褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性

理化检验 - 化学分册 P TCA ( PAR T B :CH EM. ANAL . ) 2007 年 第 43 卷 10 工作简报 褪色光度法测定羟自由基及 常见食物的抗氧化活性 张　东 , 刘志江 , 高俊杰 , 余 　萍 (沈阳理工大学 环境与化学工程学院 , 沈阳 110168) 摘 　要 : 在用稀硫酸调节至 p H 4 的溶液中 ,生物染色剂玫瑰桃红 R 能被由 Fenton 反应产生的 羟自由基 ( ·O H)氧化而褪色。根据在 520 nm 波长处所测得的吸光度的消褪的程度 (ΔA = A 0 - A 1 ) ,实现了羟自由基存在量的光度测定 ,应用此方法还测定了自由基消除率 ,作为选择清除剂的 判据 ;还测定了几种常见食品的抗氧化活性。从方法的操作和所测得的结果证明该方法具有操作 简单、方便且稳定而经济。 关键词 : 褪色光度法 ; 羟自由基 ; 抗氧化活性 ; 食品 中图分类号 : O657. 3 　　　文献标识码 : A 　　　文章编号 : 100124020 (2007) 1020852203 Color2Fading Photometric Determination of Hydroxyl Free Radical and Anti2Oxidation Activity of Some Common Foodstuff s ZHANG Dong , L IU Zhi2jiang , GAO Jun2jie , YU Ping ( Col lege of Envi ronmental and Chemical Engineering , S heny ang Universit y of S cience and Engineering , S heny ang 110168 , China) Abstract : In a solution of p H 4 adjusted with dil. H2 SO4 , bordeaux red was oxidized and decolorized by hydroxyl f ree radical ( ·O H) produced by the Fenton reaction. By measuring the magnitude of intensity of color2 fading (ΔA = A 0 - A 1 ) at the wavelength of 520 nm , the amount of ·O H present was determined photometrically. The proposed method was also used to determined the anti2oxidation activity and used as a method to choose scavenging agent s according to thair scavenging rates. The scavenging rates or the anti2oxidation activity of some common foodstuff s were determined by this method , which was proved to be quite simple , stable , convenient and economic. Keywords : Color2fading photometry ; Hydroxyl f ree radical ; Anti2oxidation activity ; Foodstuff 　　羟自由基是一种氧化能力很强的自由基 ,生物 体内的羟自由基可使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和 脂肪类发生氧化[123 ] 。对羟自由基的研究在生命科 学、环境和食品科学领域中受到了广泛的重视 ,而测 定羟自由基和筛选抗羟自由基氧化物质是一项重要 内容。目前 ,离体 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 羟自由基方法有电子共振自 旋捕集法 ( ESR) [4 ] 、化学发光法[5 ] 、高效液相色谱 法[6 ] 、荧光法[7 ,8 ] 、电化学法[ 9 ] 等。这些方法有的操 收稿日期 : 2006207216 作者简介 : 张 东 (1974 - ) ,男 ,满族 ,吉林伊通人 ,工程师 ,主要 　从事仪器分析和环境监测工作。 作复杂 ,有的仪器试剂特殊或昂贵 ,使其应用受到了 限制。 分光光度法以其仪器价格低廉、操作简便而被 广泛应用 ,用于羟自由基测定研究已有报道[10212 ] 。 试验发现 :在一定条件下 ,玫瑰桃红 R 能被羟自由 基氧化而褪色 ,而且褪色程度 (ΔA)与羟自由基的量 在一定范围内呈正比关系 ,据此建立了测定羟自由 基的方法。并应用于测定食物水提取液对羟自由基 的清除率。该方法操作简便 ,灵敏度较高 ,稳定性 好 ,可作为一种筛选羟自由基清除剂的方法 ,有较高 的推广应用价值。 ·258· 理化检验 - 化学分册 张 东等 :褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性 1 　方法原理 由玫瑰桃红 R 可以看出 ,生色基 - N = N - 与 两个萘环组成的大共轭体系是生色基团 ,其最大吸 收波长为 520 nm 左右。当加入过氧化氢和 Fe2 + 时 ,过氧化氢和 Fe2 + 发生 Fenton 反应 ,产生羟自由 基 ,羟自由基是一种很强的亲电试剂 ,它进攻玫瑰桃 红 R 的大共轭体系 ,使 - N = N - 和萘酚基之间的 键断裂[13 ] ,大共轭体系受到破坏 ,在 520 nm 波长处 的吸收峰消失。通过测定玫瑰桃红 R 在520 nm波 长处的吸光度的变化 ,可间接测定出羟自由基的生 成量。反应机理如下 : 2 　试验部分 2 . 1 　仪器与试剂 7562MC 紫外2可见分光光度计 ;p HS23C 型酸 度计。 玫瑰桃红 R 溶液 :2. 0 ×10 - 3 mol ·L - 1 ;硫酸溶 液 :0. 1 mol ·L - 1 ;铁 ( Ⅱ) 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液 :0. 01 mol ·L - 1 (现用现配) ;过氧化氢溶液 :0. 05 mol ·L - 1 过氧化 氢配制 ,用 KMnO4 标准溶液标定 ,2～8 ℃冰箱内 保存 ;抗坏血酸、苯甲酸和硫脲溶液的浓度均为 0. 01 mol ·L - 1 。 试剂均为分析纯 ,水为蒸馏水。 2 . 2 　试验方法 2. 2. 1 　羟自由基的测定 取两支 50 mL 比色管 ,加水至 40 mL ,再分别 加入 2. 0 ×10 - 3 mol ·L - 1玫瑰桃红 R 溶液 6. 0 mL , 用 0. 1 mol ·L - 1硫酸调 p H 为 4 后 ,向其中一支比 色管中加入一定量的 Fenton 试剂 (过氧化氢和硫酸 铁溶液) ,另一支不加 Fenton 试剂 ,分别用水稀至刻 度 ,同时摇匀。在室温下反应 20 min ,以水为参比 , 用 0. 5 cm 比色皿 ,在 520 nm 波长处分别测定加与 不加 Fenton 试剂的吸光度 ( A 1 、A 0 ) 和吸光度差值 ΔA = ( A 0 - A 1 ) 。 2. 2. 2 　羟自由基清除率的测定 按 2. 2. 1 步骤操作 ,在调 p H 为 4 后 ,向其中一 支比色管中加入羟自由基清除剂 ,再分别加入等量 的 Fenton 试剂 ,定容 ,摇匀。室温下反应 20 min 后 ,分别测定吸光度 ,加羟自由基清除剂的溶液的吸 光度记为 A 2 。羟自由基清除率 ( F)按下式计算 : F = A2 - A1A0 - A1 ×100 % 2. 2. 3 　食物中水提取物清除羟自由基能力的测定 称取天然食物 10. 00 g , 捣碎 , 加入蒸馏水 100 mL ,匀浆 ,密塞浸泡 4 h 后 ,离心分离 ,移取上 清液 1. 00 mL 测定。 3 　结果与讨论 3 . 1 　吸收光谱曲线 按试验方法 ,分别扫描吸收光谱曲线 ,见图 1。 1. 玫瑰桃红 R 溶液 (Bordeaux2Red) 　2. 1 + 0. 005 mmol Fe2 + 3. 1 + 0. 01 mmol H2O2 4. 1 + 0. 005 mmol Fe2 + + 0. 01 mmol H2O2 5. 1 + 0. 01 mmol Fe2 + + 0. 02 mmol H2O2 6. 0. 01 mmol Fe2 + + 0. 02 mmol H2O2 图 1 　吸收光谱 Fig. 1 　Absorption spect ra 常温下过氧化氢基本不能氧化玫瑰桃红 R 褪 色 ,当加入 Fenton 试剂 ,产生的羟自由基很容易氧 化玫瑰桃红 R 褪色。所有曲线最大吸收波长均在 520 nm 处 ,试验选用 520 nm 作为测定波长。 3 . 2 　酸度的影响 分别用 0. 1 mol ·L - 1硫酸溶液调节不同的 p H 后 ,按试验方法测定吸光度。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 :当体系的起 始 p H 为 4 时 ,ΔA 最大。选用体系的起始 p H 为 4 的硫酸体系。 3. 3 　玫瑰桃红 R溶液用量的选择 试验结果表明 :随着玫瑰桃红 R 溶液用量的增 加 ,ΔA 值增大 ,当用量超过 5. 5 mL 以后 ,ΔA 值不 再增加。试验选用 2. 0 ×10 - 3 mol ·L - 1玫瑰桃红 R 溶液 6. 0 mL 。 ·358· 理化检验 - 化学分册 张 东等 :褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性 3. 4 　过氧化氢和 Fe2 + 对羟自由基测定的干扰 按试验方法 ,调 p H 为 4 后 ,分别加入不同量的 过氧化氢溶液或不同量的 Fe2 + , 室温下反应 20 min ,测定吸光度。结果表明 :0. 05 mol ·L - 1 过 氧化氢溶液 0. 4 mL 以内 ,吸光度不发生变化 ,用量 过多 ,过氧化氢可以把玫瑰桃红 R 氧化。而 Fe2 + 单 独存在时不与玫瑰桃红 R 反应。为了避免过氧化 氢对测定的干扰 ,0. 05 mol ·L - 1过氧化氢溶液用量 应控制在 0. 4 mL 以内。 3. 5 　[ H2 O2 ] / [ Fe2 + ] 摩尔比对羟自由基产量的 影响 取 0. 05 mol ·L - 1过氧化氢溶液 0. 2 mL ,分别 加入不同量的 Fe2 + ,当[ H2 O2 ]/ [ Fe2 + ] (摩尔比) 为 1～3 时 ,羟自由基产率高。 3 . 6 　反应温度与反应时间的影响 取三份 40 mL 蒸馏水 ,分别加入玫瑰桃红 R 溶 液 ,调 p H 为 4 后 ,向其中一份加入过氧化氢溶液 0. 2 mL ;一份加入过氧化氢溶液 0. 2 mL 和 Fe2 + 溶 液 0. 5 mL ;第三份不加。在不同反应温度下反应 , 结果表明 :温度越高 ,反应速度越快 ,但温度超过 60 ℃,过氧化氢与玫瑰桃红 R 反应速度加快 ,干扰 测定 ,室温下 20 min 反应完全。试验选择在室温下 反应 20 min 测定。 3 . 7 　稳定性和精密度 按试验方法 ,反应 20 min 后 ,室温下放置不同 时间 ,ΔA 在 2 h 内保持不变 (未做上限) 。对过氧化 氢初始浓度为 0. 01 mmoL ·L - 1 , [ H2 O2 ]/ [ Fe2 + ] (摩尔比)为 2 的溶液测定 11 次 ,RSD 为 1. 1 %。 3 . 8 　线性范围和检出限 由于在 Fenton 反应中 ,反应物过氧化氢与产物 ·O H 的物质的量比为 1 ∶1 ,因此 ,可用过氧化氢 的浓度与ΔA 值的线性关系表示羟自由基的量与 ΔA 值的线性关系。 回归方程为 :ΔA = - 0 . 016 9 + 1 876 . 666 C ( r = 0. 993 9) ,线性范围为 0. 015 mmol ·L - 1以内。 方法检出限为 5. 734 ×10 - 6 mol ·L - 1 。 4 　羟自由基清除剂的作用 4 . 1 　常用羟自由基清除剂的作用 抗坏血酸、苯甲酸和硫脲都是常用的羟自由基 清除剂[14 ] ,检测此三种物质对羟自由基的清除率以 反证本法有效性 (图 2) 。 用本法检测抗氧化剂清除羟自由基均有明显的 1. 硫脲 ( Thiourea) 　2. 苯甲酸 (Benzoic acid) 3. 抗坏血酸 (Ascorbic acid) 图 2 　抗氧化剂与清除率的量效关系 Fig. 2 　Relationship between antioxidant and scavenging rate 量效关系 ,本方法可用于筛选羟自由基清除剂及其 清除羟自由基机理的研究。 4 . 2 　天然食物对羟自由基的清除作用 按试验方法 ,分别测定了几种常见食物纯水浸 泡提取液对羟自由基的清除率 ,结果见表 1。 表 1 　多种常见食物对羟自由基的清除率的测定值 Tab. 1 　Values of rate of scavenging of 16 kinds of foodstuff s against hydroxyl free radical 食物名称 Name of foodstuff 清除率 Scavenging rate F/ % 食物名称 Name of foodstuff 清除率 Scavenging rate F/ % 花生 20. 7 菠菜 68. 1 核桃 69. 3 番茄 9. 6 黄豆 10. 5 油菜 24. 5 生姜 40. 6 香菜 19. 3 黑芝麻 61. 0 茄子 6. 8 紫皮蒜 42. 0 黄瓜 3. 7 胡萝卜 9. 3 大白菜 3. 5 青椒 6. 2 香菇 8. 6 参考文献 : [1 ] 　Knight J A. 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(下转第 857 页) ·458· 理化检验 - 化学分册 张金平等 :差示火焰光度法测定硼酸盐中钾和钠 表 3 　两种方法测定样品中钾和钠的结果比较 Tab. 3 　Comparison of results of determination of potassium content and sodium content in borate samples by flame photometry ( FP) and atomic absorption spectrometry ( AAS) 样品 Samples 原子吸收光谱法 测定值 Found by AAS ρ/ (mg ·L - 1) 火焰光度法 测定值 Found by FP ρ/ (mg ·L - 1) 相对误差 Relative error / % K Na K Na K Na 1 # 46. 75 48. 50 45. 50 50. 00 - 2. 67 3. 09 2 # 44. 10 31. 90 44. 75 30. 70 1. 47 - 3. 76 3 # 45. 40 35. 40 43. 75 34. 70 - 3. 63 - 1. 98 4 # 45. 90 40. 70 45. 25 41. 70 - 1. 42 2. 46 5 # 42. 20 43. 00 1. 90 误差绝对值 ≤3. 76 % ,由 t 检验和 F 检验[8 ]也可知 , t < t0. 01 ,6 = 3. 143 , F < F0. 01 (3 ,3) = 29. 46 ,表明两种方 法的测定结果也无显著性差异。 表 4 　加标回收试验结果 Tab. 4 　Results of test for recovery by standard addition method 样品 Samples 样品中含量 Content s found in sample 加标量 Am′t of standards added ρ/ (mg ·L - 1) 测定总值 Total am′t s found 回收率 Recovery / % K Na K Na K Na K Na 1 # 45. 50 50. 0 10. 00 75. 0 55. 50 123. 5 100. 0 98. 0 2 # 44. 75 30. 7 10. 00 75. 0 54. 50 105. 0 97. 5 99. 1 3 # 43. 75 34. 7 10. 00 75. 0 54. 00 107. 5 102. 5 97. 1 4 # 45. 25 41. 7 10. 00 75. 0 55. 00 115. 0 97. 5 97. 7 5 # 43. 00 10. 00 53. 00 100. 0 2 . 4 　加标回收试验 分别对钾和钠进行样品加标回收试验 ,测定结 果见表 4。 参考文献 : [1 ] 　曹吉林 ,白 鹏 ,王世昌 . 25 ℃ Na + , K+ / / Cl - , SO2 -4 2 H3BO32H2 O 体系相平衡研究 [ J ] . 海湖盐与化工 , 1998 ,21 (4) :25. 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