌剂腐霉利、嘧霉胺等作对比,测定了几种阳离 子表面活性剂对核盘菌的抗菌活性及对菌体生物 学特性的影响, 以便为评价该类药剂防治蔬菜病 害的应用潜力提供依据。 1� 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1. 1� 供试材料 1. 1. 1� 供试病原菌 � 核盘菌 S. sclero tio rum 自山 东省泰安市郊区蔬菜日光温室发病植株上分离纯 化, 在 4# 冰箱中保存。 1. 1. 2� 药剂和仪器 � 45%十二烷基苄基二甲基 氯化铵 (以下简称 1227)、45%十四烷基二甲基苄 基氯化铵 (以下简称 1427)、46. 5%双八 /十烷基 二甲基季铵盐 (以下简称 C8�10) (均为山东省枣 庄市中区泰和化工厂提供 ) ; 50% 31503、50% 31551( G em in i季铵盐, 前者为双十二烷基双季铵 盐, 后者为双十二烷基三季铵盐,均为河南省道纯 化工技术有限公司提供 ) ; 95%嘧霉胺 ( py rime thanil) 原药 (江苏常州市丰登农药厂 ) ; 95. 5% 乙霉威 ( d ietho fencarb)原药 (江苏苏化集团新沂农药厂 ) ; 95%腐霉利 ( pro cym idone)原药 (日本住友化学工 业株式会社 )。 DD S�11A电导率仪,上海雷磁仪器厂; SW �C J� 1D型超净工作台, 苏净集团苏州安泰空气技术有 限公司。 1. 2� 研究方法 1. 2. 1� 供试药剂母液的配制 � 质量分数为 1%的 嘧霉胺、乙霉威、腐霉利水悬浮剂母液 ( 100 g )均 按以下方法配制: 在原药 (嘧霉胺 1. 05 g, 乙霉威 1. 05 g,腐霉利 1. 02 g )中加入 1602﹟ 2. 00 g、农乳 500﹟ 1. 00 g、黄原胶 0. 2 g、乙二醇 3 g, 余量加去 离子水, 湿法研磨 1 h即得 1%水悬浮剂母液, 然 后将各母液稀释成所需浓度备用。 1227、C8�10、 1427、31551、31503均为水溶性药剂, 直接用灭菌 去离子水稀释备用。 1. 2. 2� 药剂对菌丝生长的影响 � 采用菌丝生长 速率法。在预备试验的基础上, 无菌条件下选择 各药剂对病菌菌丝生长抑制率在 10%~ 90%范围 内的 5个系列浓度, 制成含药培养基。将菌饼菌 丝面朝下接种到含药平板中央, 每处理设 3次重 复,置于 ( 25 ∃ 1 ) # 下培养 72 h, 用十字交叉法测 量菌落直径, 计算抑制率。所得数据用 DPS统计 软件求出毒力回归方程及 EC50值和 EC90值 [ 8, 9]。 1. 2. 3� 药剂对菌丝形态的影响 � 在 1. 2. 2节试 验的基础上, 挑取经不同浓度药剂处理的菌丝制 成玻片, 在显微镜下观察菌丝形态。 1. 2. 4� 药剂对菌核形成及单重的影响 � 在 1. 2. 2节 试验的基础上观察各药剂对菌核形成的影响。同 时选择各药剂的 EC50和 EC90浓度进行皿内抑制培 养处理, 至各培养皿菌丝不再快速生长、产生黑褐 色菌核为止, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 菌核数量,并称量菌核单重 [ 9 ]。 1. 2. 5� 药剂对菌核萌发的影响 � 将黄瓜菌核病 菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂 ( PDA )培养基上, 25# 培养 15 d, 待菌核开始变褐时收集大小一致 的菌核, 置于铺有灭菌滤纸的无菌培养皿中,滴加 少量的灭菌水保湿培养, 至菌核完全变褐成熟, 菌 丝全部死亡。 在上述试验基础上, 根据药剂 EC50值设计并 配制各药剂系列浓度, 将菌核浸渍于药液中 30 s, 风干后置于 PDA培养基平板上; 将未用药液处理 100 农 � 药 � 学 � 学 � 报 Vo .l 10 过的菌核置于含有上述系列浓度药剂的 PDA平板 上。25# 恒温培养,统计比较两种处理的菌核萌发 率, 测出抑制萌发的最低浓度。试验重复 3次, 每 重复测定 10个菌核 [ 9]。 1. 2. 6� 药剂对菌丝干重的影响 � 将供试药剂加 入灭菌 PD培养液 (马铃薯 200 g, 葡萄糖 20 g, 去 离子水 1 000 mL )中, 配成与 1. 2. 2节系列浓度相 同的含药培养液。将直径为 8 mm的菌饼接种到 100mL含药培养液中, 每瓶接种 6块菌饼,每处理 重复 3次, 以加等体积无菌水的培养液为对照。 25# 、120 r /m in摇床培养 3 d, 真空抽滤滤出菌 丝,用双蒸水冲洗 3次, 去除菌饼, 将菌丝置于 80# 烘箱中烘干 2 h, 称量菌丝干重, 计算药剂对 菌丝干重的抑制率。 菌丝干重抑制率 (% ) =对照菌丝干重 ( g) -处理菌丝干重 ( g)对照菌丝干重 ( g) % 100 1. 2. 7� 药剂对菌丝体细胞膜渗透势的影响 � 将 供试菌置于 PDA平板上, 25# 下培养 5 d, 在菌落 边缘制取直径为 4 mm 的菌饼分别接入 PD培养 液中, 120 r /m in振荡培养 2 d后取菌丝备用。新 鲜菌丝用重蒸水冲洗, 真空抽滤后称取菌丝鲜重 0. 2 g放入锥形瓶中,分别加入用 25mL 重蒸水稀 释的系列浓度药液。 25# 下恒温水浴中振荡 ( 120 r/m in) 不同时间后, 用电导仪测定电导率。 以菌丝加重蒸水为对照。同时测定各药剂分别在 0、2. 5、5、10、15、60 m in时的电导率 [ 10 ]。 2� 结果与分析 2. 1� 阳离子表面活性剂对菌丝生长的影响 六种阳离子表面活性剂和 3种杀菌剂对核盘 菌菌丝生长抑制作用的毒力测定结果 (表 1 )表 明, 1227抑制菌丝生长的毒力较高, 其 EC 50值为 3. 92 �g /mL, 与对照药剂乙霉威的毒力 ( EC50值为 4. 15 �g /mL )相当, 其次是 C8�10, 而 31551的毒 力最低。 表 1� 阳离子表面活性剂对核盘菌菌丝生长的抑制作用 Table 1� Inh ib it ion to x icity on myce lium grow th o f S. sclero tio rum by ca tionic surfac tants 处理 T rea tm en t 毒力回归方程 T ox icity reg resssion equ ation EC 50 ( 95% CL ) / ( �g /m L ) EC 90 ( 95% CL ) / ( �g /mL ) 1227 Y = 4. 096+ 1. 532x 3. 92( 2. 54~ 5. 43) 27. 79 ( 1 9. 10~ 48. 30 ) 1427 Y = 2. 497+ 2. 169x 14. 61( 11. 31~ 18. 18) 62. 31 ( 45. 44~ 101. 5 7) C 8�10 Y = 2. 853+ 2. 227x 9. 33( 7. 52~ 11. 49) 34. 86 ( 2 5. 71~ 54. 96 ) 31503 Y = 1. 707+ 2. 586x 18. 68( 15. 65~ 22. 27) 61. 45 ( 4 7. 29~ 89. 50 ) 31551 Y = �1. 506+ 2. 784x 211. 74( 179. 62~ 252. 30) 644. 98 ( 49 6. 25~ 940. 51) 乙霉威 D iethofencarb Y = 3. 827+ 1. 966x 4. 15( 3. 33~ 5. 27) 19. 60 ( 1 3. 73~ 32. 25 ) 腐霉利 P rocym idone Y = 6. 137+ 1. 749x 0. 21( 0. 15~ 0. 27) 0. 99 ( 0. 76~ 1. 39 ) 嘧霉胺 Pyrim ethan il Y = 5. 300+ 1. 907x 0. 73( 0. 55~ 0. 86) 1. 53 ( 1. 37~ 1. 75 ) 2. 2� 阳离子表面活性剂对菌丝形态的影响 核盘菌经 1227处理后菌丝形态发生了明显变 化。抑制率在 30%以下时, 菌丝细长而且稀疏; 当 抑制率达到 50% 时, 菌丝变得密集; 抑制率在 70%以上时, 菌丝生长缓慢, 并且短而粗壮。当抑 制率达到 90%时, 菌丝顺菌饼向上生长, 不再在带 毒培养基表面上扩展, 并在短时间内产生菌核。 显微镜观查结果见图 1。清水对照菌丝较细, 并且 较平直。在 1227浓度为 2 �g /mL时, 菌丝形态发 生畸形,菌丝开始增粗, 分枝增多并有膨胀现象; 随药剂浓度的增大, 菌丝生长受抑制的程度也逐 渐增加, 在 40 �g /mL 浓度下, 菌丝节间明显变 短,在隔膜处缢缩,节中间膨大, 呈念珠状。 2. 3� 阳离子表面活性剂对菌丝体生物量的影响 选用毒力较高的前 5种阳离子表面活性剂和 对照药剂乙霉威进行试验, 结果见表 2, 随药剂浓 度的增大, 菌丝干重逐渐降低, 在相同浓度下, 对 菌丝干重的抑制率比对菌丝生长的抑制率要稍 大,这表明在液体培养基中, 菌丝体与药剂的接触 比在固体培养基中更充分, 使药剂的毒性得以更 充分发挥。 2. 4� 阳离子表面活性剂对菌核形成及单重的影响 经药剂处理后, 当核盘菌的菌丝生长抑制率 在 90%以下时, 菌丝沿培养基生长, 直到不能继续 101N o. 1 于 � 婷等: 几种季铵盐阳离子表面活性剂对核盘菌的抗菌活性 扩展时开始纠结成菌核; 当抑制率在 90%以上时, 菌饼边缘刚长出菌丝即纠结成菌核。清水对照平 均每培养皿生长 12个菌核, 菌核平均单重为 9. 2 m g;经 EC50浓度的表面活性剂处理后, 菌核的 数量有所减少, 单重平均大于 10 m g, 与清水对照 相比略有增加;而对照药剂乙霉威、腐霉利和嘧霉 胺处理的菌核数量无明显变化, 平均单重明显减 小 (图 2)。经各药剂 EC90浓度处理后, 菌核数目 有所减少, 但菌核单重与 EC50浓度处理的基本一 致 (图 3)。 31551由于效果较差, 数据未列出, 以 下实验同。 图 1� 1227处理对菌丝形态的影响 Fig. 1� E ffect o f dodecy l dim ethy l benzy l ammon ium ch lo ride on sclero tium myce lium shape o f S. sclero tio rum A,对照 C ontro ;l B, 2 � g /m L; C, 10 �g /mL; D, 40 �g /m L 表 2� 阳离子表面活性剂对菌丝体生物量的影响 Table 2� E ffect o f ca tion ic surfactants on b iom ass o f m ycelium o f S. sclero tio rum 处理 T reatm en t 5 �g /mL 10 �g /m L 20 �g /m L 单位菌丝干重 D ry w eight of m ycel ium /m g 抑制率 Inh ib ition rate ( ∃ SD, % ) 单位菌丝干重 D ry w eigh t of m yce lium /m g 抑制率 Inh ib ition rate ( ∃ SD, % ) 单位菌丝干重 D ry w eigh t o f m ycelium /m g 抑制率 Inh ib it ion rate ( ∃ SD , % ) 1227 58. 33 57. 07( ∃ 0. 22 ) 40. 5 7 70. 15 ( ∃ 0. 29 ) 12. 12 91. 09( ∃ 0. 35 ) 14 27 112. 47 17. 29( ∃ 0. 11 ) 75. 8 1 44. 22 ( ∃ 0. 13 ) 32. 65 75. 98 ( ∃ 0. 19) C 8�10 100. 15 26. 34( ∃ 0. 18 ) 53. 1 5 60. 89 ( ∃ 0. 24 ) 14. 44 89. 38 ( ∃ 0. 26) 31503 127. 45 6. 26( ∃ 0. 09 ) 89. 3 4 34. 27 ( ∃ 0. 18 ) 64. 98 52. 19 ( ∃ 0. 17) 乙霉威 D iethofencarb 58. 91 56. 66( ∃ 0. 17 ) 42. 5 3 68. 71 ( ∃ 0. 21 ) 12. 56 90. 76 ( ∃ 0. 28) CK 135. 95 � 135. 9 5 � 135. 95 � 2. 5� 阳离子表面活性剂对菌核萌发的影响 选用浸渍法和毒皿法处理。菌核在经各阳离 子表面活性剂和对照杀菌剂 10 000 �g /mL 浸渍 处理后, 萌发率均在 100%。经毒皿法处理后 (图 4) , 虽然随表面活性剂浓度的提高, 萌发率有 所降低,但仍无法全部抑制。而对照药剂腐霉利 和嘧霉胺在 200 �g /mL即可完全抑制菌核萌发, 乙霉威在 10 000 �g /mL时才能完全抑制。 2. 6� 阳离子表面活性剂对菌丝体细胞膜透性的 影响 选择毒力较高的 1227和 C8�10供试, 对照药 剂为腐霉利。结果 (图 5)表明, 随药剂浓度的增 加,电导率逐渐升高。在前 10m in内,电导率随时 间的延长而增加, 且在前 5 m in内增加较为明显。 这 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 高浓度药剂对菌丝细胞膜产生的破坏作用 强,并随时间的延长,电解质不断渗出,在前 5 m in 内电解质渗出速度最快。 102 农 � 药 � 学 � 学 � 报 Vo .l 10 3� 结论及讨论 核盘菌寄主范围广, 可侵染黄瓜、番茄、莴苣、 芹菜、油菜等多种蔬菜及大田作物。其所产生的 菌核是在逆境条件下由菌丝纠结形成的团状休眠 图 5� 阳离子表面活性剂对核盘菌菌丝 细胞膜透性的影响 Fig. 5� E ffect o f cat ion ic surfactants onm em brane o sm o tic po tent ia l o f S. sclero tio rum N ote: A, 1227; B, C8�10; C, 腐霉利 Procym idone 体,能够在土壤中越冬越夏且长期存活, 具有较强 的耐药性和抗逆性。由于上述原因, 短期轮作及 化学药剂土壤处理均难以获得理想的防治效 果 [ 9]。多年来该类病害的防治药剂一直以苯并咪 唑类杀菌剂多菌灵为主 [ 11, 12 ] , 其作用机理是与菌 体的微管蛋白结合, 影响与微管蛋白有关的代谢 和功能, 阻止菌丝的正常形成 [ 13, 14 ] ,由于其作用位 点单一, 加上长期连续单一使用, 加速了病菌抗药 性的产生,而且抗药性菌株分布范围逐年扩大, 抗 性比例上升,导致多菌灵田间防效下降。据报道, 该菌对甲基硫菌灵、乙霉威、腐霉利等也存在较高 103N o. 1 于 � 婷等: 几种季铵盐阳离子表面活性剂对核盘菌的抗菌活性 的抗性风险 [ 15 ]。 本研究表明, 供试阳离子表面活性剂 1227对 核盘菌具有显著的抑制活性, 毒力与乙霉威相当; 由于阳离子表面活性剂还能够显著降低水的表面 张力,提高对植物叶面的润湿能力,因此将该类助 剂添加到常规杀菌剂制剂中, 有可能获得协同增 效作用。综上分析, 季铵盐类阳离子表面活性剂 在防治植物真菌病害上具有一定的应用潜力。 目前相关的研究结果 [ 16, 17]表明, 季铵盐类阳 离子表面活性剂对细菌主要是作用于菌体细胞 膜。带正电荷的季铵离子在水中可以吸附于带负 电的菌体表面,与膜蛋白结合并逐步渗入类脂层, 改变细胞膜通透性,使细胞 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 物外渗; 穿透的季 铵阳离子与膜内酶及蛋白结合, 使其变性, 从而抑 制微生物的新陈代谢, 将其杀死 [ 18]。但有关阳离 子表面活性剂对植物病原真菌的作用 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 还不完 全清楚。 本研究表明, 供试阳离子表面活性剂对真菌 细胞膜也具有显著的破坏作用, 处理后短时间内 可导致菌体细胞膜透性增加。但是由于细菌细胞 壁和膜组成及蛋白种类与真菌的存在较大差异, 因此季铵盐类阳离子表面活性剂对两类微生物膜 及代谢破坏作用的确切机制还有待进行深入的比 较研究。此外, 活性高的供试阳离子表面活性剂 如 1227可导致核盘菌菌丝畸形增粗、使菌核数量 减少但单重却增加, 这与供试常规杀菌剂的表现 恰恰相反。这些现象均表明阳离子表面活性剂的 抑菌作用机理与常规杀菌剂也存在着显著的差 异, 是否可以作为两类药剂混用的理论基础也需 要进一步验证。 参考文献 : [ 1] � ZHU J ian�lan(朱建兰 ) .黄瓜菌核病发病因素的研究 [ J ] . 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