下载

1下载券

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 荧光分光光度

荧光分光光度.pdf

荧光分光光度

qingsheng2000
2011-12-06 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《荧光分光光度pdf》,可适用于工程科技领域

荧光分光光度技术张培敏一、实验目的•、了解荧光分光光度计的主要结构及工作•原理、掌握荧光光度计的操作技术、掌握测定维生素片B中核黄素的实验方法二、基本原理•(一)定性分析根据激发曲线、发射曲线的特性•(二)定量分析稀溶液中荧光强度与浓度成正比•(三)荧光分析法的特点灵敏度高选择性好。(一)定性分析荧光(磷光):光致发光照射光波长如何选择?荧光(磷光)的激发光谱曲线λex固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线(图中曲线I)。激发光谱曲线的最高处处于激发态的分子最多荧光强度最大通过激发光谱选择最佳激发波长发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长常用λex表示。荧光光谱(或磷光光谱)λem固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。通过发射光谱选择最佳的发射波长发射荧光(磷光)强度最大的发射波长常用λem表示。荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧(磷)光光谱激发光谱与发射光谱的关系aStokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长振动弛豫消耗了能量。b发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级吸收不同波长的能量(如能级图λ,λ)产生不同吸收带但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态产生波长一定的荧光(如λ‘)。c镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱(与激发光谱形状一样)成镜像对称关系。(二)、定量测定If=荧光相对强度φf=量子效率I=入射光强度ε=吸收系数b=光程长c=浓度该式只有εbc<<时才成立即荧光测定只有在极稀溶液中才可测定否则校正曲线向浓度轴弯曲。If=φfIεbc=KC(三)荧光分析法的特点•灵敏度高前面已述荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高~个数量级检测下限在~μg·mL之间。主要原因有二:•一是荧光信号是在暗背景下检测的噪声小较微弱的信号也能被检测且可以高倍放大•二是荧光强度和激发光强度成正比关系可以提高激发光的光强以增大荧光强度。•选择性好荧光分析法的光谱比较简单特征性强而且有激发光谱和发射光谱选择的余地大。如果某几种物质的激发光谱相似就可以从它们发射光谱的差异进行鉴别和分析相反如果发射光谱相似可以从它们激发光谱的差异进行鉴别和分析尤其是有机化合物的分析更是如此。对于金属离子的分析来说往往选择性不太高这是由于金属离子的分析往往是通过产生具有荧光特性的配合物或荧光猝灭进行测定。而且荧光特性又往往取决于配位体不同金属离子经常与同一配位体形成相似的配合物具有相似的荧光特性故会互相干扰。•荧光法提供比较多的物理参数可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性能从不同角度提供研究对象的分子的信息。荧光分析法的缺点是应用还不够广泛这是因为本身能发射荧光的物质相对较少用加入某种试剂使非荧光物质转化为荧光物质来进行分析其数量也还不多。此外荧光分析的灵敏度高测定时对环境因素较为敏感干扰因素较多。(四)产生荧光的条件()分子具有与辐射频率相应的荧光结构(内因)()吸收特征频率的光后应可产生具一定量子效率的荧光。即量子效率ϕ足够大:发射的光量子数ϕ=吸收的光量子数(五)影响荧光及强度的因素()跃迁类型:具有ππ*及nπ*跃迁结构的分子才会产生荧光。且具ππ*跃迁的量子效率比nπ*跃迁的要大得多。•芳香族分子()共轭效应:共轭度越大荧光越强。•平面环系统绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环()刚性结构:分子刚性(Rigidity)越强分子振动少与其它分子碰撞失活的机率下降荧光量子效率提高。如荧光素(ϕ大)与酚酞(ϕ=)芴(ϕ=)与联苯(ϕ=)。()取代基:n给电子取代基增强荧光(pπ共轭)如OH、OR、NH、CN、NR等o吸电子基降低荧光如COOH、C=O、NO、NO、X等如苯环被卤素取代从氟苯到碘苯荧光逐渐减弱到消失)溶剂效应:n溶剂极性可增加或降低荧光强度(改变ππ*及nπ*跃迁的能量)o与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。)温度:温度增加荧光强度下降(因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低)。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。)pH值:具酸或碱性基团的有机物质在不同pH值时其结构可能发生变化因而荧光强度将发生改变对无机荧光物质因pH值会影响其稳定性因而也可使其荧光强度发生改变。)荧光猝灭:n碰撞猝灭o静态猝灭p转入三重态的猝灭q电子转移猝灭r自猝灭。三、荧光分析仪器主要部件•激发光源•提供能量光源的光强度很强高压氙弧灯-nm高压汞蒸气灯nm。•激发单色器•发射单色器•检测器•样品池•激发光的入射方向与发射光的接收方向互成直角。激发光源•激发光源应具有足够的强度、适用波长范围宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧灯。●高压汞灯高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源主要有、、nm的三条谱线尤以nm谱线最强一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。••●氙弧灯氙弧灯通常就叫氙灯是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯外套为石英内充氙气室温时其压力为Pa工作时压力为Pa具有光强度大在~nm范围内是连续光源的特点。氙灯的灯内气压高启动时的电压高(~KV)因此使用时一定要注意安全。•此外高功率的可调谐染料激光器是一种新型的荧光激发光源。这种光源不需单色器和滤光片具有单色性好强度大脉冲激光时间短而减少光敏物质的分解等优点。但是仪器设备较复杂所以应用还不广泛。单色器•荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器称为荧光分光光度计。光栅有两块第一块为激发单色器用于选择激发光的波长第二块为发射单色器用于选择荧光发射波长一般是后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。在比较低档次的荧光计中采用滤光片作为单色器多使用干涉滤光片以获得纯度较好的“单色光”。第一滤光片用以分离出所需用的激发光第二滤光片用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。样品池•荧光分析的样品池通常用石英材料做成它与吸光分析法的液池不同在于荧光样品池的四面均为磨光透明面同时一般仅有一种厚度为cm的液池。检测器•简易型的荧光计可用目视检测或用硒光电池光电管检测。现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。在现代的高级仪器中光导摄象管用来作为光学多道分析器(简称OMA)的检测器。它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点。它的检测灵敏度虽不如光电倍增管但却能同时接受荧光体的整个发射光谱。记录显示装置•荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。四、RFPC操作步骤(一)测量过程•提供能量(光源)•选择激发波长(吸收)•照射样品•样品吸收与发射荧光(发射)•选择发射波长•测量、定性测定•接通电源打开电源开关打开氙灯开关打开电脑•桌面RFXPC↓→仪器自检→仪器预热分钟•扫描激发波长:工具栏AcquireMode↓→下拉菜单spectrum↓→工具栏Configure↓→下拉菜单Parameters↓→Type选择Excitation→EMWavelength中输入发射波长→EXWavelengthRange中输入激发波长的扫描范围→ScanningSpeed选择Medium→OK→Start↓→测量完毕•扫描发射波长:工具栏AcquireMode↓→下拉菜单spectrum↓→工具栏Configure↓→下拉菜单Parameters↓→Type选择Emission→EXWavelength中输入激发波长→EMWavelengthRange中输入发射波长的扫描范围→ScanningSpeed选择Medium→OK→Start↓→测量完毕激发光谱激发光谱告诉我们什么?•化合物吸收波长•吸收强度•溶剂吸收波长发射光谱发射光谱告诉我们什么?•化合物荧光波长•荧光强度•拉曼和瑞利散射()、定量分析•标准曲线制作和未知样品测量:工具栏AcquireMode↓→下拉菜单Quantitative↓→工具栏Configure↓→下拉菜单Parameters↓→Method选择MultipointWorkingCurve→OK↓→EXWavelength中输入激发波长EMWavelength中输入发射波长→Units中输入样品溶液浓度单位→ConcentrationRange中输入样品浓度范围→RecordingRange中输入荧光强度范围→OK→Read↓→重复测量完所有样品溶液→保存•打印:工具栏Presentation↓→下拉菜单Plot↓→选择所需打印的数据或图表或文件→print↓。标准表与标准曲线维生素B片剂中核黄素含量的测定实验步骤(一)、确定最佳激发和发射波长•、配制μg•mlB溶液用HAc稀释。•、配制μg•mlB溶液用HAc稀释。•、search最佳波长为ex=nmem=nm•、荧光波长暂设定在nm处在~nm波长范围内对激发波长进行扫描记录激发光谱曲线•、然后将激发波长设定在nm处在~nm波长范围内对荧光波长扫描记录荧光光谱曲线λλλ•(二)酸度的选择•于三只ml容量瓶中各加入μg•ml的核黄素标准溶液ml然后分别加:盐酸ml、氢氧化钠溶液ml用蒸馏水稀释至刻度另一只用醋酸稀释至刻度摇匀后用酸度计或pH试纸测定溶液的pH并于荧光分光光度计上测出相应的荧光强度考察酸度对荧光强度的影响从中确定最佳调节pH的溶液。•(三)、标准溶液的绘制•准确移取μg•ml的核黄素标准溶液mlmlmlmlmlml分别置于个ml比色管中用所确定的pH溶液稀释至刻度摇匀。测定标准系列溶液的荧光强度。•(四)、样品测定•用移液管准确移取一定量的含维生素B的溶液于ml容量瓶中再用上述pH溶液稀释至刻度摇匀制成试液。在与标准曲线一致的实验条件下测定试验的荧光强度在标准曲线上查出维生素B的浓度并根据样品取样量和稀释倍数计算出原溶液中维生素B的含量(mg·ml)五、实验注意事项五、实验注意事项作为初学者需要对实验过程中出现的各种现象进行必要的分析探讨其中的必然规律以得出正确的结论。要正确区分瑞利散射峰、拉曼散射峰、次或次光的波峰六、思考题:•、为什么选择Exnm~Emnm为定量时的波长对?•、未知液的稀释原则是什么?•、如何确定未知物的最佳激发波长和最佳发射波长?•七、开放性实验、验证“发射光谱的形状与激发波长无关”、如何区别瑞利散射峰、拉曼散射峰、次或次光的波峰附件:荧光分析法新技术简介•同步荧光测定法同步荧光法是同时扫描激发光和发射光波长下绘制的光谱由测定的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图。根据激发单色器和发射单色器在同时扫描过程中彼此间所应保持的关系同步荧光测定法还分为三种类型:第一种在同时扫描过程中使激发波长(λex)和发射波长(λem)保持固定的波长间隔(即λex-λem=常数)这种方法称为:"固定波长同步扫描荧光测定法"即习惯上讲的同步荧光测定法是最早提出的同步扫描技术第二种以能量代替波长关系在两个单色器同时扫描过程中使激发波长和发射波长之间保持固定的能量差(即频率或波数差)这种方法称为"固定能量同步扫描荧光测定法"第三种使激发和发射单色器以不同的速率同时扫描(即λex-λem≠常数而是时间的线性函数)这种方法称为"可变角同步扫描荧光测定法"。同步荧光测定法具有使光谱简单、光谱窄化、减少光谱重叠、减少散射光影响、提高选择性等优点。导数荧光测定法•自从二十世纪年代初期导数光谱技术应用于分光光度测定之后使分光光度法的选择性得到很大的改善。直到年导数技术才引进到荧光分析在解决荧光测定中的背景干扰和谱带重叠问题上收到良好的效果已被证明是一种提高荧光分析选择性的有效手段。导数荧光测定法的基本原理与分光光度法类似三维荧光光谱测定法••普通荧光分析所得的光谱是二维光谱即荧光强度随波长(激发波长或发射波长)的变化而变化的曲线。如果同时考虑激发波长和发射波长同时对荧光强度的影响则荧光强度应是激发波长和发射波长两个变量的函数。描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱称为三维荧光光谱三维荧光光谱是近一、二十年中发展起来的一种新的荧光分析技术在文献中使用的名称不一常见的称为三维荧光光谱荧光总发光光谱激发-发射矩阵和等高线光谱等。三维荧光光谱的表现形式有二种:一是等角三维投影图见下图左所示这种表示法比较直观x,y,z三维坐标轴分别表示发射波长、激发波长和荧光强度二是等高线光谱图如下图右所示以平面坐标的横轴表示发射波长纵轴表示激发波长平面上的点表示由两波长所决定的样品的荧光强度将荧光强度相等的各点连接起来便在λemλex构成的平面上显示出一系列等强度线组成的等高光谱图。免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题。免疫检测法通常以未标记的抗原与特定抗体间的竞争性抑制作用为基础的。检测时抗体(Ab)和已标记的抗原(AgL)两者组成混合物两者浓度固定且抗体的浓度受到限制以保证抗原处于过量。未标记的抗原(Ag)加入到一个在一定温度下培育过的混合物中时已标记的抗原(AgL)被稀释并发生竞争抑制作用而建立以下的平衡:••(AgLAb)和(AgAb)分别表示抗体与已标记抗原和抗体与未标记抗原的配合物。由于竞争作用未标记的抗原对抗体的联接作用使原来可联接于已标记抗原的抗体现场量减少了因而减少了(AgLAb)配合物的形成从(AgLAb)配合物的减少或游离AgL的增加都可以检测试样中的抗原。荧光免疫检测采用荧光标记物(L)标记抗原以进行测定。因此荧光标记物或称荧光探针的选择成为方法的关键所在。现在已有各种各样的荧光探针应用于生物、生化和医学临床检测其中以荧光黄衍生物和罗丹明衍生物应用较为广泛。荧光免疫检测荧光分光光度技术一、实验目的二、基本原理荧光光谱(或磷光光谱)激发光谱与发射光谱的关系(二)、定量测定(三)荧光分析法的特点三、荧光分析仪器主要部件þÿ激发光源单色器样品池检测器记录显示装置四、RFPC操作步骤(一)测量过程、定性测定激发光谱激发光谱告诉我们什么?发射光谱发射光谱告诉我们什么?()、定量分析标准表与标准曲线维生素B片剂中核黄素含量的测定实验步骤五、实验注意事项六、思考题:附件:荧光分析法新技术简介导数荧光测定法三维荧光光谱测定法

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/47

荧光分光光度

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利