RNA折叠

自然杂 志 26卷5期 专题综述 RNA折叠* 王传铭① 潘 珉② 曹 槐③ ①理学硕士，云南大学现代生物学研究中心，昆明 650091；红河学院，云南蒙自，661100 ②理学硕士，云南大学现代生物学研究中心，昆明 650091 ③教授，博士生导师，云南大学现代生物学研究中心，昆明 650091 *国家自然科学基金资助 (No．90208018；30160036) 关键词 RNA折叠 RNA结构 折叠动力学 核酶 与蛋白质相比，RNA的折叠是一个比较新的研究领域．不同的 RNA分子可能沿着不同的路径，以某些与蛋白质 折叠并不完全相同的方式构建出复杂的三维结构．在此过程中，RNA要受到许多环境因素的影响．对这些因素以及 RNA的折叠机制进行深入的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，将加深人们对地位显得 日益重要的 RNA分子的结构与功能的理解，并由此揭示 RNA在基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达调控过程中所起的重要作用． RNA分子在生物体内的作用最初仅仅被认识为充 当遗传 信息 的传递 者 和蛋 白质 合 成 的参 与者．加 之 RNA的分子组成比蛋白质简单，因而长期以来，无论从 数量上还是从质量上，对 RNA折叠 的探索远远比不上 对蛋白质折叠的系统研究．随着越来越多核酶 的发现、 核糖体结构测定和功能分析的不断精细化、以及反义核 酸和核酸干扰现象等一系列研究 的深入，人们对 RNA 所参与的分子生物学过程逐渐有 了全面的了解．为了实 现复杂多样的功能 ，各种不 同的 RNA分子必须折叠成 各种各样的空间结构．对 RNA折叠过程和机制研究 的 深入与加强，将会使人们对 RNA的结构与功能的相关 性 ，以及遗传信息的传递本质有新的认识． 一 、 RNA折叠与蛋白质折叠的异同 作为生物大分子 ，RNA和蛋白质一样，都具有复杂 的空间构象，这些构象是它们复杂多样生 物功能 的基 础 ．这两种大分子在体内的折叠过程中，都要最大限度 地缩小其疏水残基暴露在水溶液 中的面积，最终形成紧 密结构．所不 同的是，蛋 白质折叠的驱动力主要来 自疏 水核心的形成，而 RNA主要靠的是碱基堆积，由于疏水 作用一般仅能促进 RNA二级结构 的形成 ，要进一步折 叠成三级结构必须克服 RNA主链上强烈的静电排斥 ． 与蛋白质相比，RNA的折叠相对简单一些．蛋白质 的构成单元是多达 20种的氨基酸残基，残基之间的相 互作用不仅取决于其本身的化学性质，还受到每个残基 的空间构型的影响．蛋白质的二级结构单元受上下文关 系制约，不可能孤立存在；而且稳定的二级结构和三级 结构所需的能量是具有可比性的．因而，蛋白质 的二级 和三级结构的形成相互制约、相互影响．这就意味着蛋 白质的二三级结构不可能完全分离，也没有一个简单的 规则可以从其序列直接预测其三维结构． RNA的分子组成包含 4种核苷酸残基 ，这 4种残 基的结构又十分相似，残基之间的相互作用主要有两 种：氢键和碱基堆积．RNA的二级结构单元可分为几种 基本类型．例如螺旋、环、膨泡、分支等，三级结构单元 (包括假结、吻环、环 一茎、茎 一茎相互作用等)目前所知 也很有限，而且参与形成二级结构 的能量要远大于参与 形成三级结构的能量．所以 RNA二级结构与三级结构 可以看作是能够分离的，三级 相互作用只是对二级结构 的形成产生一些扰动 ．因此，RNA的“层次性折叠”(hi— erarchical mode1)理论[1 认为，RNA 的折叠过程是按顺 序进行的，即先形成二级结构再形成三级结构．存在于 RNA序列中的结构信息的流动是单向的，这明显不同 于蛋白质结构形成过程中信息的双向流动口]．早期有关 tRNA “折叠的研究也证实，tRNA 的三级结构形成很 快(ms级)，原因就在于它是由一个 预先组织好的二级 结构开始折叠成三级结构，形成 tRNA L型构象的三级 相互作用(包括三碱基体 、吻环等)并不改变 tRNA三叶 草结构中的碱基配对情况． 近年来 ，随着对大分子 RNA研究的不断深入 ，人们 发现上述这种 “层次 性折叠”模 型不太适用 于大分子 RNA．尽管 I类内含子的动力学和热力学折叠路径与此 模型基本一致，但其折叠速度要明显比单纯的“层次性 · 249 · 维普资讯 http://www.cqvip.com 专题综述 Zir“7l 口zh Vo1．26 No．5 折叠”模型所预期 的要慢．分子更大 的核酶 由于其组成 单元的构象动力学的多样性和结构域之间存 在着相互 作用，其折叠路径更为复杂一些．如四膜虫核酶的 P4一P6 结构域相对独立，折叠很快(K。 =1 S )，而 P3一P7则要 慢 10～20倍 ．而且在缺乏 Mg 而使三级结构无法正确 形成的情况下 ，其 P5abc三分支环有 15个碱基 的二级 结构和天然结构不同．这说明其天然二级结构是受到三 级相互作用 的捕获(capture)而形成的．因此 ，Treiber D K等提出了一个“准层次性折叠”模型(quasi-hierarchi— cal mode1)E3]，认 为在 RNA折叠过程中，二级结构的预 组织和三级结构的形成不是完全分离的，二级结构模块 并非在 RNA天然构象组成之前而是在组成过程之中逐 渐稳定地形成．由于小 RNA模体(motif)有采取可变构 象的倾 向，因而在三级结构形成过程 中，二级结构不可 避免地会发生一些重排．“准层次性折叠”模型的提出， 丰富了人们对 RNA折叠过程 的认识 ，有助于从动态层 面认识 RNA折叠． 二、RNA结构单元折叠的一般过程 大分子 RNA都是由相对较小 的结构单元组成的， 这些结构单元的折叠可以看作是结构更为复杂的 RNA 折叠的基础和范例．其中四膜虫 I类内含子 中的 PSabc 的折叠是 目前研究得比较清楚 的一例．这种核酶由 P4一 P6和 P3．P7两个结构域组成 ，P5abc是其中 P4一P6的一 个组成部分．体外实验中，当温度一旦降低到能够形成 第一对碱基配对，首先出现的是两个 GNRA 四碱基端 环 ．随着关闭这两个四环的茎区的延长、交汇，一个三分 支环逐渐形成．整个发夹的 5’端和 3’端逐渐靠拢、配 对，最终形成具有一个富含 A的膨泡和一个单碱基 U 膨泡 的茎区，从而关闭整个发夹 ，形成完整 的二级结构 (图 1a)．碱基配对首先在整个发夹的 5’末端和 3’末端 之间形成的概率很小 ，原 因在于单链 的两端相距较远 ， 碱基对的形成会极大地降低整个 RNA分子的熵值，这 无论在动力学上还是在热力学上都不利于其他部分碱 基配对的形成 ．近年来人们对 RNA发夹折叠的动力学 研究 ，也得出了相同的结论． P5abc的二级结构进一步折叠形成整个核酶的三级 结构的一部分时 ，与降温相 比，离子结合所起的作用开 始凸现．在此过程中，原有的碱基配对会发生一些变化， 这可以从 P4一P6的晶体结构中看出(图 1b)．由5个碱基 构成的富含 A的膨泡变成了两个较小的(一个 4碱基， 一 个单碱基)膨泡．其中单碱基膨泡上的鸟嘌呤 G通过 一 个 M ’和 PSc的茎区发生作用 ，P5c上的四环也转变 · 25O · 成五环，同时其关闭碱基对也减少到 3对．靠近三分支 环的 P5b的茎区末端增加两个新的 GA碱基对，并且这 两个配对都与 Mg：’结合 ．作为整个 RNA 分子的一部 分，PSabc还与核酶的其他部分发生三级相互作用 ：富含 A的膨泡上的两个腺嘌呤 A与 P4中的一个端环连接 ， P5b上的四环和它在 J6a／J6b上的受体对接 ，P5c发夹 通过 Mg ’和周 围的 RNA(外 围的 P2发夹等)相互作 用 ．P5b四环的受体(P6a和 P6b之间的一个不对称内环 及 P6a上的两个 CG 配对)的结构不是预先形成的，而 是随着与四环的结合逐渐形成 ．这种“诱导契合机制”n 同样也出现在小分子的发夹核酶的折叠过程之中，这可 能代表了 RNA组装的一个普遍现象．上述这些三级相 互作用不仅改变了部分碱基配对，也改变了整个分子的 三维空间排列，促成了 P4．P6结构域的构建． 3’G-c5 G■C P~aC A． IIG u 65 G●C U■A Cmi U●A10 55G●C 45A AAG高 A 5U．GA lJ5c 35 A-U G●C P5b GA ． m c U 30 8 7 2。 U·G C●G A ·G A A 25 AG o37： 一27．7 (a) To P4 三级结构折叠 — - l 3’AIIG5 G●C G●C P5aAC - IIG uu G●C U●A ●G ●U I直含 ^ ．A I的膨泡 ●C ●C I - A - A ·G 图 1 a：利用 Zuker算法预测出的 I类内含子核酶 PSabc的二级结构 b：PSabc作为 I类内含子核 酶的一 个相对独 立的折 苻结构 域的 ～ 部分时的二级结构．黑色圆形显示 j-Mg”的结合位点，箭头 指示的是与 RNA其他部分发生的三级相互作用． 三、大分子 RNA的折叠机制 小角度 x射线散射实验(SAXS)和其他流体动力学 方法已经证实 ，快速 的静电衰减(collapsc)可能是所有 大分子 RNA折叠时比较普遍 的第一步 ]．衰减后形成 的熔球状中问体直径比天然的折叠结构稍大一些，其中 包含了许多近天然的二级结构 ．不同 RNA的这些中间 体通过离子结合 、构象搜索等方法 ，沿着不同的途径最 终折叠成天然结构 ．按照折叠路径上是否存在动力学陷 U C U C A G ^ G G、 5 P 、 ， 维普资讯 http://www.cqvip.com 自然 杂志 26卷5期 专题综述 阱，我们大致把这些大分子 RNA的折叠方式分为以下 两种： 1．有陷阱模式(图 2a) 作为四膜虫 I类内含子的组成部分，P5abc的折叠 过程为整个大分子核酶 的折叠机制研究提供 了细节． P4-P6相当于一个大的发夹核酶 ，是整个分子中折叠最 快的部分 ；接着是位于分子外围的一些延伸部分(如 P2， P2．1和 P9．1等)形成长程三级连接；最晚形成 的是 P3． P7结构域．之后整个核酶还需要作进一步的结构重排 ， 才能最终形成活性结构、P3．P7形成得最慢的原因在于 先折叠的 P4．P6和 P2，P2．1会环绕在分子的外围，像一 个笼子一样包裹着 P3-P7所组成 的催化核心 ，限制了它 的构象变化．一些突变 的核酶能使 P3．P7快速折叠，其 突变位点都定位于 P5abc的 Mg ’核心，通过降低 P4．P6 的稳定性而使 P3．P7的形成加速．这表明四膜虫 I类内 含子的折叠路径当中至少存在两个动力学中间体，一个 是 I (只有 P4．P6已折叠)，另一个是 I P3． (P4．P6和 P3．P7都折叠，但整个核酶还不具有催化活性)．这两个 中间体都不是构象空间搜索过程中的动态结构(dynam． ic structure)，而是动力学 陷阱(kinetic trap)．其中 IP4．P6 的稳定性来自 P4．P6结构域 内部天然的三级相互作用 ， 而不是简单地依靠错误的非天然作用．结构域 间的非天 然相互作用在折叠 过程 中会稳定 P3．P7的非天然二三 级结构．快折叠突变体的原理可能就在于它加大了 P4． P6的动态性，放松了对非天然 的 P3．P7构象的限制，使 其能够较快地捕捉到天然构象． 许多类似的研究 都说明，大分子核酶折叠的能 量表面(energe landscape)比蛋白质要崎岖得多 ，众多天 然的和非天然的二三级作用使得错误折叠中间体在折 叠路径中逐渐累积 ，形成许多动力学陷阱． 2．无陷阱模式 tRNA折叠是研究得最早的折叠模型，由三叶草式 的二级结构折叠成 L型三级结构的过程代表了经典的 “层次性折叠”模式．这也是长期以来人们所知的分子较 大的 RNA中惟一一个折叠过程中没有动力学陷阱的模 型．近年来发现的三个新的没有动力学陷阱的例子使人 们有理由相信，RNA折叠路径上那种崎 岖的能量表面 也并非完全不可避免 ，一些内外条件的变化可以减少甚 至消除动力学陷阱．这三个例子分别是 RNase P核酶的 催化结构域(P RNA C-domain)，I类内含子 b15的催化 核心(bl5-core)和 由 【I类 内含子 ai57产生 的 D135核 酶．它们分别代表了三种不同的折叠机制． (a) U 离子结合和构象搜索 ／ I I === 动蒡擘陷阱厂快上丁慢 动力学陷阱I ●I L陷阱 【b) u l。 ＼ 12 N 快 陷阱 I l N 三级结构 【c) u I，— — I N 构象搜索 ， 【d) u 慢 构象搜索 N 未折叠态 二级结构塌缩 二级结构塌缩 天然态 二级结构伸展 无三级结构 形成部分 (折叠态) 无三级结构 三级结构 图 2 RNA折叠的四种机制 u：未折叠态，I：动力学折叠中问体，N：天然态． 巾 b，c，d中的 箭头都和 a一样是双向的，但其中的反向箭头均省略． (1)快速折叠模式(图2b)．P RNA整体的折叠和四 膜虫 I类内含子非常相似，至少有两个中间体存在，但其 中只有一个是动力学陷阱．而且组成 P RNA的两个结 构域(催化结构域 C和底物结合结构域 s)能较稳定地独 立存在，不像四膜虫 I类内含子那样两个结构域 的折叠 互相影响．其中催化结构域 C的折叠很快，中间体虽然 也会在折叠路径上产生，但不会大量累积，整体的折叠 呈现出漏斗状的能量表面 ]． (2)慢速的三级结构捕获模式(图 2c)．bl5-core的 折叠是一种典型的三级结构捕获机制，因为其折叠路径 上存在大量构象相同的中间体，其中只有能与蛋白质 CBP2稳定结合的很小一部分中间体才能最终折叠成天 然构象 ]．其能量表面因此可看作是类似于蛋白质折叠 中的一种“香槟酒瓶”的形态．这些大量存在的中间体为 构象搜索提供了丰富的候选材料，因此尽管这种搜索很 费时，是这种 RNA折叠 的限速步骤，但许多实验现象， 如反应过程的活化能很低，增加尿素浓度也不会加快折 叠速度等，都证实了这些中间体确实不是陷阱．随着序 列的增长，更大 的 RNA分子 ，如 rRNA，在 折叠过程 中 将会产生更多的中间体，错配的可能性也随之增加．此 时核糖体中的蛋白质将对 RNA的正确折叠起更大的促 进作用，三级结构捕获可能是这类大分子 RNP折叠的 最主要机制． (3)慢速的构象搜索模式(图2d)．D135的折叠路 · 251 · 维普资讯 http://www.cqvip.com 专题综述 Ziran Zazhi Vo1．26 No．5 径上也没有动力学陷阱，但同样折叠得很慢，原因在于 它在折叠初期迅速折拢 (collapse)成一种几乎不包含高 级结构的中问体，而后需要对一种关键的三级结构进行 构象搜索．这种三级结构是由在一级序列或二级结构上 相距很远的部分通过相互作用而形成的，因此搜索起来 很慢 ]．D135是人们发现 的第一种通过缓慢 的然而又 是正确的折叠过程直接到达天然构象的大分子 RNA． 四、RNA折叠的影响因素 1．金属离子 由于主链含有大量带负电荷的磷酸基团，如何克服 静电排斥力就成为理解 RNA折叠方式的一个重要问 题．金属离子在此方面具有十分重要的作用．体外实验 中影响 RNA折叠的两个条件：一个是降温，另一个就是 增加离子浓度 ．尽管在生理浓度下，Mg 结合力比较弱 ， 但二价和三价的阳离子在稳定 RNA二级结构方面比单 价的 Na 显得更为有效．Mg： 通常以 Mg(H：o)： 的形 式与 RNA结合，也发现有 Mg(H：o) 的存在，此外还 有 Mn(H：o)： 、Co(NH ) 等．这些金属离子与 RNA 结合的情况可以分为两种类 型 ]，第一类 与 RNA二级 结构中预先形成的结合位点结合 ，这些结合位点在缺乏 Mg 的情况下就已存在于 RNA的二级结构之中，而且 其结构不会因结合上离子而改变 ．这一类结合 位点中， 最主要的是位于由一个或多个 GU配对形成的茎区，因 为在 RNA 双螺旋的大沟中，一个 GU 配对只有一个氢 键受体 ，而 AU和 GC配对则具有由C或 A提供的氨基 氢键供体．对四膜虫 I类内含子的研究表明，这些离子结 合位点都靠近三级相互作用位点．例如 P1螺旋中的 GU 配对处于剪接位点旁，P5螺旋中的一组纵列的GU配对 是和 P9环对接(docking)位点的一部分，P5b茎环结构 中的 纵列 GU 配 对靠 近 和 J6a／6b中 的受体 对 接 的 GAAA四环．因此这些金属离子的主要作用是降低那些 必须发生三级相互作用的二级结构单元之间的静电斥 力．在此意义上，金属离子主要影响的不是 RNA的二级 而是三级 结构 的折叠．第二类金属离 子结合位点是在 RNA三级结构形成后或形成过程中产生的．例如，假结 (pseudoknot)和吻环(kissing loop)的形成会导致一个或 多个离子的结合位点的形成．四膜虫 I类 内含子 的 P4． P6结构域三级结构的形成也是 Mg： 离子核心 (magne． sium ion core)形成的必要条件．没有这些离子，既不会有 三级相互作用位点的形成，也不会有三级结构的存在． 金属离子对 RNA折叠的影响不是一种简单的数量 · 252 · 关系，对于由两个稳定的独立结构域组成的 RNase P核 酶 ，Mg： 浓度升高会加快其折叠 ；而对于两个结构域之 间互相影响的四膜虫 I类内含子，Mg 浓度升高却要降 低其中一个结构域 P3-P7的折叠速度 ．原因是 P4一P6结 构域会因 M 浓度的升高而加速折叠成为稳定的中间 体 ，使 P3．P7结构域的天然结构难 以形成 ．此外 ，有新的 模型显示弥散结合 (diffuse binding)的 M ’比位点结 合(site binding)的 Mg 在促进 RNA折叠方面作用可 能更大 ．这些发现表 明，金属离子和 RNA折叠之间 的关系是很复杂的． 截至目前 ，金属离子对 RNA折叠影响的实验大都 在体外进行．由于金属离子对核酶的结构和功能的重要 性，许 多 大 分 子 核 酶 可 以 被 看 作 是 金 属 酶 (met- alloenzyme)，因此探讨金属离子对折叠的影响对于核酶 的应用研究具有重要的实践意义，并且体外实验也给研 究 RNA在体内真实的折叠过程提供了有价值的信息． 与此同时，人们又观察到大的 RNA分子在体内折叠的 速度要比体外快 10～100倍 ，这说明 RNA体 内折叠 的机制与体外并不完全相同，还有以下一些体 内条件对 RNA的快速正确折叠起着促进作用 ． 2．上下文序列的影响 体内的具有酶活性的 自剪接内含子是嵌入在整个 RNA分子之中的，其上下文序列会在一定 程度上纠正 或避免错误折叠的发生 ，而且天然的外显子序列 比人工 添加的外显子序列对折叠 的影响要更大 、更明显 ． 相反的例子是，T4噬菌体的 I类内含子的剪接会因其 5’端外显子与靠近 3’端剪接位点的内含子序列之间发 生碱基配对而被阻止 ．四膜虫 I类核酶的自剪接也会被 5’端外显子中的茎环结构阻止 1¨ ，这种茎环结构 的形成 还会增加内含子核心的 P3的错误折叠．外显子无论在 体内还是在体外都对四膜虫 I类 内含子折叠的能量表面 产生显著影响．在体外，外显子能促使其催化核心的错 配；而体内有证据表明外显子既能稳定催化核心，又能 起到自我伴娘(self-chaperone)的作用．至于外显子在体 内影响折叠的精确机制 ，现在还不很清楚． 3．共转录折叠 利用不少探测转 录过程 中的 RNA 结构 的方法发 现 ，RNA在体内并非像体外实验那样是全部合成后 (仍 保持无规卷曲状态)再开始折叠，而是在由 DNA转录成 RNA的过 程 中 边合 成 边折 叠 的．例 如 用 大 肠 杆 菌 (E．coil)RNA 聚合酶来合成 RNA时，新生 RNA链 的 长度达到 14-16碱基(nt)长时就可以开始折叠 ．转录 维普资讯 http://www.cqvip.com 自然杂 志 26卷5期 专题综述 对RNA折叠的影响一般来讲有三个方面 ：第一，转 录的方向性决定了折叠事件发生的顺序；第二 ，不同的 RNA聚合酶所带来的转录速度上 的差异能影响折叠的 路径(T7 RNA聚合酶在体外的延伸速度是 200～400 nt／s，而大肠杆菌 RNA聚合酶的延伸速度只有 10～35 nt／s)；第三，RNA聚合酶的转录终止似乎也影响折叠路 径，如大肠杆菌的 NusA蛋白在通过促进终止发夹的形成 来促进转录的终止的同时，能够影响到 Rase P的折叠． 转录会阻止或促进非天然受陷中间体的形成 ，从而 对折叠过程产生积极或消极的影响．如 T7 RNA聚合酶 在体外转录 RNase P RNA时 ，总体的折叠速度与 Mg 诱导的体外重折叠速度几乎一样慢 ，但其分子中催化结 构域的折叠要比重折叠时的速度快 4倍 ，而 tRNA识别 结构域的折叠要慢于重折叠 ，表 明共转录折叠(CO-tran- scriptional folding)和全长的 RNA 的重折叠相 比，尽管 二者速度可能相近 ，但折叠路径可能并不相同．当然二 者最终的折叠结果似乎差别不大，但还没有详细的报道 具体 比较其差异程度．这些共转录折叠实验 的实验对象 以及所用的 RNA聚合酶大多来 自原核生物或病毒 ，如 何在体内探测真核生物 RNA共转录折叠的细节，比较 真核生物与原核生物的 RNA折叠机制存在多大差异， 还是摆在人们面前的一个 尚待解决 的难题． 4．蛋白质的作用 一 些与 RNA非特异性结合的蛋白质能够帮助非天 然的 RNA折叠中间体解折叠 ，并 以一种类似于蛋白质 伴娘的方式促进它们 向活性结构 转变．这类又被称作 RNA伴娘的蛋白质，包括艾滋病毒(HIV)的核衣壳蛋 白NCp7，大肠杆菌 的核糖体蛋 白 S12，转录调节 因子 Stp A蛋白和冷休克蛋白(Csp)A，真核生物的均一核蛋 白体蛋白(hn RNP)A1，转录因子 p53和酵母菌 La蛋白 以及朊蛋 白 PrP等．此外，大 肠杆菌 Hfq蛋 白能促进 RNA之间的相互作用 ，是第一种被报道 的影响到 RNA 活性的 RNA伴娘 ．由于非编码 RNA OxyS和 DsrA 所进行的基因调控必须依靠 Hfq剪接体(spliceosome) 的正确组装，同时也需要众多因子参与稳定 RNA螺旋 ， 其中包括依 赖 RNA 的 ATP酶 中 DEAD／DEAH 家族 的许多成员 ，因此它们一旦发生 突变，常会引起冷敏感 表型，表明这些蛋白质因子具有 RNA解旋功能 ．核糖体 的生物合成时，前体 rRNA 和小核 RNA之间有暂时性 的碱基配对发生，也提示小核核蛋 白体(snoRNP)有作 为核糖体组装的伴娘的可能． 一 些 RNA 的特 异性 结合 蛋 白也具 有 协 助其 靶 RNA折叠的功能．如 Neurospora crassa的酪氨酰tRNA 合成酶(CYT-18)能识别并结合 I类内含子的类tRNA结 构 ，又比如线粒体核糖体大亚基 RNA(LSU)，NADH脱 氢酶亚基 1内含子(ND1)及 T4噬菌体的 td内含子等， 能起到稳定这些具有 自催化功能的内含子 的催化核心 作用。’ ．因突变而导致三级结构不稳定 的 td内含子在 体内可以被 CYT．18援救(rescue)．酵母菌细胞色素 b 前体 mRNA加工蛋白 2(CBP2)帮助 b15内含子折叠的 方式则有所不同．这种内含子在近生理条件下能快速折 拢成一种非天然折叠 态，此状态并不是一种动力学 陷 阱，而是反映了对结构核心的构象搜索 ，代表着一种 自 我伴娘机制 ．而 CBP2．RNA 复合体能捕获(capture) 此内含子 ，引导其从折拢态转变为天然态．II类 内含子 的体内剪接也需要特异性剪接因子 的协助．迄今为止 ， 人们发现的能够直接和内含子结合 的蛋 白质只有由内 含子中可读框编码的成熟酶．如 Lactococcus lactis LIL- trB内含子成熟酶能结合到催化核心的保守区域，诱导 剪接所需要的三级相互作用的形成． 5．核糖体 人们通过在 td内含子上游引入终止密码而使核糖 体驻留(stal1)，结果发现 td内含子的剪接活性几乎完全 消失．据此人们建立 了一个翻译和剪接活性之间关联的 模型[1 ，认为核糖体在 td内含子上游 的阅读活动解开 了 td内含子 3’末端与其 5’端外显子之间的碱基配对 ， 使此内含子得以能够重折叠成剪接位点识别所必需的 结构．核糖体在大肠杆菌 trp操纵子先导区的驻 留或者 移动，还能分别避免或者允许终止发夹的形成，从而使 转录继续进行或者停止 ．这种 被称作“转录衰减(tran． scription attenuation)”_I们或者“翻译衰减”的机制表明， 由于原核生 物 转录 和 翻译 的偶联 ，核 糖 体能 够影 响 RNA的折叠．从此意义上讲，核糖体也可以看作是一种 RNA伴娘 ． 五、问题与展望 RNA折叠的研究近年来 已经取得 了很大进展，与 此同时，在研究过程中还存在许多尚待解决的问题．与 蛋 白质相比，有关 RNA折叠过程和折叠机制的探索还 处在起步阶段 ． 静态和动态 大量的研究建立在已经测定的 RNA 的晶体结构 和核磁共振结构上 ，这些静态折 叠结 构为 RNA的动态折叠过程提供了许多有价值 的参考信息， 但并不能反映折叠过程 的全部．而且在体内，RNA的结 构和一切生物大分子的结构一样是处于动态 的平衡过 · 253 · 维普资讯 http://www.cqvip.com 专题综述 Ziran Zazhi Vo1．26 NO．5 程之中，许多生物学过程和生物学功能要靠 RNA分子 结构的变化来进行动态调节 ．因此研究 RNA的动态结 构和动态折叠过程是摆在人们面前的一个重要课题．最 近运用荧光共振能量转移(FRET)技术实时测量单分子 RNA在溶液中的势垒、过 渡态 、解折叠路径等，已经达 到了亚毫秒量级，取得 了丰富的成果r1 ． 体 内和体外 迄今为止，有关 RNA折叠 的研究大 多是在体外进行的，而 RNA的折叠依据体外不同的初 始条件可以有许多平行的路径，这在体内可能是行不通 的．虽然有证据显示 RNA在体内和体外的折叠具有一 些相同的基本特征，但我们还不清楚体外实验得出的结 论是否都能应用到体内 ．如何在体外更好地模拟体内 的环境条件，以及如何设计体内的 RNA折叠实验或直接 观测体内RNA的折叠过程，也是人们面临的一个挑战． 理论与实验 由于 RNA在体内与蛋白质结合得 十分紧密 ，使得 RNA 的分离、提纯、结 晶和结构测定非 常困难．与数万个蛋白质晶体结构相比，目前已经测定 的 RNA的结构十分有限．这在很大程度上限制了 RNA 折叠研究的发展．因此 ，FRET和放射性 羟基足迹实验 (synchrotron hydroxyl radical footprinting)将可能有更 大的发展空间．而在努力改进实验方法的同时，理论研 究的重要性也日益突出．如何根据实验现象构建和改进 理论模型以及如何处理实验结果与理论模拟之间的关 系，也是人们亟待解决的问题．尽管在提高 RNA二级结 构预测的准确性以及在 RNA折叠机制研究中考虑折叠 的动力学等方面已经取得了很多进展 ，但离人们的期望 目标仍有相当远的距离 ． 编码 RNA和非编码 RNA 众多具有催化活性的 RNA的发现为人们认识 RNA的重要性打开了新的天 地，大量有关核酶的折叠研究 ，占据了目前 RNA折叠研 究的大部分内容．其原因部分归结于核酶折叠结构 的变 化可以比较容易地从其催化活性的改变上观测出来．此 外，随着核糖体精细结构的解析和小 RNA的功能的逐 步了解 ，rRNA、siRNA、miRNA等许多非编码 RNA 的 研究也 日益成为热点 ．在人类和其他基因组中系统地寻 找非编码 RNA的工作才刚刚开始，而这一进程将可能 发现更多种类 的 RNA 分子和更多的人们想象不 到的 RNA的新功能．与此同时，人们也不应冷落在遗传体系 中占据最 重要地 位的 mRNA 的折叠 研究．尽 管有关 mRNA折叠结构所具有的生物学功能的研究还不多，又 多集中在 mRNA的 5’端和 3’端的不 翻译 区，但有充分 的证据显示 mRNA的编码区折叠结构在体内的存在． 虽然核糖体上的mRNA在翻译过程中是以单链形式行 使功能，但这种单链的拓扑构象与其解折叠前的发夹结 · 254 · 构密切相关0 ．而 tRNA与单链 mRNA的相互作用又 极有可能影响到翻译过程的调节．因此 mRNA 编码 区 折叠结构和折叠机制的研究理应受到人们更多的关注． Tinoco等曾撰文表示蛋白质折叠研究领域中如果有 10％的研究者转向 RNA，RNA折叠 的许多问题将会在 一 两年内解决 ]．而我们希望看到，RNA折叠的研究者 能有 10％的人专心于 mRNA折叠 的研究，那么在不久 的将来，人们在对遗传信息本质的认识上也将会产生质 的飞跃 ． (2004年 5月 10日收到) 1 Brion P．， W esthof E． Annu． ReV． Biophys Biomol Struct．，1997；26：113．137 2 Tinoco I．，Bustamante C．J．Mo1．Bio1．，1999；293(2)：27 281 3 Treiber D．K．。Williamson J．R．Curr．0pin．Struct．Bio1． 1999；9(3)：339．345 4 Butcher S．E．t Dieckmann T．，Feigon ．EMBo J ，、997t 16 (24)：7490．7499 5 RusselI R．， Pf n，． PrOC． Nat1．Acad．Scf． ，2002；99 (1)：155．16O 6 Treiber D．K．。Williamson J．R．Curr 0pin．Struct．Bio1．。 2001；11(3)：309．314 7 Fang X．，et a1．Biochemistry，2000；39(36)：111O7·11113 8 W ebbA ．E．，W eeks K．M ．Nat．Struct． Bio1．，2001；8(2)： 135．140 9 Swisher J．F．，Pf n，．J． 彳^o1．Bio1．，2002；315(3)：297．31() 1O Misra V．K．，Draper D．E．J． Mo1． Bio1．，2002：317(4)： 5O7．521 11 Nikolcheva T．，W oodson S．A ．J．Mo，．Bio，．，1999；292(3)： 557．567 12 Cao Y．，W oodson S．A RⅣA ，2000；6(9)：1 248．1256 13 Komissarova N．，Kashlev M ．Proc．Natl Acad Scf． ． 1998；95(25)：14699．14704 14 Schroeder R ．，Pf a1． Curr． Opin．Struct． Bio1．。2002：12 (3)：296．300 15 Mo【I I．，Pf n，．踟 ORep．，2003；4(3)：284．289 16 Caprara M．G．，Myers C．A．，Lambowitz A．M J．Mo1．Bi． 0f．，2001；308(2)：165．19O 17 Clodi E．，Semrad K．，Schroeder R．E 彳^B0J．，1999；18(13)： 3776．3782 18 Yanofsky C．J．Bacterio1．，2000；182(1)：1．8 19 Bokinsky G ．，et a1．Proc．Nat1．Acad．Sci． ，2003；100 (16)：9302．9307 20 Liu S．Q．，Liu C．Q．Chinese Science Bulletin，2002；47(5)： 384．389 RNA Folding W ang Chuan．ming①④，Pan Min~，Cao Huai~ ①② Gradua te student，③ Professor，Modern Biology Research Center，Yunnan University，Kunming 650091，China ④ Honghe University，Mengzi 661 1O0，China Key words RNA folding，RNA structure， folding kinetics，ri— bozyme 维普资讯 http://www.cqvip.com